Исследование биодеструктивной активности микробных клеток при метаболизме токсичных соединений

Рост промышленного производства, а также использование устаревших оборудования и технологий, в том числе и в нашей стране, приводит к тому, что большое количество сырья, промежуточных и конечных продуктов химической промышленности попадают в сточные воды, а с ними и объекты окружающей среды.

Среди применяемых в настоящее время способов борьбы с загрязнением окружающей среды наиболее перспективными являются методы биологической очистки сточных вод. Под биологической очисткой понимают удаление органических соединений из бытовых и промышленных сточных вод при помощи микроорганизмов, использующих эти вещества в качестве источника углерода. Через серию реакций, катализируемых ферментами подготовительного метаболизма, ксенобиотики включаются в основной метаболизм микробной клетки, где часть углерода, содержащегося в молекулах соединения, идет на синтез биогенных соединений, а часть окисляется до углекислого газа, давая микроорганизмам необходимую энергию.

Общеизвестно, что использование специально выделенных и селекционированных высокоактивных штаммов-деструкторов ксенобиотиков в биологических системах очистки является более эффективным, чем использование активного ила [Ротмистров М.Н., 1975], поскольку использование высокоактивных штаммов-деструкторов позволяет создать компактные, экономически рентабельные локальные очистные сооружения, способные полностью устранять основные загрязнители еще до поступления сточных вод на общие заводские и общегородские очистные сооружения.

Все вышеперечисленное определяет актуальность исследований по разработке микробных методов охраны окружающей среды на основе высокоактивных микроорганизмов-деструкторов различных ксенобиотиков, способных разлагать их без накопления промежуточных продуктов, и по созданию методов оценки биодеструктивной активности микроорганизмов. Традиционно биодеструктивную активность микробных клеток, способных использовать токсичные соединения в качестве источника углерода, определяют по убыли субстрата при культивировании их на средах с единственным источником углерода. В нашей работе мы исследовали биодеструктивную активность микробных клеток при утилизации некоторых токсичных соединений как с помощью традиционных методов, то есть по убыли субстрата, так и с помощью анализа их электрооптических свойств и специфической респираторной активности в отношении данных субстратов.

Целью работы являлось исследование ферментативной активности микробных клеток в процессе метаболизма некоторых ксенобиотиков.

В связи с этим были поставлены следующие задачи исследования:

1. Исследовать амидазную активность микробных клеток в процессе их периодического культивирования на различных субстратах.

2. Развить методологию электрооптического метода для оценки ферментативной активности микробных клеток, обладающих ферментативной системой подготовительного метаболизма акриламида и акриловой кислоты.

3. Изучить изменения электрооптических свойств микробных суспензий, обладающих ферментативной системой подготовительного метаболизма п-нитрофенола, в процессе утилизации данного субстрата.

4. Исследовать возможность определения биодеструктивной активности клеток по отношению к «-нитрофенолу по их респираторной активности.

5. Провести сравнительное исследование специфической респираторной активности клеток и электрооптических свойств микробных суспензий.

Научная новизна работы.

Впервые показана возможность использования электрооптического анализа микробной суспензии для определения ферментативной активности микробных клеток при метаболизме токсичных соединений. Исследована амидазная активность микробных клеток при их культивировании на различных субстратах. Определены условия анализа специфической респираторной активности микробных клеток, обладающих ферментами подготовительного метаболизма «-нитрофенола. Проанализирован респираторный отклик клеток в отношении других ароматических соединений. Построены калибровочные кривые для количественного определения «-нитрофенола по изменению специфической респираторной активности клеток в отношении данного субстрата и по изменению их ЭО свойств. Установлена прямая взаимосвязь изменений ЭО свойств клеток при метаболизме токсичных соединений с активностью ферментов подготовительного метаболизма.

Практическая ценность работы.

Разработанный способ определения ферментативной активности биокатализатора, защищенный патентом Российской федерации № 2 103 366, используется на лабораторных занятиях студентов Кафедры биофизики Высшего Колледжа Прикладных Наук при Саратовском государственном университете с апреля 1998 года. Кроме того, данный способ может быть использован в фармацевтической, микробиологической отраслях промышленности, а также для мониторинга активности микробных биокатализаторов в процессах очистки сточных вод. Полученные результаты могут быть применены для создания нового класса биосенсорных систем. Разработанный способ определения «-нитрофенола с помощью специально подготовленных микробных клеток и кислородного электрода типа Кларка может быть использован для индикации и количественного определения данного соединения в водных растворах.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Использование электрооптического анализа микробной суспензии ВгеуЖаыегшт эр. позволяет оценить ее амидазную активность.

2. Изменение электрооптических свойств микробной суспензии АстеЮ-Ьас1ег са1соасейсит А-122 при метаболизме «-нитрофенола связано с деструктивной активностью данного штамма.

3. Зависимость респираторной активности клеток Acinetobacter calcoaceti-curn А-122 от концентрации «-нитрофенола имеет линейный характер в диапазоне концентраций последнего от 0.1 до 1.0 мМ и может быть использована для количественного определения n-нитрофенола в водных растворах.

4. Сравнительный анализ электрооптических свойств микробных суспензий и их специфической респираторной активности по отношению к изучаемым субстратам показал, что существует зависимость изменений электрооптических свойств микробных суспензий и их специфической респираторной активности от активности ферментов подготовительного метаболизма ксенобиотиков.

Апробация работы.

Материалы диссертации были доложены на Международных симпозиумах и конференциях: Second Workshop on Biosensors and Biological Techniques in Environmental Analysis (Lund, Sweden, 1996) — 8th European Congress on Biotechnology (Budapest, Hungary, 1997) — 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology (San Francisco, California, 1997). Диссертация обсуждена и одобрена на межкафедральной научной конференции (кафедра биохимии и биофизики СГУ, кафедра микробиологии СГУ, лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН, лаборатории биохимии ИБФРМ РАН, лаборатория микробиологической трансформации СНИИ Биокатализа) 9 июня 1998 г.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе получен 1 патент на изобретение.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, 8 глав, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 110 работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста, включающего 34 рисунка, 2 таблицы и 2 фотографии.

ВЫВОДЫ.

1. Изучено изменение амидазной активности клеток Вгеу№ааегшт яр. 13ПА в процессе периодического культивирования на различных субстратах.

