Катаболизм нитрильных соединений у Rhodococcus rhodochrous: Генетический контроль, механизмы регуляции и промышленное использование

В основе современных методов получения разнообразных синтетических соединений лежат каталитические процессы, которые, как правило, проводят при высоких температурах и давлении в присутствии сложных гетерогенных катализаторов. Использование в качестве катализаторов клеток микроорганизмов или их ферментов позволяет осуществить такие процессы при мягких условиях (низкие температуры, нейтральная водная среда) с высокой селективностью и специфичностью. В отличие от традиционных катализаторов, биокатализаторы способны также осуществлять стереоселективные и регеоселективные реакции. Таким образом, биокаталитические процессы формируют новый облик химии, основанной на энергосберегающих, безотходных и экологически безопасных технологиях. Однако, в современной химической индустрии использование биокатализа все еще ограничено. Во многих случаях биокаталитические процессы неспособны конкурировать с традиционными технологиями по уровню себестоимости продукта. Большой прогресс в области изучения структуры и функций ферментов, массовое секвенирование геномов бактерий, успехи метаболической инженерии, исследование микробного биоразнообразия, развитие новых методов направленной эволюции позволяют надеятся, что биотехнологии все шире будут внедрятся в химическую промышленность, способствуя становлению новой отрасли-«зеленой химии».

Идеи о возможности использования в качестве биокатализаторов ферментов (нитрилгидратаз и нитрилаз), участвующих в метаболизме нитрилов, бьши высказаны уже в первых работах, посвященных изучению нитрилутилизирующих бактерий (в начале 70 годов). Первой реализовала эту идею компания Нитто (Япония), создав производство акриламида, основанное на биокатализе. В качестве биокатализаторов были использованы бактериальные штаммыCorynebacterium (Rhodococcus) sp. N-774 и Pseudomonas chlor or aphis В-23, обладающие нитрилгидратазной активностью (Watanabe et al., 1987; Asano et al., 1982). Несмотря на значительные преимущества биокаталитического метода по сравнению с традиционными химическими технологиями, используемые биокатализаторы, обладали рядом недостатков: их активность ингибировалась акриламидом и, как следствие этого, с их помощью удавалось получать в промышленных условиях растворы, содержащие не более 27% акриламида. Для получения товарной формы (40−50% растворы) требовалась стадия концентрирования. Кроме того, биокатализаторы обладали достаточно высокой активностью амидазы, функционирование которой приводило к накоплению акриловой кислоты, что ухудшало качество получаемого акриламида.

Для совершенствования параметров биотехнологического процесса требовалось создание биокатализаторов нового поколения, лишенных указанных недостатков. Мы полагали, что эта задача может быть решена с помощью широкого поиска новых нитрилгидратаз с уникальными свойствами и изучения механизмов, контролирующих синтез нитрилгидратаз в клетках бактерий.

Настоящая работа обобщает результаты изучения бактерий, обладающих нитрилгидратазной активностью и является первым примером комплексного исследования метаболизма нитрильных соединений у родококков на генном и клеточном уровне.

Цель и задачи исследования

.

Основной целью настоящей работы было изучение механизмов регуляции метаболизма нитрилов у Ккойососсиз гкойоскгоиз и на этой основе развитие новых биокаталитических процессов с использованием ферментов, участвующих в утилизации нитрильных соединений.

В соответствии с этим в работе решались следующие задачи:

1. Создание представительной коллекции нитрилутилизирующих бактерий. Выбор штамма с нитрилгидратазной активностью, обладающего потенциалом для промышленного использования.

2. Изучение ключевых ферментов метаболизма нитрилов — нитрилгидратазы (НГ) и амидазы (АМ) у штамма К. гко (1оскгои5 М8, обладающего высоким потенциалом для промышленного использования. Идентификация и характеристика основных механизмов регуляции синтеза НГ и АМ.

3. Разработка системы генетического анализа для родококков.

4. Изучение генетического контроля утилизации нитрилов у К. гкос1оскгоиз М8.

5. Разработка стратегии повышения НГ активности и создание промышленных биокатализаторов для получения акриламида на основе штамма Кгкойоскгоиз М8.

6. Разработка биокаталитических процессов получения амидов, прежде всего, акриламида и никотинамида.

Научная новизна и практическая ценность работы. в работе впервые получены следующие результаты:

1. Показано, что бактерии рода Кко (1ососсиз составляют самую многочисленную группу (свыще 50%) среди нитрилутилизирующих бактерий, изолированных из разных биогеоцинозов.

2. Продемонстрирован коньюгативный перенос плазмид между щтаммами Е. соИ и Шойососсиз 5рр., что позволило создать серию мобилизуемых векторов, способных либо авнономно реплицироваться в родококках (за счет уникального репликона криптической плазмиды) либо интегрировать в хромосому с помощью интегративной системы актинофага фС31 или за счет гомологичной рекомбинации.

3. Для бактерий рода Кко<�Лососси8 разработаны оригинальные методы клонирования генов, введения их в клетки разных видов родококков, интеграции генов в хромосому, замещения аллелей гена в хромосоме и их инактивации.

4. Осуществлено клонирование и проведен структурно-функциональный анализ локуса хромосомы штамма М8, контролирующего катаболизм нитрилов. Показано, что его главной особенностью является отсутствие оперонной организации: гены НГ, АМ и регуляторные гены представляют собой единый регулон, обеспечивающий индуцибельное координированое образование двух ферментов НГ и АМ, вовлеченных в деградацию нитрилов.

5. Обнаружен принципиально новый механизм регуляции НГ, заключающийся в активации транскрипции гена НГ ионами кобальта, входящими в состав простетической группы фермента.

6. Показано, что синтез ферментов утилизации нитрилов в штамме М8 подвержен глюкозной репрессии, тем самьм, впервые продемонстрировано наличие у родококков углеродной катаболитной репрессии. Отсутствие в штамме М8 фосфотрансферазной системы для транспорта Сахаров, а также отсутствие эффекта сАМФ на репрессию продемонстрировало, что механизмы катаболитной репрессии у родококков отличаются от таковых у энтеробактерий и бацилл.

7. Получены доказательства, что синтез ферментов НГ и АМ в штамме К. гкойосНгоиз М8 подвержен сложной регуляции на транскрипционном уровне, элементами которой являются: координированная индукция обоих ферментов, вызываемая амидамикобальт-зависимая регуляция НГ, углеродная катаболитная репрессия и репрессия аммонием.