2. Разработан метод определения амидазной активности клеток ВгеугЬа^егшт Бр. 13 ПА по изменению электрооптических свойств микробных суспензий.

3. Разработан метод определения биодеструктивной активности клеток Астеи) Ьас1ег сакоасейсит А-122 в отношении «-нитрофенола по изменению электрооптических свойств микробной суспензии в диапазоне частот ориентирующего поля от 10 до 1000 кГц. Установлена принципиальная возможность количественного определения «нитрофенола при концентрации от 0.1 до 1.0 мМ по изменению электрооптических свойств микробных суспензий.

4. Исследована возможность определения биодеструктивной активности микробных клето к штамма Асте^Ьааег сакоасеИсит А-122 в отношении «-нитрофенола по их респираторной активности. Оптимальными условиями анализа респираторной активности клеток являются: рН среды -6.8, температура — 35 °C и концентрация клеток -1.4 г сух. веса / л.

5. Установлена зависимость специфической респираторной активности клеток штамма /cinetobacter сакоасейсит А-122 от концентрации «нитрофенола. Определен линейный характер в диапазоне концентраций «нитрофенола: 0.1 — 1.0 мМ. Показана возможность количественного определения «-нитрофенола в образцах реальных сточных вод по респираторной активности.

6. Проведено сраш. .тельное исследование специфической респираторной активности клето.: АстМоЬаМег сакоасеИсит А-122 и ВгеугЬасЬегшт 8р. 13ПА и их электрооптических свойств. Установлена прямая зависимость изменений электрооптических свойств клеток при метаболизме токсичных соединений от активности ферментов подготовительного метаболизма ксенобиотиков.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Развитие различных областей промышленности приводит к тому, что в сточные воды попадает большое количество высокотоксичных химических соединений. Среди применяемых в настоящее время способов борьбы с загрязнением окружающей среды наиболее перспективными ат? ТТГТТ/ТЛ<�Т *#0"ТА.ТГТ Т ТТ ПТ1ТТ^ЛТ/,/ТТ ТТТГ/^ТТ^ТГ /"Т1АТТТТТ IV Г1/^ТТ Л пТ'*Г/ГГГ'Г"ТТТГ1 лоллхи адл илили! п’ги^лш! и’ал^АЛН^1ито1д оиД, тллриир! апиз*.

— Л Т/ГОПАТТ1.17ТА1ТТТ1Р ЛПГС1ШЛХ1ЙГ1ГНЙ РААТТаийиТДа 12 1ГЯГ1ЙГТИР НРТАиШуГТГС! X, А Ч^А, А Ч^./АА>* * V и-1111 А V VДхIX1VIЛ1Л X/ 1и. А ^ А X/ V XX V X V/ ХХХХХХЛи ^ А «IV рода, удаляют их. из бытовых и промышленных сточных вод в мягких условиях, не тоебуюших больших энергетических затоат и капиталовло.

А X X жений.

Общим недостатком всех аэротенков с использованием активного ила является необходимость его регенерации после процесса очистки, в результате чего снижается эффективность и возникают сбои в работе таких сооружений при изменениях технологии производства. Все это ведет.

Т/* ТТ гт^Г ф*М7ТТТТААТ^Т1ЛТГПГаИ.Г1 та ЛА/5 ТТТТТТ^ЗТТТТ ГТ ТТЛАЛ'/ТПГЯТ" Т Т /Э^ КТ1АТТАТПТТТТЛ к -1 5 НхО 1 ]. /^ дпиIVл^хл^IV!о"Vг^^/К/О jriKjjxkji гчгтла охтт^^т^л-т^ гттттсгмтт. ти н тт и тгп 10 771.

V/ V V/ «V VI11Х/Х V/ ХХЛГХ Ч/ААЧ^А АА АА, А ¦ В |ЛУДл X А-/ <АА» XX Др 1 * 1 У «^ j •.

Отмеченные выше недостатки позволит избежать применение локальных очистных сооружений с использованием специально селекционированных высокоактивных штаммов-деструкторов. В связи с этим представляют интерес исследования по разработке микробных методов охраны окружающей среды на основе высокоактивных микроорганизмов-деструкторов ксенобиотиков, способных разлагать их без накопления промежуточных продуктов, и создание методов оценки биодеструкггпттАтх от/'тт*т"ттал'гт1 1 *т1тг1*1аа"ттзтттто/ат| лтл атгатт аттт г? л^згатгааппл* гг^тпиттАтт.

1 попил ал 1×1УД1,ириир1 апшшив, чупр^Диа^пл^ ипиДС^ 1 р} хч 1 цппиц еЗТГТШЗиАРТТТ *Ш1ГПАЙИ1-.Г?^ЛРТА1Г рПАРАЯииУ мтАТГк^АИС1Т1. ТЛТГРтшиА.

А ХХХ/ХХУ/ V XXX 1"хххх|/ ии Х/1V А^^А V, А их «VII V/ V/ и, А А /1. X X X «•'АА^^Л Х> А А^ X V V/! ХХХХ>Х V V*/ единения в качестве источника углерода, обычно проводят аналогично анализу активности предварительно выделенного фермента, то есть по изменению концентрации субстрата или продукта в ходе ферментативной реакции. Также известно, что процессы ферментативного катализа, протекающие в бактериальной клетке, сопровождаются перераспределением зарядов внутри клетки и, следовательно, могут приводить к изменению ее электрофизических свойств. Регистрация этих изменений может осуществляться с помощью ряда методов: клеточного электрофореза, метода измерения импеданса, электрооптики и др.

В настоящее время электрооптическии метод находит широкое гтпгпюиоинд ппн пдтпдшт пятто мшлппйн/мтлггтд^гтлг <20гг0тг" аттпдягаттаитпт ирит^иуш^ при рч^иис* рлда rl1vvlvflлдлды. а. «^уд, ^ гетерогенности клеточных популяций на основных стадиях культивирования, оценки физиологических характеристик микробных клеток по изменению их электрофизических свойств, оценки структурных изменений клеток при действии на них повреждающих факторов и т. д.

В связи с тем, что электрооптический метод позволяет достаточно эффективно отслеживать изменения электрофизических параметров клет ж. * и шоо. т1тт п тлп ток [широшников л.^х., 1уоо, оунин д.о., 1 у у 1 мы предположили, что существует возможность использования электрооптического метода для.