8. Изучены пути ассимиляции аммония в штамме К. гко (!оскгоиз М8. В зависимости от концентрации аммония, в клетках М8 преимущественно функционирует либо путь с участием глутаматдегидрогеназы — при высоких концентрациях аммония либо с участием глутаминсинтетазы и глутаматсинтазыпри низких конце нтр ациях.

9. Разработан селективный способ получения мутантов по метаболизму нитрилов и впервые получены мутанты с конститутивным синтезом НГ и AM. Практический аспект работы связан с созданием биокатализаторов и разработкой на их основе процессов получения амидов, в первую очередь, акриламида. Биокатализатор МЗЗ, созданный в настоящей работе, по уровню активности превышает все известные в мире аналоги. Разработанный на основе МЗЗ биотехнологический способ получения акриламида выгодно отличается от традиционных химических способов-сернокислотного и каталитического, высокой степенью селективности и конверсии гидратации акрилонитрила, мягкими условиями проведения процесса, чистотой получаемого продукта, низкими энергетическими затратами, экологической безопасностью. В настоящее время с помощью биокатализатора МЗЗ в России и в Южной Корее поизводится несколько тысяч тонн акриламида в год. Вся питьевая вода г. Москвы очищается с помощью флокулянтов, получаемых на основе биоакриламида, произведенного с использованием биокатализатора МЗЗ. Биокаталитический процесс получения акриламида является первым в России примером использования биотехнологии в крупнотоннажной химии.

Работа по созданию биокатализаторов и развитию технологии получения акриламида и полимеров на его основе была отмечена приемией Правительства России в области науки и техники за 1994 г.

Основные результаты, изложенные в диссертации, получены в Институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов в лаборатории генетики биодеградации в соавторстве с Астауровой O.A., Герасимовой Т. В., Лариковой Г. А., Погореловой (Леоновой) Т.Е., Поляковой И. Н., Пауковым В. Н., Рябченко Л. Е., Новиковым А. Д., Гордеевым В. К., Синеокой И. В., Акопянц К. Э., Кирсановым Н. Б., Мысловатой М. Л. Часть работы выполнялась в кооперации с сотрудниками лабораторий ГосНИИгенетика (заведующие: Вейко В. П., Честухина Г. А., Воейкова Т. А., Глазунов A.B.), с сотрудниками Саратовского филиала ГосНИИгенетика (ныне «Биоамид») Ворониным СП., Козулиным СВ., сотрудниками кафедры почвенной микробиологии МГУ Добровольской Т. Г. и Скворцовой И. Н, а также отдела микробиологии окружающей среды Национального центра по биотехнологии (Брауншвайг, Германия) К. Тимиссом и П.Голышиным. Всем коллегам автор выражает благодарность за участие в проведении представленного к 7 защите исследования. Автор выражает признательность чл.-корр. РАН, профессору В. Г. Дебабову за постоянный интерес, плодотворные дисскуссии и поддержку данной работы.

Апробация работы.

Диссертационная работа была апробирована на семинаре отдела молекулярной генетике ГосНИИгенетика в 2001 г. Материалы диссертации докладывались на отечественных и зарубежных конференциях, симпозиумах и семинарах, в том числе: на 7 Всесоюзном симпозиуме «Инженерная энзимология» (Москва, 1991) — 5 Форуме по прикладной биотехнологии (Рент, Бельгия, 1991) — 5 конференции по генетике и молекулярной биологии промышленных микроорганизмов Американского микробиологического общества (Блюмингтон, 1992) — Международной конференции «Наукоемкие химические технологии» (Москва, 1994) — 9 и 11 Международных симпозиумах по биологии актиномицетов (Москва, 1994; Сисси, Греция, 1999) — 10 Международном биотехнологическом симпозиуме (Сидней, 1996) — 8 Международном симпозиуме по генетике промышленных микроорганизмов (Иерусалим, 1998) — Международном семинаре «Assessment of sponsored biological research in Russia for the new millennium» (Новосибирск, 1999) — Кремлевском инвестиционном форуме «Продукция и технологии: продвижение на рынок» (Москва, 2000) — Конференции по биодеградации и биокатализу Американского микробиологического общества (Сан Хуан, 2001).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Органические цианиды или нитрилы — это группа соединений с общей структурной формулой R-CsN. Характерной особенностью всех нитрилов является наличие в их составе функциональной группыCsN, содержащей тройную связь между атомами углерода и азота. Нитрилы способны вступать в разнообразные реакции (гидролиз, восстановление, олигомеризация) и в качестве стартового материала используются в органическом синтезе для получения аминов, амидов, кислот, эфиров, альдегидов, кетонов, включая циклические кетоны, имины и др. Синтетические нитрильные соединения производят в значительных количествах (сотни тысяч тонн в год). Они широко используются в различных областях в качестве мономеров для полимеризации (акрилонитрил), растворителей (ацетонитрил), исходного сырья для производства гербицидов и др. Нитрилы также являются широко распространенными метаболитами клеток. Цианогликозиды, цианолипиды, индол-3-ацетонитрил, Р-циано-Ь-аланин образуются во многих видах растений и микроорганизмов (bCnowles, 1976). Наиболее многочисленной группой растительных нитрилов являются цианогликозиды, которые играют важную роль в механизме защиты у растений (путем освобождения цианида) (Conn, 1979).

Все нитрилы являются высокотоксичными соединениями и, в случае попадания в окружающую среду, представляют значительную угрозу для человека и животных.

Ряд микроорганизмов (псевдомонады, актиномицеты, грибы) способны метаболизовать нитрилы в качестве источников азота и/или углерода. Возрастающий интерес к группе микроорганизмов, способных метаболизировать нитрильные соединения, обусловлен возможностями их применения для биокатализа и детоксикации окружающей среды.

1. Биотрансформации нитрильной группы.

Три типа биохимических реакций способны элиминировать — C N группу в нитрилахокисление, восстановление и гидролиз.