01тдт'1? ЛапиАитчФнииАЙ ои-ттгеоАЛТЧ! игагпАЙт IV т^ттатту!* Й т"онд/" П>о лЯг,.

I VIVI" 1а1 шл1иг1 с! IV I ииич’С I 1″ шгтрууишл IV,. 1 I у 14, 1/ {1ч екта исследований были выбраны клетки штамма Вте^ЛЬасхвтшт зр. 13ПА, способные осуществлять гидролиз ряда алифатических амидов.

Было показано, что клетки данного штамма способны утилизировать акрила мид в качестве единственного источника углерод"и энергии. В процессе деструкции акриламида образовывалась акриловая кислота и ионы аммония, что свидетельствовало о присутствии в клетках фермента амидазы. Конечный продукт биодеградации акриламида — гидрати-рованныи бикарбонат аммония [Моисеева Т.Н. и др., 1991: Моисеева Т. Н., 1993]. Был определен индуцибельный характер синтеза амидазы и выявлены индукторы: акриламид, ацетамид, пропионамид. Кроме того было показано что штамм ВгещЫгсХегшгп зо, 13ПА можно использовать для количественного определения акриламида и акриловом кислоты по песпиоатооной активности клеток jlgnatov О. V. et al 1997],.

XX X «• > -*.

Для исследования злектрооптических свойств клеток использовали электрооптический анализатор ELBIC, разработанный в ГосНИИ Прикладной Микробиологии (г.Оболенек). Измерительная ячейка анализатора ELBIC устроена таким образом, что позволяет измерять оптическую плотность суспензии клеток в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Внутри ячеики расположены электроды, которые использутлту>а ттттег лАчпоина AtMiPUTrminAiuarA птА^тнирл^АгА пАтга rOivad дЛл tUj^dmiii upiivjuiiipjiuim^i U jjiwuipu iCi/ivul u i iuji/i.

Первоначально клетки, помещенные в измерите льную ячейку, находятся в неориентированном состоянии. Затем под воздействием электрического поля они начинают ориентироваться, что ведет к изменению оптической плотности суспензии. После выключения ориентирующего поля клетки приходят в исходное неориентированное состояние. ЭО измерения проводят одновременно в двух направлениях, и результат представляют в виде разности значений оптической плотности суспензии 6GD, измеренных для двух перпендикулярных направлений, нормированной на значение оптической плотности при хаотической ориентации ток. 1 arfec uduiu iiuaojonu [ujjwi у riv’d t". h, il др<5 • /otjj hu lijivi^p/icмая величина 800 соответствует анизотропии поляризуемости клеток для данной частоты ориентирующего поля. Таким образом, ОС пред.

СТНВЛЯСТ 1,0к>0"1 ЗайИ^мжи". 1 о jjij О! чс>ХхО ¦ гп 1 ир^шщи и !.¦"'л л, и"ЦП1 Т1Э1ПЮ1П|?Ч 1ТТДРТПААТТТГтд№ 110 СОАЙ/ТКО РТГАФАН' 11″.

ПаМн Ю * ЧшЛ VI" л ^ к’ъ-'и д пч с гм/иш < к"и зр. 13 ПА в процессе гидролиза акриламида. Клетки ВтеллЬйс1етшш зрЛЗПА, как мы упоминали ранее, обладают индуцибельным ферментом амидазой, способным гидролизовать свободную амидную связь. Поэтому для проявления амидазной активности микробными клетками было необходимо выращивать их на полноценной среде с акриламидом — в качестве индуктора амидазы. Клетки, выращенные таким образом, инкупировали в деионизованной воде и в деионизованной воде с акрилами-дом, после чего определяли их ОС. Нами было показано, что после инкубации клеток с акриламидом происходит изменение ОС на первых пяти частотах (от 10 до 1000 кГц), в то время как на последних двух частотах изменения были менее выраженными. В качестве контроля амидаз-ной активности использовали метод определения амидазной активности по изменению концентрации субстрата в процессе ферментативного niimAiruoo tfiTaTifri иппотидиачз uo патгшаидоилй fiflo пртпш" ГА"а i ii^vjlaj". ivviC JL ivii. uuii/umvmmii/ uu uvjuiumjniiUti vpvrtv WJ titl^jiiivjj", ямиизтопй я ifTHRHnrTO нр плпанттягги И НУ ОС ТТПИ^О Я н Я 5ТР Т Р НР мта.

M’iUll/^VtUll VJ" V-fc'J. «-Л. Л. Ж Л. Л. W Л. JL Л. V J^AX/El^JlerAAi f ДЛ JLJLJЛ- V/ V/ Л. JL Л. Ж 'Ч^ V*-JL ЛI.J.ЛА V J.9JI дись.

При проведении исследований ЭО свойств клеток принципиально важным является контроль за неспецифическими изменениями их ОС, связанными с воздействием изучаемого соединения, в данном случае акридам ида, на микробные клетки. Поэтому в качестве независимого контроля исследовали влияние акриламида на ОС бактериальной кулыуры.

W W I ^ «представителя ассоциативной почвенной микрофлоры — Azospiriitum hi/нч'лисд СП 7 UO f>nAI>AhUAIJ imiTTUOTmABqTL OVIHITIOVIMTI RUTIA nAVOOQUA.

1S! ti. jiiv /, UV ViiWMUlii/J'l V t I lvlfljl I ci f I" (Д IV 11 v i ti! VI «IУ i,. JL/ШЛУ 1 1 IV ti lili IV/ что акр ила м ид не оказывает влияния на ОС данной клеточной суспензии.

Известно, что адсорбция различных высоко или низкомолекулярных соединений на клеточной поверхности приводит к изменению злек-трооптического сигнала [Фомченков В.М. и др., 1983]. Поэтому в качестве контроля за сорбцией акриламида на поверхности клеток использовали клетки ВгепЪасХепигп ьрЛЗПА, обладающие амидазной активностью, которые затем обрабатывали этиловым спиртом {96-%) в течение.

5а «¡-"таги ПА/>770 ПАРА АППДТТАТТЯТП} а{ ' ппп тю1. чгЬ<�лпт О ТГАИАННЭАОЧИПАЙ ПА, 1ИН11, ЛЪГ^.^ -XVI V ^ V. ирн и Д^п^иимишшул ни де и в деионизованной воде с акриламидом. Было установлено, что актждамиут не оказывал влияния на ОС полученной суспензии.