Многие растения и насекомые окисляют нитрилы до циангидринов (или альфа-оксинитрилов) с помощью оксигеназ. Циангидрины, в свою очередь, под действием оксинитрилаз превращаются в альдегиды и цианистый водород (Fawcett et al., 1958). Этот тип превращений не обнаружен у бактерий, однако показано, что грибы Trichoderma sp. способны деградировать диаминомалеонитрил с освобождением цианида (Kuwahara&Yanase, 1985).

Оксигеназа Оксинитрилаза.

R-CH2-CN—R-CHOH-CN—R-CHO + HCN.

Нитрил +О2 аоксинитрил альдегид.

Восстанавливать цианиды способны азотфиксирующие микроорганизмы, содержащие фермент нитрогеназу (Hardy et al., 1971). При этом нитрилы превращаются в углеводороды и аммоний.

Нитрогеназа.

R-CN л R-CH3 + N H 3 АТФ.

Наиболее распространенным у микроорганизмов типом превращений нитрильной группы является гидролиз. Однаружено две группы ферментов, гидролизующих нитрилы: нитрилазы (ЕСЗ.5.5.1), которые превращают нитрилы в карбоновые кислоты и аммоний в одну стадию (Hook & Robinson, 1964) и нитрилгидратазы (ЕС4.2.1.84), продуцирующие из нитрилов амиды, которые далее трансформируются в карбоновые кислоты и амминий под действием амидаз (ЕСЗ.5.1.4) (Asano et al., 1980).

Нитрилаза.

R-CN—R-COOH + NH3.

Нитрил +H2O Кислота.

Нитрилгидратаза Амидаза.

R-CN—-R-CONH2—R-COOH + NH3.

Н2О Амид +Н2О.

Именно эта последняя группа ферментов [нитрилазы, нитрилгидратазы (НГ) и амидазы (АМ)] привлекает к себе повышенное внимание в качестве биокатализаторов для получения амидов и кислот. Учитывая, что целью настоящей работы было изучение бактерий, обладающих гидролитической активностью, подробнее рассмотрим свойства этих ферментов.

Нитрил азы.

Нитрилазы впервые были обнаружены у псевдомонад, которые гидролизовали природный нитрил рицинин до соответствующей кислоты (Hook & Robinson, 1964). Позднее были изолированы микроорганизмы из разных таксономических групп с нитрилазной активностью, способные гидролизовать как природные так и синтетические нитрилы (Kobayashi & Shimizu, 1994). На основании различий в субстратной специфичности, нитрилазы распределены на три группы: ароматические, алифатические и арилацетонитрилазы. Ароматические нитрилазы преимущественно гидролизуют ароматические и гетероциклические нитрилы. Нитрилаза из R. rhodochrous Л является наиболее изученным ферментов из группы ароматических нитрилаз (Nagasawa et al., 1988b). Синтез нитрилазы в штамме Л индуцируется изовалеронитрилом. Позднее было показано, что капролактам также является мощным индуктором синтеза ароматических нитрилаз (Nagasawa et al, 1990b).

Алифатические нитрилазы, преимущественно катализирующие гидролиз алифатических нитрилов, удалось обнаружить совсем недавно. Долгое время считалось что нитрилы, цианогруппа которых находится рядом с двойной связью (например, бензонитрил), гидролизуются под действием нитрилаз, в то же время алифатические нитрилы гидрализуются с участием нитрилгидратаз. Кабаяши с coaBT.(Kobayashi et al., 1991 а) обнаружили штамм R. rhodochrous К22, нитрилаза которого проявляла высокую активность в отношении насыщенных алифатических нитрилов (таких как, ацетонитрил или кротононитрил). Эта нитрилаза способна также гидролизовать только одну циано группу в алифатических динитрилах (например, в глутаронитриле). Известно, что традиционными химическими методами такой селективный моногидролиз динитрилов осуществить трудно. Подобно нитрилазе в штамме Л, нитрилаза в штамме К22, также индуцировалась изовалеронитрилом.

Расширение круга субстратов при скрининге позволило обнаружить новый класс нитрилаз (арилацетонитрилазы), которые не атаковалаА ароматические и алифатические А/ нитрилы, кроме ацетонитрила, но действовали на арилацетонитрилы, такие как: индол-3-ацетонитрил, фенилацетонитрил, тиофен-ацетонитрил. Такие нитрилазы обнаружены в штаммах Alcaligenes faecalis JM3 и АТСС8750 (Nagasawa et al., 1990aYamamoto et al., 1992).

В таблице 1 суммированы свойства некоторых нитрилаз. Нитрилазы представляют собой мультимертные белки, состоящие из одинаковых субъединиц, размер и количество которых варьирует у разных ферментов. В отличие от НГ, нитрилазы не содержат ионов металлов. Все известные нитрилазы относятся к сульфгидрильным ферментам. Для всех изолированных нитрилаз продемонстрирована субстратзависимая активация фермента, впервые обнаруженная Harper (1977). Активация представляет собой агрегацию субъединиц с образованием мультимерного активного фермента.

Таблица 1. Микробные нитрилазы и их свойства (Bunch, 1996).

Штаммы.

Rhodococcus rhodochrous Л Rhodococcus rhodochrous К22 Alcaligenesfaecalis JM3 Fusarium oxysporum.

Rhodococcus sp. A T C C 39 494.

Arthrobacter sp.

Мол. вес. фермента, kDa.

260 550.

580 30.

Мол. вес. субъединиц, kDa.

41.5.

44 37.

41.5 30.

Т рн опт., опт. с.

45 40.

7.7.

5.5.

7.5 6−10.

40 7.5.

40 5.

Субстраты ароматические нитрилы алифатические нитрилы арилацетонитрилы ароматические и алифатические нитрилы ароматические нитрилы ароматические нитрилы.

Для ряда нитрилаз показано, что цистеиновый остаток в составе фермента играет важнейшую роль для проявления каталитической активности (Kobayashi et al., 1992). Mahadevan & Thimann (1964), a также Harper (1977) предложили механизм нитрилазной реакции (Рис. 1).

ANH HjO.

R-CsN + ESH.

— R-c!

SE.

HjO гО R-CNHj.

SE /V.

R-C' + ESH OH.

R-CA + ESH NH, Ш.

Рис. 1. Предполагаемый механизм действия нитрилаз.

Согласно их гипотезе, углеродный атом нитрильной группы подвергается нуклеофильной атаке сульфгидрильной группы фермента, что приводит к образованию интермедиата (I). После высвобождения аммония образуется ацилфермент, который затем гидролизуется до кислоты. Эта схема было в последующем дополнена (реакции п и ш). Было показано, что нитрилаза способна с низкой скоростью использовать амиды в качестве субстратов (Kobayashi et al., 1998а). Авторы предполагают, что интермедиат (I) может также аномально разрушатся с образованием амида. Наличие небольшого количества амида (1−6%) в качестве побочного продукта при гидролизе нитрилов нитрилазами из Pseudomonas, Fusarium и Rhodococcus (Hook & Robinson, 1964; Goldlust & Bohak, 1989; Stevenson et al., 1992) также подтверждает эту гипотезу.

Амидазы.

Амидазы, участвующие в метаболизме нитрилов и амидов у бактерий, относятся к группе ациламид амидогидралаз (ЕС 3.5.1.4), катализирующих гидролиз ациламидов до соответствующих кислот и аммония. Амидазы обнаружены у многих видов бактерий и представляют собой белки разного молекулярного веса (от 60 до 360 kDa), состоящие из субъединиц одного типа (Maestracci et al., 1988). В отличие от нитрилгидратаз, амидазы не содержат ионы металлов. Эксперименты с ингибиторами показали, что алифатические амидазы относятся к сульфгидрильньш ферментам (Maestracci et al., 1988).

На основании субстратной специфичности амидазы отнесены к двум типам (Fournand & Amaud, 2001). Первый тип — это так называемые алифатические амидазы, гидролизуют только коротко-цепочечные алифатические амиды. Наилучшими для них субстратами являются ацетамид, акриламид, пропионамид. Алифатические амидазы обнаружены у бактерий следующих видов: Pseudomonas aeruginosa (Clarke, 1970), Rhodococcus sp. R312 (Maestracci et al, 1984), Arthrobacter sp. Jl (Asano et al., 1982a), Methylophilus methylotrophus (Wybom et al., 1996), Helicobacter pylori (Skouloubris et al., 1997), Bacillus stearothermophilus BR388 (Cheong & Oriel, 2000). Ко второму типу относятся амидазы, которые совместно с НГ вовлечены в метаболизм нитрильных соединений. Они преимущественно гидролизуют алифатические амида средней длины у (С4-Сб), такие как: пропионамид, изобутироамид, валерамид, гексаноамид, а также проявляют активность в отношении ариламидов, таких как бензамид, фенилацетамид, никотинамид и др. Ферменты этого типа являются энантиоселективными. Они обнаружены в штаммах Rhodococcus sp. R312 (Mayaux et al., 1990), R. erythropolis JCM (Duran et al., 1993), Rrhodochrous Jl (Kobayashi et al., 1993), P. chlororaphis B23 (Ciskanik et al., 1995).

Компьютерные методы анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей этих ферментов подтвердили разделение амидаз на два типа (Bork & Koonin, 1994; Chebrou et al, 1996). Алифатические амидазы составляют группу гомологичных белков, обладающих также выраженной гомологией с нитрилазами, цианид гидратазой, бетааланин синтазой. Для всех этих ферментов характерно наличие цистеина в определенном положении цепи. Для нитрилаз и алифатической амидазы из псевдомонад показано, что цистеиновый остаток входит в состав каталитического центра фермента (Novo et al., 1995).

Амидазы второго типа составили другую группу гомологичных белков, не обладающих перекрестной гомологией с алифатическими амидазами. Амидазы второго типа обладали гомологией с индолацетамид гидролазой, амидазами из дрожжей и грибов (Chebrou et al., 1996). Аминокислотные последовательности этих ферментов содержали высоко консервативный мотив GGSS, аминокислотные остатки которого, как полагают, существенны для каталитической активности (Рис.2).

170 GGSSGGi.

147 6GSSG.

169 GGSS л5Ш1Ш1Ш? Ш/ШШСлШ13:лШ-ШАТШ1Г?, 1Ш1ШВлШ 213.

170 GGSSGG IA|LgAlADS2FglEGEQe52i-[SAA|Av3gH|2ag|FE 214.

171 GGSS s! ЛИfSÄ-gÜ-Kgnil I ISc dleg 11'Я-i'' 214 12 LrAQYFGKIYIATPPQEFT|5|LF12JEspFWVgglYQKSNAC|3NHQR 57 10 LDTEYFGTIGI@TPAQETFJ|lFA!2Es|NLWV[AYgSSLACSDHNQ 55.

196 SITMDgETl|C-SACQ-|lV-|"2gT|LLTCATfAIAINIQSDlEA 238.

197 svTisEwvic-Ei5co-A1b-Ta8TOKbycl5p1 — дыюпатва 238 222 MegjgfeLejEJALIAGiggSLaGMsRVABSRgL-™ 2 66.

215 eaaasgiEALiABsPSGLEIEAlABP-b|A{Alcm3TaM 259.

207 MagJgigigiEESL 1ЕАн15и101лтД1ШаШ1-гаг|дуо!сЯр|дК5ШрЯ 251.

148 MagfgMesEA51? AALSPVJgi#JsfflA 192 144 Лg|SgSAgSSAg|l|lASAl|53g|лJ2S-SAAi2glTgFIA'IA 188 146 «WaiilEielVAlAASЙSRLMLGGТЙТрИдАШЭfeгIЗААь0гШЯрRНЯT^i8 190.

AASSAgs1gAAE1GTTgHgNJJ1HLJSW-gAHCNgVATIJSOg 191.

2 03 SSAAEAMIAMIAGAIGlETElSAEaEv-SAAiNSljYglRSSHD 247 2 02 AA3SEA1BE1R|GVIGgETS1ASEv-|AAiNF3Yg|RgSHg 246 153 ЕАШЗЕЗ5У1ТААЙЬСYASlBГ^>VJcAefeA4−1рhЯлАА^I!сПтЙ1A-ШA 197 151 H|s|sgSv2(ARJg|A (C[SLTT2SA|iTJj|V-J3AALNN0ISIJ2A 195.