Полученные данные позволили нам предположить, что изменения ОС Brevibacterium sp. 13 ПА связаны с ферментативной активностью данного штамма по отношению к акриламиду.

Поэтому нами изучалась динамика изменения активности клеток от у * Г— ^ А / /- У’Л ЛЛ Ч, А времени инкуоации с суостратом из, зи, 4з, ou, vu мин>. Активность клеток в отношении акриламида оценивали по разности значений SOD для клеток, проинкубированных в деионизованной воде, и 80D для клеток, проинкубированных в деионизованной воде с субстратом, при частоте ориентирующего электрического поля 502 кГц. Было показано, что при увеличении периода инкубации с субстратом активность клеток в отно.

TTIQTTTITI OT/"VTITT01#TITTO TTTITTUTITTri Г> О ОТ f I AOTAl/i/ r"rn/>UV ГТ АЛ ma m ГГЛ'* *T, TV ш^тш алрпламнДа лпп^нпи Dujpawiawi, пилим}1 DU D^WA «К^Л^Д^Л/ЩНЛ ^тггпйпм*!йитс! Y мгпля^^пи^ттт/г ЧП iSUtii1.

Vjpjini Vli U^/1 XiVXlVJll/sJVWtWlH S millier jlhw V/Xi^/ V/i/ttl, л i V".

Таким образом, полученные экспериментальные данные свидетельствуют о специфическом изменении ЭО свойств микробных клеток штамма Brevibacterium sp. 13ПА, обладающих активной амидазой.

Известно, что амидазная активность широко распространена среди бактерий и не является специфичной для какой-либо группы [A. Arnaud, 1976]. Известно, что клетки штамма Brevibacterium sp. R312 продуцировали амидазу с широким субстратным спектром [Maestrassi M. et al.,.

1 UQ Al 1ТП TJ’l f fi ЛОТ^ТТЛТГ rrrtOW/VTOnTTiTunP TITITat^u^ TT^ATT0Trri50TTria Olirr.

1/ оr j. пилима, па паш ЬлдлД, rlnivjjtv глилДиоапп^ amrlтготоАм avTiimjnrni ПА и^шйнйтжл «чА гвпйми ндаплЯипй r-ivnini'iMW п tli/i 1 I’Л lilt 1 II I-' I I 'V I II 111/ Ill. liui 1V1 11 111' VV V^ VLH1I1V 1 li: „1 I 1П|/1'1.'1 II -11 v^i WllViiallll I> присутствии других амидов в реакционной смеси. Было показано, что клетки проявляли амидазную активность в отношении акриламида. бу-тирамида, ацетамида, пропионамида, бензамида в следствии чего и менялись ОС. Отсутствие изменений ОС в случае с никотинамидом объясняется отсутствием сродства фермента к данному соединению. Эти результаты соответствовали ранее полученным данным по изучению субстратной специфичности амидазной активности клеток Brevibdcteriwn sp. тт^“»", 1 ITT, А ГМлгтлоопл Т U 1U011 шхамм «лю рУлuni-vwDo i. n,.

Таким образом было установлено, что при гидролизе акриламида клетками Brevibacterium sp. 13ПА происходит изменение ЭО свойств этих клеток в диапазоне частот ориентирующего поля от 10 до 1000 кГц. Эти изменения коррелируют с изменением амидазной активности клеток и не связаны с неспецифическим воздействием акриламида на микробные клетки.

Следующим этапом нашей работы было изучение динамики проявттаиия i’itutiiihiii Wi/!itth/)/>ffli'"f"M cri ошиттощлй OI/т^^pчA'v',^^ о тте" vUvIIM/l JVvI х ivc («1 ISl t Г м/ил il! tilt /1 WJIIll^UJIIl/ii (XIX I XX iIIIV/V X n u tlJ/VI^VVVb iiV» иодического культивирования на различных субстратах. Известно, что в процессе периодического культивирования происходит изменение ферментативной активности клеток, связанное с изменением концентрации субстрата, накоплением продуктов метаболизма и другими факторами.

Механизм ферментативного гидролиза амидов до карбоновых кислот был предложен на основании кинетических исследований данной реакции, проведенных с использованием ацетамида и амидазы Brcvibacf/rriinvt PTi 1? 1 ГЭ Г1/iоac.

IV/ i W I? .1 y, I^XTlUWUUVVi in. Vt U1 ¦ - i/yvji.

Было показано, что в процессе ферментативного гидролиза акриламида клетками Brevibacterium sp, 13ПА образуется соответствующая амиду акриловая кислота и ионы аммония [Моисеева Т.Н. 19 921. Первоначально мы исследовали динамику проявления клетками амидазной активности в процессе их периодического культивирования на минеральной среде с акриламидохм в качестве единственного источника углерода. А мидашую активность клеток в процессе метаболизма акриламида определяли по изменению ЭО свойств клеток при частоте ориентигаплшагл плгго SAO v I тт и тпоmjimAuuiш ««отпили па тюноиаишА iiau. ijj iv.' II i v^i i IV-xyi ^u^ iv i ц 11 j X^I x ix i V' (i i I i>i ivi шСхуДущ им j: iji*xvxxvxxixxv xwxx центрации субстрата в процессе микробного гидролиза акридамида до акриловой кислоты. При сравнении результатов определения активности клеток в отношении акриламида по изменению ЭО свойств и традиционным методом было зарегистрировано снижение амидазной активности клеток в процессе культивирования. Снижение амидазной активности может быть связано с постепенным накоплением в среде ионов акриловой кислоты, которые ингибируют амидазу, как было показано ранее для клеток штамма Brevibacterium sp. R312 [Maestracci et al., 1984, t nom l^boj.

Метаболическии путь акриловои кислоты в аэробных бактериях иэттотг/ч? u.

Zljy -1UV1W1 11U «JiVllVUA A ¡-rjiuijj/ш «НИН lllUl Will *. W Ul,.

1990]. Были идентифицированы промежуточные продукты биодеградации акриловой кислоты — молочная и уксусная кислоты..

Поскольку процессы гидролиза акрияамила и метаболизма акриловой кислоты протекают в клетке одновременно, изменение ЭО свойств клеток могло быть связано, в принципе, как с изменением амидазной активности, так и с изменением активности ферментов, принимающих участие в дальнейшем метаболизме акриловой кислоты. Поэтому нам пред-f ставлялось необходимым проведение специального эксперимента, поолттятллгот’гл nottrattiiti ith ттоо гтлтталло l"v/il/llv/iiibl i.4i j/jv^lf 1 11″ ^ 1(1 дои upvuvvvw..

Для этого клетки культивировали на минеральной среде с акриловой кислотой} используемой в качестве единственного источника углерода. Изменение амидазной активности клеток в процессе культивирования регистрировали традиционным методом по реакции трансформации акриламида в акриловую кислоту и по изменению ЭО свойств клеток. По данным ГЖХ анализа pi ЭО анализа клетки обладали некоторой амидазной активностью, которая практически не менялась в течение 48 часов культивирования. По-видимому, присутствие акриловои кислоты в среде культивирования в качестве единственного источника углерода практически полностью ингибирует амидазную активность клеток..

На следующем этапе работы исследовали изменение амидазной активности клеток пои культивировании их на минеральной соеде, не содержащей каких-либо источников углерода, С помощью традиционного анализа амидазной активности и по изменению ЭО свойств клеток было показано, что максимальной амидазной активностью клетки обладали на начальном этапе культивирования, а затем наблюдалось падение активности в отношении акрила мида. Вероятно, падение амидазной активности связано с отсутствием субстрата в среде культивирования..

Таким образом, были выявлены характерные изменения ЭО пара.

ЧДТПАО «*Г"ПАЙ11АЙ М’лпдичпи Г» ЧОВТКЧГ'/АЛТИ АТ о т* тто ОТТАЙ аь-тттиА^тн v 1 и ^ > (iv! 1) пт1 и к/лам^ди^нуи х пи i i и клеток при их культивировании в различных условиях..

Мы предполагаем, что аналогичные изменения ЭО свойств, связанные с конформационно-структурными изменениями молекул и перераспределением зарядов в процессе метаболизма, могут иметь место при метаболизме других субстратов в клетках других микробных штаммов..

Для проверки этого предположения в качестве объекта исследований были выбраны клетки А. сшсоасейсит А-122, обладающие фермен-1 ативнои системой подготовительного метаболизма и-нихроц^енола. ьыгга памюца тгта лпалакии ^гтишюттапч'гг и-интоллаиатт о рона.

Л1> лч’лилш!/. ни АЛ^ШИ ^иим/иаш 'у и хрифуиид и ди’тС" стве единственного источника углерода и энергии. В процессе деструкции «-нитрофенола образовывался 4-нитропирокатехин, океигидрохи-нон и происходило накопление нитрит ионов в культуральной среде. Был определен индуцибельный характер синтеза ферментов подготовительного метаболизма «-нитрофенола [Сингирцев И.Н., 1996]..

Как и в случае с ВгелчЪаШпит 8р.13ПА, клетки выращивали на полноценной питательной среде и на полноценной питательной среде с п-нитрофенолом в качестве индуктора и определяли ОС полученных суспензии при инкубации клеток в дсионизованнои воде и в дсионизованалй оатгд гп. ит1ФГ>АЛ1АиАттА"1 МоийиАинд ' Ьчттл О ^ АГI тлтп и П, А О О и/" .

11V11 XX*.//Х.-> Ь- 11 11*1 11/и^^хтилиш. «I.' VI V» I I 11 ХХ~ «. X V/ jAMiJt-X XXX? д. I * I I X *|X VX XXСХI IX/ только для клеток, выращенных на питательной среде с /¿—нитрофенолом в качестве индуктора, причем изменение ОС происходили на первых пяти частотах (от 10 до 1 ООО кГц), в то время как на последних двух частотах изменения отсутствовали..

Осуществляли контроль за неспецифическим изменением ОС микробных клеток под воздействием исследуемого соединения. В качестве контрольного объекта мы использовали клетки Вгелчоашпит зр, Было показано, что я-нитрофенол не оказывал влияния на ЭО характеристики.

CZ J. «¦* л клеток, не оиладающих ферментативной системой метаиолизма пшттплАЗНА ТТО i pvlj/VilVJi»..

Таким образом, можно предположить, что изменение ЭО свойств суспензий зависит от способности микроорганизмов утилизировать п-нитрофенол. Поэтому на следующем этапе работы нами изучалась активность клеток A. calcoaceticum А-122 в процессе периодического культивирования на жидкой солевой среде с w-нитрофенолом в качестве единственного источника углерода. ЭО анализ проводили при инкубации клеток в деионизованной воде и в деионизованной воде с п-нитрофенолом..

Было показано, что активность клеток в отношении /мштрофенола возрастала по мере его деструкции и достигла максимального значения через 6−8 часов после начала эксперимента, когда субстрат в среде культивирования отсутствовал. Это можно объяснить тем, что при культивировании клеток на минеральной среде с единственным источником углерода — «-нитрофенолом — микроорганизмы вынуждены синтезировать и поддерживать в активном состоянии специальную систему ферментов подготовительного метаболизма данного субстрата. При дальнейшем инкубировании клеток ЭО активность в отношении «-нитрофенола снижалась. Полученные данные хорошо согласуются с представлениями об экономности клеточного метаболизма. Известно, что ферменты, участвующие в утилизации субстрата и включении продуктов его распада в промежуточный обмен, синтезируются лишь в тех случаях, когда данный субстрат имеется в питательной среде. По мере утилизации субстрата происходит накопление промежуточных продуктов, которые в свою.

Л. Л * ж л л. очередь осуществляют регуляцию биосинтеза и активности ферментов по принципу катаболитной репрессии..

Далее мы исследовали зависимость изменения ЭО свойств клеток от концентрации субстрата. Клетки инкубировались с различными конценхрсщпЯлдо су uwipaia i, v." *-, и. и, и. о, i .и м fvjJ. лЗмснспий j^j ларалiерметтхтл iiinmannraiiiniiati ппанлуатпипт ппатдпяпдлтодшта uro rranonv пяти.