Рис. 2. Сравнение аминокислотных последовательностей амидаз из разных видов. Обозначения штаммов: R312- Rhodococcus sp. R312- RhoRhodococcus sp.- Jl-L-R.rhodochrous JlN-774 — Rhodococcus sp. N-774- B23 — P. chlor or aphis B23- Asp-f2, Asp-flN-терминальные участки химозина и пепсинаAsp-lln Asp-12 — Стерминальные участки пепсина и химозинаVDHAD-витамин D3 гидроксилазаFAAH-олеамид гидролазаYeastамидаза S. cerevisiaeElEl фермент из FlavobacteriumIND-Pиндолацетамид гидролаза из Р. savastanoiIND-A-индолацетамид гидролаза из Agrobacterium tumefaciensIND-Bиндолацетамид гидролаза из Bradyrhizobium japonicumACE-0 — ацетамидаза из Aspergillus oryzaeACE-N — ацетамидаза из Aspergillus nidulansCOM — амидаза из Comamonas acidovoransUreaамидолиаза из Candida utilis.

R312.

Rho.

J1-L.

N-774.

В23.

Asp-f2.

Asp-f1.

Аэр-11.

Asp-12.

VDHAP.

FAAH.

Yeast.

EI.

IND-P.

IND-A.

IND-B.

ACE-0.

ACE-N.

Com.

Urea.

Эти амидазы содержат несколько консервативных аминокислотглицин, аспарагиновую кислоту и серии, локализованных на 17,19 и 23 позициях от GGSS мотива. С помощью сайт-специфического мутагенеза было продемонстрировано, что остатки Asp и Ser являются частью активного сайта стериоспецифических амидаз (Kobayashi et al., 1997). Сравнение амидаз с различными типами протеаз, гидролизующих пептидную связь, выявило наличие Asp и Ser остатков в активном сайте аспартильных протеиназ.

Таким образом, сравнение амидаз с различными гидролизующими ферментами показало, что амидазы обладают гомологией с двумя группами C-N гидролаз: алифатические амидазы с нитрилазами, а стереоселективные амидазы с аспартильными протеиназами. Вероятно, ферменты каждой группы эволюционировали от общих предшественников. Недавно было обнаружено, что амидаза из штамма R. rhodochrous Л способна использовать в качестве субстрата нитрилы, превращая в кислоты и аммоний, подобно нитрилазам (Kobayashi et al., 1998). Хотя между этой амидазой и нитрилазами нет гомологии, этот результат свидетельствует о более сложных эволюционных взаимоотношений в группе C-N гидролаз, чем это представлялось ранее.

Большинство изученных амидаз, помимо гидролитической проявляют также и ацилтрансферазную активность в присутствии гидроксиламина (Рис.3).

NHOH.

Рис. 3. Гидролизующая и ацилтрансферазная активности амидаз.

Механизм гидролитической и трансферазной реакции включает образование ацилфермента, который подвергается нуклеофильной атаке атомов кислорода воды или азота гидраксиламина, что приводит к образованию кислот или гидроксаматов (Рис.3).

Недавно было показано (Роигпапд е1 а 1., 1997), что акцептором ацильной группы может также выступать гидразин (МНгННг). Таким образом использование амидаз позволяет получать широкий круг гидразидов, которые также как гидроксамовые кислоты, являются прекрасными хелатирующими агентами. Не только амиды, но и кислоты и эфиры могут служить донорами ацильной группы для амидаз. Однако в последнем случае реакции потекают с низкой скоростью, поэтому в практическом плане интерес представляют реакции с амидами.

Нитрилгидратазы.

В отличие от нитрилаз и амидаз, нитрилгидратазы (НГ) являются металлоферментами и содержат ионы железа или кобальта в качестве простетической группы.

Ферменты отличаются по физико-химическим свойствам и субстратной специфичности, но всегда состоят из двух типов субьединиц (а и Р), хотя число их может варьировать (Табл.2).

Таблица 2. Свойства нитрилгидратаз из различных микроорганизмов (Bunch, 1996).

Субстрат.

Штаммы.

Agrobacterium tumefaciens.

IAMB-261.

Brevibacterium sp. R312.

Pseudomonas chlororaphis.

B23.

Pseudonocardia thermophila.

JCM3095.

Rhodococcus rhodochrous J l,.

L-НГ.

Rhodococcus rhodochrous J l, Н-НГ.

Rhodococcus sp. N-774.

Ионы.

Co&Fe.

Fe.

Fe.

Co.

Co.

Co.

Fe.

MB, kDa.

100 ид.

Число субъед. и их MB, kDa.

4 (25).

3−4 а, 26) (Р, 27.5) 4 а, 25) (РД5) нд.

29).

18−20 (а, 26 ((3,29).

4−5 (а, 26) (13,29) 2 а, 28.5) (Р, 29).

Т опт. С.

РН опт.

7.5.

25 7.8.

20 7.5.

40 8.8.

35−40 6.5.

30 7.7 индол-3-ацетонитрил алифатические нитрилы алифатические нитрилы акрилонитрил ароматические нитрилы алифатические нитрилы алифатические нитрилы.

Железосодержащие НГ, изолированные из Rhodococcus sp. R312 и Р. chlor or aphis В23 были первыми ферментами, содержащими негемовое железо (Sugiura et al., 1987). Структура НГ из щтамма КЗ 12 довольно хорошо изучена с помощью различных спектральных методов (ЭПР, ЯМР, Романовской спектроскопии). Кристаллы НГ из R312 были исследованы с помощью ренгеноструктурного анализа (Huang et al., 1997). Результаты этих исследований показали, что центр связывания ионов железа находится в составе, а субъединицы и что три цистеиновых остатка и серии участвуют в координации иона железа.

Уникальной особенностью железо-содержащих НГ из Rhodococcus sp. R312, Rhodococcus sp. N-774 и N-771 (все белки практически идентичны) является их реакция на свет. Активная форма фермента переходит в неактивную при культивировании клеток в темноте. Обработка клеток видимым светом приводит к восстановлению НГ активности. Исследование НГ из N-771 показали, что эндогенная окись азота N0 связана с ионом железа в неактивном ферменте, а фотодиссоциация приводит к активации фермента (Endo et al, 1999). Такая регуляция с помощью N0 и света также показана для НГ из R312 и Comamonas testosteroni (Bonnet et al, 1997;Sari et al., 1998).

Кобальт-СО держащие НГ впервые были обнаруженны в штамме R. rhodochrous Л (Nagasawa et al., 1991). Этот штамм синтезирует две НГ-высомолекулярную (Н) с молекулярным весом 520 kDa и низкомолекулярную (L) с молекулярным весом 130 kDa в зависимости от условий выращивания (Kobayashi et al., 1991b). Эти ферменты отличаются по субстратной специфичности: ННГ преимущественно действует на алифатические нитрилы, а L — на ароматические нитрилы. Оба фермента содержат по одному иону кобальта на каждую альфа субъединицу. Кобальт прочно связан с ферментом и не освобождается при диализе. Около 10 лет (1988 — 1997) штаммы R. rhodochrous Л и R. rhodochrous М8 (объект настоящей работы) оставались уникальными, из-за наличия в них кобальт-содержащих НГ. В этот период бьшо изолировано большое число железосодержащих НГ, однако только в конце 90-ых годов были обнаружены еще два штамма с кобальт-зависимыми НГ. Нитрилгидратаза из P. putida 5 В оказалась кроме того энантиоселективной в отношении нитрилов, например: 2(8)-(4'-хлорфенил) -3 -метилбутиронитрила (Payne et al., 1997). Термофильный штамм Bacillus sp RAPc8 содержал НГ с высоким уровнем термостабильности (Pereira et al., 1998).

Секвенирование генов НГ из разных бактерий показало, что в составе аминокислотной цепи каждой альфа-субъединицы содержится консервативный мотив CXXCSC. Он присутствует как у железотак и кобальтсодержащих НГ. Входящие в состав этой последовательности остатки цистеина и серина вовлечены в формирование железо-связывающего центра. Высокий уровень гомологии между кобальт и железосодержащими НГ позволяет утверждать, что кобальтсвязывающий центр имеет ту же структуру, что и железо-связывающий центр в НГ из КЗ 12 (Рис.4).

Удельная активность НГ значительно выще таковой у нитрилаз, хотя оба фермента атакуют нитрилы. Это может быть следствием различий в реакционных механизмах двух типов ферментов. У нитрилаз цистеиновый остаток вовлечен в гидролиз нитрилов, в то время как у НГ металл-содержащий центр выполняет каталитическую функцию (Вгеппап.

Рис. 4. Предполагаемая структура кобальт-связывающего центра НГ из R. rhodochrous Л. (Kobayashi &Shimizu, 1999).

Основываясь на данных по структуре и функциях кобальт и железосодержащих НГ Kobayashi & Shimizu (1999) предложили для НГ следующий механизм гидролиза нитрилов (Рис.5). На первой стадии происходит взаимодействие нитрила с металл-связанной ОН группой, которая может выступать в качестве нуклеофила, атакующего атом углерода нитрильной группы (Рис. 5, I схема). Альтернативный путь (II схема) -металл-связанный гидроксид ион активирует молекулу воды, которая затем атакует углерод нитрильной группы. В результате образуется имидат [R-C (-OH)=NH], который превращается в амид.

Структурное изучение НГ из Agrobacterium tumefaciens (Kobayashi et al., 1995), содержащей одновременно ионы кобальта и железа, а также НГ из гриба Myrothecium verrucaria (Maier-Greiner et al., 1991), содержащей ионы цинка, позволит лучще понять роль металлов в каталитическом механизме НГ. е1а1., 1996).

II.

Cd. он 9-н и r-c = n.

— HB.

Со' -'он.

HB.

R — C, А N.

Со" «он он hb RC = N H.

Со" нон.

RC = N H.

Со* 'он о hb R-C-NHj.

Со" «он.

9 hb.

R-C-NH2 I.

Рис. 5. Предполагаемый механизм действия НГ (Kobayashi & Shimizu, 1999). Схема Iнитрил взаимодействует с металлсвязанный гидрокси-группойсхема II-нитрил взаимодействует с молекулой воды, активированной металлсвязанной гидрокси-группой. Вкатионная группа фермента.

2. Регуляция синтеза ферментов утилизации нитрилов.

Ген НГ из Rhodococcus sp. N774 (Ikehata et al., 1989) был первым клонированным геном НГ. В последующем этот ген бьш использован в качестве зонда для клонирований генов НГ и фланкирующих их областей из разных организмов {P.chlororaphis В23, R. rhodochrous Л, Brevibacterium sp. R312 и др.), образующих как железотак и кобальт-содержащие НГ (Kobayashi et al., 1991bNishiyama et al., 1991; Mayaux et al., 1990). Сравнение аминокислотных последовательностей каждой из субъединиц НГ из разных штаммов выявило высокий уровень гомологии (Рис.6). Во всех изученных штаммах структурные гены для альфа и бета субъединиц сцеплены и формируют единый оперон, хотя взаимное расположение этих генов в опероне варьирует (a? или? a) [Kobayashi & Shimizu, 1998а). Гены амидазы также сцеплены с генами НГ во всех штаммах (В23, N-774, N-771, Bacillus sp. BR449), кроме R. rhodochrous Л, и локализуются перед генами НГ (Kobayashi et al., 1992; Kim & Oriel, 2000). а — субъединица.

Р-субъединица.

Рис. 6. Уровень гомологии аминокислотных последовательностей, а и Р субъединиц различных НГ. Л-Н — Ннитрилгидратаза из R. rhodochrous Л — J1-L — Lнитрилгидратаза из R. rhodochrous ЛВ23 — P. chlororaphis В23- N774- Rhodococcus sp. N-774.

Только в штамме Л ген амидазы не сцеплен с генами НГ и локализуется на расстоянии 1.9 тин за геном, кодирующим бета субъединицу Lнитрилгидратазы. В локусе HНГ в штамме Л ген амидазы не обнаружен (Рис.7).

Гены НГ из псевдомонад (В23, 5В) и бацилл были экспрессированы в клетках Е. соИ под контролем lac промотора (Nishiyama et al., 1991; Wu et al., 1997; Kim & Oriel, 2000). Было обнаружено, что для эффективной экспрессии гена НГ из В23 требуются гены, локализующиеся во фланкирующих областях (Р47К, orfE и 38 kDa белок). Функции этих генов не ясны. Гены НГ из родококков (штаммы Л и N-774) очень слабо экспрессируются в клетках Е.соИ. Ферменты присутствуют в Е. соИ в виде нерастворимых пептидов с минимальной активностью (Ikehata et al., 1989;Kobayashi et al, 1991b).