V, i м iv: Vi mi/v.n.-pi tili"! ->-VIV/I> I ipvin t-Wiilfi^ii I i I |./vu — *iv 1 L iv Vv 1 I > I it IV/ I id uvpixutA t I/I l и частотах ориентирующего поля от 10 до 1000 кГц. Кроме того, можно отметить, что на частотах 10 — 1000 кГц существует определенная зависимость величины ЭО эффекта от концентрации субстрата, участвующего в ферментативной реакции. Минимально детектируемая концентрация «-нитрофенола составляет 0.1 мМ, диапазон линейной зависимости 5QD от концентрации //-нитрофенола — 0.1 — 1 мМ..

Микробный метаболизм «-нитрофенола ранее был изучен на примере клеток штаммов Arthrobacter sp. [Jain R.K. et al., 1994] и Moraxella sp. [Spain LG., Gibson D.T., 1991; Spain 1С et al.1979]. Было показано, что начальные ферментативные реакции у данных штаммов различны. Так для Moraxella sp. характерно пиридиннуклеотид-зависимое окисление субvrnoto ivr?%vrra*ffiyryvtytramftt*# алпап^wттатгтулж/ о о „-“ ч-ино т* пгтттл гтт. глтттт1 туаттлп v l Ija Lci vu 11 ^aitv/mw/1рнч^лпм uwduuuiiv^wnntm aouia о dhav па ij/ni-nunuo и anr^q'jadciijrialkf ptj тгп a vtiuauo тартго ттттсг Л с» tq Л Л^litta ii v/uuuaui^uitiivi*! 1 11Д|/иЛ*1ИиПи. JL til Ди 1VUIV Д^Ш J. It t t it Wi/UH-L-/ ишш лгтгяъятдг% uta rr^rmtatt rmr* плп^т тгнгттритта «-.иитпларилття — zlнитропирокатехин, который в дальнейшем подвергался ф"ерментатив-ным превращениям с образованием оксигидрохинона, В нашем случае метаболизм осуществляется через 4-нитропирокатехин аналогично клеткам Arthrobacter sp. [Сингирцев И.Н., 1996]. К сожалению, в настоящий момент мы не можем точно определить этап ферментативного катализа «-нитрофенола, который наиболее сильно влияет на изменение ЭО характеристик микробной суспензии. Тем не менее, полученные данные могут оыть использованы для оценки ферментативной активности штамма-деструктора и, возможно, для определения концентрации п-нитрофенола в растворе..

В настоящее время одним из ключевых вопросов при исследовании электрофизических свойств клеток в процессе метаболизма субстрата является проблема интерпретации полученных данных. Трудность заключается, прежде всего, в том, что при метаболизме одновременно.

ГГПАНЛУАТОТ ПОТТТШгаЧА гтлгголпи ^ОМ'ТПга ТЮ Ь’АТАт!^ МАМ’ОТ СПАЛИТ! Ирунулид/И лид^ЦШН ги Я11/ЛИ/1 илл/^н 1- Ь свой вклад в изменение электрофизических свойств клетки. Такими процессами могут быть, с одной стороны, неспецифические воздействия химического соединения на клетку, приводящие к его сорбции на клеточной поверхности, повреждению мембраны, ингибированию ферментативных процессов в клетке так и, с другой стороны, метаболизм исследуемого соединения клеточными ферментативными комплексами. Поэтому, с нашей точки зрения, принципиально важно было найти зависимость изменении ЭО свойств микроорганизмов от их метаболической.

1г" птз11А/" гн I ¡-пятни пА^-ооатот ^ш"ал>гвА15оитгя ТОВ-АН.

С1IV I ГПЛШ^ I II. /Л^^УС^ -Ш 1 I Vу 11 ^^ 1 V/111 !1 I1 * Г л V. I I ¦ М V./ V I *1 является корреляция специфической активности ферментативных систем с изменениями 30 свойств клеток. Поскольку в процессе метаболизма ряда токсичных соединений происходят реакции окисления, это привело нас к идее использования сравнительного исследования специфической респираторной активности клеток в отношении определенного субстрата и ЭО активности клеток по отношению к тому же соединению. Поэтому, поскольку метаболизм я-нитрофенола клетками А. ссисоасен-сит пчдл происходит б аэробных условиях, мы предположили, ч 1 о сутв/" то*1!"г 13А')"<�АЧ<�Т1А/,'Г1 Атт1 чАооиня АГА МАТАТТО 15 1ЛО,.

III I и у I ом^шулшм^Аи «1 11 I и-1 11I IС (11 V/ :"1 11/11 I IV 1 V./ -«1 I V//I и ли честве альтернативного способа определения ферментативной активности..

Известно, что для определения активности ферментов каждого определенного вида организма нужны специальные условия, поскольку от вида к виду могут сильно различаться потребности микроорганизмов в ионах и кофакторах, оптимумы рН и температуры, чувствительность к ингибиторам и т. д. Поэтому нами были оптимизированы условия проведения анализа CPA клеток: температура, рН среды и микробная нагрузка. Оптимальные условия анализа респираторной активности: конпзитпатга ^ттатА!' I /I г nxiv вол о / rr* Аал/ЬотпиЙ hirAon, А А I n Mi К.

1 I. V I i 1 l./til 1,1 1 IV — 1W 1 /lV I, Г 1 VJA, JJWW / Jt. V/VVW (t 1 I 1UIII VJ^iVp V#V i. * 1 I U"Uj.

TPМПРПЯТЛ/ПЯ.

Л VifJlAAV^/V^Jl^ J^/ bf ь/ W V/ •.

Далее мы исследовали зависимость CPA клеток от времени их культивирования на минеральной среде с я-нитрофенолом и, было показано, что максимальной CPA в отношении «-нитрофенола обладают клетки А. calcoaceticum А-122, полностью утилизировавшие «-нитрофенол..

Используя оптимальные условия анализа респираторной активно /-ПТЧ 4 стм, нами оыла построена концентрационная зависимость клеток в отношении л-нитрофенола в диапазоне концентрации последнего 0,1−3.

ЧД Ч<�юил11"1А/>тг 11"1йттс1 пниайиий т> тгатопиотта, А 1 I, А иМ т".

VUUilVil J"1 W1Ъ JJt >1 Vi^{IflilvililiiiiJ} AU|/UiV I V|/ li lllll Vj i j Vi l f в 11 может быть использована в качестве калибровочной кривой при количественном определении «-нитрофенола..