Ha рис. 7 показана генетическая организация локусов, контролирующих образование H и Lнитрилгидратаз в штамме Л. Локусы H и L помимо структурных генов, кодирующих аир субъединицы НГ {nhhh, nhhB и nhlA, nhlB, соответственно), содержат регуляторные и некоторые дополнительные гены. В локусе H перед геном НГ выявлено 2 генаnhhC и nhhD, которые являются позитивными регуляторами экспрессии Н-НГ (Komeda et al., 1996а). Сравнение с базами данных показало, что продукт гена nhhC имеет значительную гомологию с негативньм регулятором алифатической амидазы из P. aeruginosa, который взаимодействует с амидами. На этом основании сделано предположение, что продукт этого гена необходим для индукции Н-НГ. Продукт гена nhhD имеет гомологию с регуляторным белком оперона множественной устойчивости.

Е.соИ. Два дополнительных гена — пкИЕ и и/г/гР, не имеют отношения к регуляции Н-НГ. Они являются частью 181 164 элемента, который интегрирован между структурными и регуляторными генами.

Локусы Ь и Н значительно отличаются (Котеёа е! а1., 1996Ь). В состав локуса Ь входит ген амидазы {атёА) и кобальтовый транспортер {пЫ¥-) (Котес1а еХ а1., 1997). Гены НГ, транспортера и амидазы транскрибируются в виде единой мРНК. При индукции наблюдается координированная экспрессия НГ и амидазы. Как и в локусе Н, в локусе Ь, перед генами НГ имеется два регуляторных гена. Но если один из них, пЫС, имеет схожую функцию с пкЬС (позитивный регулятор), то второй ген — пЬЮ, отличается структурно и функционально. Показано, что он является негативным регулятором экспрессии Ь-НГ.

Ионы кобальта оказывают разное влияние на образование Н и Г нитрилгидратаз. В отсутствие ионов кобальта, Н-НГ не образуется вообще, а Ь-НГ синтезируется, но неактивна (Nagasawa е! а!., 1991; Котеёа е1 а1., 1996Ь).

1 кЬ и) гт&

I I© (иш.

ПААСяМ/У дМС яМГвШ д*Мл*А6'.

0 с.

М"? I м?" ^.

Со'" Со''.

Со' н-<�чн".

К-СООН + NHз.

Рис. 7. Генетическая организация локусов, контролирующих образование Н и Ь нитрилгидратаз в штамме КгкойосЬгоиз Л. Вверху-локус Н, внизулокус Ь.

Таким образом, структурно-функциональное изучение локусов НГ из разных штаммов продемонстрировало значительное разнообразие их организации и регуляторных элементов. Вместе с тем, молекулярные механизмы, регулирующие синтез ферментов утилизации нитрилов на генном и клеточном уровнях, изучены недостаточно.

3. Перспективы использования нитрилгидролаз в биотехнологии.

Использование НГ для промышленного получения акриламида значительно усилило интерес ко всем ферментам, участвующим в утилизации нитрилов. В настоящее время в научной и патентной литературе имеются многочисленные примеры получения амидов и кислот с помощью разных нитрилгидролизующих ферментов-нитрилаз, нитрилгидратаз и амидаз (Kobayashi et al., 1992; Bunch, 1996; Ramakrishna et al., 1999). Среди продуктов крупнотоннажного синтеза, получаемых из нитрилов с помощью биокатализа, следует, в первую очередь, назвать акриламид, никотинамид, акриловую кислоту, адипиновую кислоту и др. Проблемы, связанные с получением акриламида с помощью биокатализа, подробно обсуждаются в разделе 5 «Результатов». В прошлом году началось промышленное производство никотинамида с использованием биокатализатора на основе R. rhodochrous П.

Новые области применения нитрилгидролизующих ферментов связаны с использованием стереоселективных ферментов. Macadam & Knowles (1985) продемонстрировали конверсию а-аминопропионитрила в Lаланин используя клетки Acinetobacter sp. APN. С помощью энантиоселективной нитрилазы изAlcaligenes feacalis АТСС8750 удается трансформировать манделонитрил с 95% селективностью в R (-) манделиновую кислотуважный предшественник полу-синтетических Цефалоспоринов (Yamamoto et al., 1991). Гидролиз (Р, 8)-(+)-ибупрофеннитрила с помощью нитрилазы из Acinetobacter sp. АК226 позволяет получить (8)-(+)-ибупрофенпротивовоспалительное лекарство нестероидной природы (Yamomoto &Komatsu, 1991). Использование системы из двух ферментов нитрилгидратазы и стереоселективной амидазы также позволяет получать стереоизомеры органических кислот. Штамм Rhodococcus sp. R312, содержащий стереоселективную амидазу был использован для получения оптически активных аминокислот из а-аминонитрилов (Maestracci et al., 1988). Оптически чистые 2-арилоксипропионовые кислоты с высокой гербицидной активностью были получены из нитрилов с помощью штамма Brevibacteriwn imperiale СВ8, обладающего НГ и амидазной активностью (Bianchi et al, 1991).

Долгое время не удавалось получить стереоизомеры амидов. Однако ситуация изменилась с обнаружением стереоселективных НГ. Fallon et al. (1997) сообщили о S-селективной НГ из штамма Р. риМа NRRL18668, способной гидролизовать 2-(4-хлорфенил) — 3- метилбутиронитрил в соответствующий Sамид. На сегодняшний день уже изолировано несколько стереоселективных НГ (Bauer et al., 1998; Effenberger & Graef, 1998).

Гидролиз динитрилов с помощью биокатализаторов позволяет получать новый круг органических соединений. С помощью нитрилаз, НГ и амидаз из динитрилов могут быть получены цианокарбоновые или амидокарбоновые кислоты. Всего пять типов продуктов можно получить из динитрилов с помощью ферментов (Рис.8), в то время как традиционными способами удается получить только два типа-диамиды или дикарбоновые кислоты. Уже разработан комбинированный процесс получения из адипонитрила адипиновой кислоты и капролактама, предшественников нейлона (Moreau et al., 1993). Ароматическая нитрилаза из R. rhodochrous Л была использована для получения из терефталонитрила и изофталонитрила 4- и З-цианобензойных кислот, важных предшественников для органического синтеза (Kobayashi et al., 1988).

НГ цинитрил химичеркая реакция.