Таким образом мы показали, что существует зависимость респираторной активности клеток A. calcoaceticum А-122 от концентрации п-нитрофенола, которая в диапазоне концентраций «-нитрофенола от 0.1 мМ до 1 мМ носит линейный характер. Кроме того, как мы упоминали ранее, предварительная инкубация клеток A. calcoaceticum А-122 с п.

ТТТТП rv? ЧТТ тт ГУ i г /О 1 1 Ж" 1 «Г^ ТГГЧ г*. TTTiiTi Т.* ТГГ> г лттаттттпг» jr Г" ТГ П' 1ЧЧ tin 1 i м ivi. — i Mivi/ иривс.'Дг1х К шмсишням skj свиисТВ.

ЛШ" ПАЙиАЙ Al? i"nSlJi)7JTI ПпИТТЙ" Т> rnJOniirtAUfl II 1 lilii I Л лМ Ч015Н/>ТИ|А/^Г1 iHimbwiiVH viivxijriri. ixpii-ivm, и^mujjwjvuv V. I ми" ~ «, v> :"nri juuuvJfiMvviU.

X i li AT T^AltrTArrmO ГТТГГГ H ill Ilt/>fil/1f ТЛЮ ГГЛ^ГГТ тттгттайтп гй I' о.

UV/t/ «и»! пинц^и 1|/иЦГШ /t" M"l I pV"]7Cll"/JACt i<" «V/lW HUVtll JlfhlViUlOl г» A<]|yul ivp..

YATO Л.'РТАПНП AnnPTTPTIPUHO ПйтНПЯТАПИАН артМВЦАЛТМ VIIATA’E' ТД T. iV i V4' i/1 j v^lumi/Jt v,'x ¦ j^WiviUI/i i/v^iiii j-/u i I.) l/iivi si ciiv 111Liti vf ^ [ ri IWivjt xx 11Л свойств чрезвычайно отличаются, прежде всего, по составу среды, в которой находятся клетки при метаболизме субстрата, линейные диапазоны зависимости респираторной активности клеток по отношению к «нитрофенолу и зависимости величины SOD клеток при 502 кГц от концентрации «-нитрофенола чрезвычайно похожи. С нашей точки зрения, полученные данные свидетельствуют о том, что изменение ЭО свойств клеток A. calcoaceticum А-122 связано с активностью ферментативной системы подготовительного метаболизма «-нитрофенола.

Кроме того была показана возможность количественного определе.

ТТП TJ /" Ч TT TT TV n лгпт> /-f v T7i~4 ODA TTTTonrvw Л ЛИЛ1 iliM пгаЯ fi-nriхss о/Дг1.шл jav10 u pал iiu win ajiwiuj ух, lшсuulсiIItiffi.

A. i R Г" О iT^TT П ПТЛ рй TTPVTMD U Ar"TL АППРТТЙТТЙШ. ТСГ DAiTTPPTDQ T> *fTJA.rA i. A i VLI/UIi V iVitl) I1V VVViViV 1 V i. L> WXipi/ДVJlVliii/I UVUJ^V IL/CI iJ IWIiCi V компонентном растворе является важной характеристикой любого способа анализа, нами изучался респираторный отклик клеток в отношении различных ароматических соединений. Нами показано, что микробные клетки проявляют CPA в отношении фенола, «-хлорфенола, бензойной кислоты и бензамида. В отношении гидрохинона, м-нитрофенола, 2,4-динитрофенола, л-метоксифенола, сульфаниловой кислоты и никотинамида клетки практически CPA не обладали, вероятно ry гяпгит^г» тг"т а*^ % ггаттт^гч т> t-rrv ту патл п гута тут гтл г^ гч «^ гч rrrri * гл ггл тттгг /л мэ-jct uitjuioiw фс-j/iw^rixt/ö- 1ШД1 u’uof! i wionw y ivi u «а и uj t ru M a даппшл tu-йттиийцнй.

На следующем этапе работы нами был проведен анализ образца реальных сточных вод производства «Химпром» (г. Волгоград). По данным спектрофотометрического анализа концентрация «-нитрофенола в пробе сточной воды составляла 11.5 мМ. Анализ CPA клеток по отношению к сточной воде проводили в оптимальных условиях, концентрацию «-нитрофенола рассчитывали по предварительно построенной калибровочной кривой, учитывая разбавление анализируемого образца. iттгггчтi пл ttu у~ч щ i tvaттаттаугттг> ут тт/>"ггчтттт rrt ivurm, Cri i г t — пг! ip ф w мл.'j i, а о ничпий oUij.^, см i wv-j i wttiiaJs с ииМОщвги грд т.'hataf гллтаттотта о s i 1 vi л/f иптщрпииа гчрчитг^гато уаплша.

WA u 1X.1V. IV/IV. VV/VtU^Jt/UlU 1 miTJt. JLJLT-fJXy J. VI 111 U1VI/v.'* 1 It 1 LXI J V V V/ 1-LI V коррелировали с данными спектрофотометрического анализа и, вероятномогут быть положены в основу разработки микробной биосенсорной системы для определения содержания «-нитрофенола в водных растворах. Такая биосенсорная система может найти применение в анализе промышленных сточных вод и в экологическом мониторинге..

На наш взгляд, представляет интерес сравнительное изучение специфической респираторной активности клеток в отношении п-нитрофенола и их ЭО свойств при воздействии различных факторов..

НорДЛТИА ТТТУЛ HAUL I IIOTQ TIHAD 11АГ1? Т ПЧ/>Т1ПТОФ1 D ПА7ТП Г. ШП.тНТАПАП IlJDVVIllV- «AAV/ П V’i 111U V1 «JJJ1VU iVtvl V I l-> lil v. 1 > t 1it t IJ j/V.'.- IH mil iiVfllUpMU ферментов. Поэтому мы изучали их влияние и на CPA и на ЭО свойства клеток А. calcoaceticum А-122, Сравнивая данные, полученные с помощью ЭО анализа и с помощью респираторной активности, можно отметить их корреляцию. То есть минимальная активность клеток в отношении «-нитрофенола наблюдалась после инкубации клеток с солями меди, кобальта и магния. Это может быть связано как с ингибированием ферментативной системы подготовительного метаболизма «-нитрофенола, так и с токсичным воздействием солеи этих металлов на клетку в целом..

W нова/^ЦА ята латп" лапп иототкпАТ Kutii anutia™А1*1ЛТО" mnYnnqoiio it iv iwuvvliiv, x1w vvjifl mv^l 11 v 111 иiv/ 1 v ci u1jv! ч 11л v v0v*ivlu" i 1.11 i v / i iv ici limi татчтпп мршйпяи тг nptav пачпнннАгп nnniirfYAWnPuHa гмпяилп A H i н ail i vm 11 .t in viMVjk/идх iij t v i v/iv j/vti.-ii i * * i V/ i v/ ni’iJiiv-'tvi m/1 I^x IIJIU H’l' 1 i.. 11 др., 1985; Лебедев B.C., i 986]. При этом клетки теряют значительную часть внутриклеточного калия [Лебедев B.C. и др., 1987] и происходит перераспределение протонов между цитоплазмой и окружающей клетку средой [Лебедев B.C., 1986], а также уменьшение трансмембранного потенциала клеток [Лебедев B.C. и др., 1987], Присутствие солей железа, никеля и цинка не оказывало значительного влияния ни на CPA клеток в отношении субстрата, ни на ЭО свойства микробной суспензии..

Нами изучалось влияние ПАВ на активность клеток в отношении п-нитрофенола. Как и в случае с солями тяжелых металлов, изучали влияние ПАВ и на CPA клеток и на их ЭО свойства. Предварительная инку.

IX,————-~ пс £1л т> t—-1 ~ «п л г» u ", 1—-1 гчо 1 л иации JUIOlOl^ С iXIIUUUKlC ! и, IXJIUUUIClC -/IV, IVilUUUCCl! t^o-iv концентрация ПАВ составляла 1мМ) полностью ингибироваяа CPA клеток в отношении субстрата, кроме того, не были зарегистрированы изменения ЭО свойств клеток в отношении «-нитрофенола, Это может быть связано как с ингибирующим воздействием данных веществ на ферментативную активность клеток, так и с повреждением клеточной поверхности. Известно, что ПАВ хорошо адсорбируются на клеточной поверхности, при этом происходит расширение пор клеточной стенки.

Г1Г1 rviIA at oi I ОЙ 11 I I/ллтта о7тллпЯ" 1™ п ппацтл’цппооия om/Tnt ггл"тгл [^ivninn и ii, vi tn, tyOij. iiuwiv «Д^^рицоы m lii/Viuiiviivuviiii/l uiij t-jju livbuvтой клеточной стенки, ПАВ взаимодействуют с дипоподипротеидными комплексами, включая реакции с гидрофобными участками белков и ориентированных липидов [Helenius A., Simons К., 1975]..

Мы предположили, что взаимосвязь изменений ЭО свойств микроорганизмов и их CPA в отношении субстрата характерна и для других штаммов, обладающих ферментативной системой подготовительного метаболизма токсичных соединений. Для проверки этого предположения мы использовали клетки штамма Brevibacierium sp, 13 ПА, обладаю.

УТТТГА Т""т ТГТ ТТТТУ^ЛГТТ ГТ" Т-Ж Ж ГАТТ.-Т'/Ч* «TT? ТГГ» Г% TT ТТл ТГ TT-T>f*% П-ТЯ «rtTTI t* i ТТЛТТТТТ T*f щи*.- rirtAl’v цш^слвпш-vi ф'.рйкп i kjivi амвдаЗии. ни лшa iу рnмvi дйппмм.

ЛТОиЛОПАиП ПТА Гл л*т? ттоог* АтПЯАГТП НОТЛШНА ГТИТПАТПП, а ПП/ЬОТИПАПСИV V I ClllV/ll^fWlIV/, i 1 V CliVi t Ii iu.Hil. V/Vyii^VVtliJl/lA/lJLIilV 1 I Ij / J i * I. J tt^li iUitl 111 lU^ariil амидов, содержат сульфгидрильную группу в реакционном центре [Maestracci М. et al., 1986]. Также известно, что ионы меди и кобальта оказывают ингибирующсе воздействие на ферменты, имеющие сульфгидрильную группу в активном центре. Поэтому мы изучали влияние солей меди и кобальта на амидазную активность клеток Brevibacterium sp. 13 ПА с помощью ЭО анализа и с помощью CPA. Сравнивая полученные результаты можно отметить их корреляцию. С помощью двух независимых методов было показано, что соли меди и кобальта ингибируют амидазную активность клеток Вт в v i Ъас te v i um sp. 13 ПА в отношении ак.

MlTTO U itT ТТО jj>*i jiciiyin^a.

Как и в случае с клешами A. calcoaceticum А-122, изучали влияние ПАВ на CPA клеток Brevibacterhm sp, 13 ПА в отношении акриламида и на их ЭО свойства. Предварительная инкубация клеток с Rhodofac RE-610, Rhodofac -710, Rhodoca! DS-10 (концентрация ПАВ составляла 1мМ) полностью ингибировала CPA клеток в отношении субстрата, кроме того, были зарегистрированы незначительные изменения ЭО свойств клеток в отношении акриламида. Это может быть связано как с ингибирующим воздействием данных веществ на ферментативную ак.

ТИВиАЛФ! VnPTAV IMJl/1 И П ПАТ}"й1"'ТТа1™(>111 liTTATAtllIAW TTADOTiVIIAmni iirjlUllUVlu IVJIVXVIV, IUXV 1 1 v 1 1 V / i J | / V. /iVy IV. I 1 «1 V. Vi UV’IiVi-, I t «1 ..

Таким образом, на основании данных сравнительного анализа специфической респираторной активности клеток в отношении определяемого субстрата и ЭО свойств клеток при их инкубировании с тем же субстратом нами установлена взаимосвязь изменений ЭО свойств клеток с активными ферментативными системами подготовительного метаболизма микроорганизмов-деструкторов. Эти результаты свидетельствуют о принципиальной возможности использования ЭО свойств микрооргаНИЗМОВ ДЛЯ ОЦСНКИ ИХ иИОДСС-i pv’KiЯВКОЙ активности И, COOTBCTCidCHHO, a da4"iawiia^t4i faojioutio liadali т! ппи «iatahad нпо aiiauvij (bi"r>"fplitq. V i uwjmo/miu v i ii vuj^Ltium jiv/ixv/ti i i /V 11 i i .У1Ч. x /jk/tj Длл v/itviiivti i|/v|/IViviiiu тивной активности микробных клеток в мелом..