CONH2 R цианамид НГ амидаза соон R.

CN цианокарбоновая кислота.

НГ.

CONH2.

R / л CONH2 диамид амидаза.

СООН.

R / л CONH2 амидокарбоновая кислота химическая реакция амидаза.

СООН R СООН дикарбоновая кислота.

Рис. 8. Схема трансформации динитрилов.

Новые области применения нитрилгидролизующих ферментов открываются в связи с обнаружением нитрилгидратазы из Rhodococcus sp. DSM11397 и нитрилазы из Pseudomonas sp. DSM11387, способных работать в средах с низким содержанием воды (Layh& Willets, 1998).

Таким образом, микробные фементы утилизации нитрилов, способны осуществлять разнообразные трансформации синтетических нитрильных соединений. Широкий поиск ферментов среди различных групп микроорганизмов позволил расширить возможности биоконверсии нитрилов и продемонстрировал, что потенциал нитрилгидролизующих ферментов еще далеко не исчерпан.

МАТЕРИАЛЫ И ОСНОВНЫЕ МЕТОДЫ.

Бактериальные штаммы. Основным объектом работы являлся штамм Ккос1ососси5 гкос1оскгоиз М8, выделенный из почвы на среде с изобутиронитрилом в качестве единственного источника азота. В работе также использованы различные штаммы Шо (Аососси8 и Е. соИ, полученные из ВКПМ (ГосНИИгенетика), ВКМ и других источников.

Выделение нитрилутилизирующих бактерий природных источников осуществляли методом накопительных культур. Образцы почвы, воды, ила, растительной подстилки и др. вносили в колбы со средой НС следующего состава (г/л): К 2НРО4×3 Н2О — 7.0- КН2РО4 — 3.0- МфОА х 7Н2О — 0.1- Ре804×7 Н2О- 0.005- СоСЬ х 6 Н2О- 0.01, цитрат натрия -0.5- глицерин -2 млраствор смеси витаминов-2 мл, рН7.2−7.4 и ацетонитрилом (1 г/л) или бензонитрилом (0,5 г/л) в качестве единственного источника азота. Затем колбы инкубировали при 30 °C на качалках до появления роста. Путем многократных пересевов культур на среде того же состава и последующего высева на твердую среду были отобраны чистые культуры.

Среды и культивирование штамма R. rhodochrous М8. В качестве полноценных сред использовали Ь-бульон и триптозный агар (Регак). Минимальной средой служила среда МС, состоящая из минеральных солей (г/л): К 2НРО4×3 Н2О — 0.5- КН2РО4 — 0.5- ]^04 X 7Н2О — 0.5- Ре804×7 Нг О- 0.005- СоСЬ х 6 Н2О- 0.01 и источников углерода и азота, растворенных в 1 л дистиллированной воды при рН7.2−7.4. В качестве источников углерода использовалась глюкоза, фруктоза, пируват или ацетат. Мочевина, соли аммония или нитрат натрия использовались в качестве источников азота.

Штаммы выращивали в стандартных (40 мл) пробирках или в 750 мл колбах при 30 °C на круговых качалках (250 об/мин) в течении 48−72 час. Для культивирования штаммов использовали также ферментеры фирмы «Марубиши» (объемом 1,2, 100 и 250 л), оборудованные системами регистрации и контроля рН, р02 и температуры.

Определение активности ферментов. Нитрилгидратазная активность интактных клеток определялась по образованию амида в реакционной смеси объемом 2 мл, содержащей 10 мг/мл нитрила и 0.08 мг/мл клеток (по сухому весу) в 10 мМ фосфатном буфере, рН7.6. Реакцию проводили при 20 «С в течении 5 мин. Концентрацию амида в надосадочной жидкости определяли с помощью газовой хроматографии или, в случае акриламида, также спектрофотометрически при 235 нм (НрЛ е! а!., 1990). Активность нитрилгидратазы выражали в следующих единицах: Удельную активность (УА) в цМ амида/мин/мг клеток по сухой массе. Общую активность (OA) в iM амида /мин/мл культуры.

Гидролитическая активность амидазы определялась по образованию аммония в реакционной смеси объемом 2 мл, содержащей 10 мг/мл ацетамида и 0,2 мг/мл клеток (по сухому весу) или 0,1 мг фермента в 10 мМ фосфатном буфере, рН7.0. Реакция проводилась в течении 30 мин при 37 °C и останавливалась добавлением 0.04 мл HCl. Количество, образующегося аммония, определяется с помощью реактива Неслера. Удельную амидазную активность выражали в цМ МН4/мин/мг клеток по сухой массе или мг белка. Трансферазную активность амидазы определяли по методу Брамера и Кларк (Brammar and Clarke, 1964) и выражали в мкмоль ацетилгидроксамата, образуемого за минуту 1 мг клеток (по сухому весу) или мг белка для изолированного фермента.

Коньюгативный перенос плазмид мелвду штаммами Rhodococcus и E. colL Перенос плазмид между Е. coli SI7−1, содержащим мобилизуемые плазмиды, и реципиентными щтаммами родококков проводили на фильтрах. Клетки донора и реципиента смещивали в соотнощении 4:1 и помещали на фильтр, который инкубировали на среде LB при 28 °C в течении ночи. Затем клетки ресуспендировали и высевали на чащки с LB средой с тиострептоном (25 мкг/мл) или апрамицином (70 мкг/мл) и налидиксовой кислотой (10 мкг/мл).

Электропорация штамма Rhodococcus sp. НХ7 проводилась в 2 мм кюветах (EquiBio) с использованием прибора Easyject Prima (EquiBio, Germany).

Манипуляции с ДНК и РНК. Вьщеление хромосомной и плазмидной ДНК, рестрикция и лигирование ДНК, Саузерни Нозернгибридизации проводились с использованием стандартных методов (Sambrook et al., 2001) с модификациями. Суммарную РНК вьщеляли с использованием стеклянных бус (420−600 мкм, Sigma). Электрофорез РНК в формальдегид-агарозном геле и перенос ДНК и РНК на Hybond-N мембраны осуществляли согласно рекомендациям производителя (Amersham Corp.).

Амплификация ДНК. Полимеразную цепную реакцию (PCR) проводили на приборе фирмы Eppendorf.

Секвенирование ДНК проводили на автоматическом секвенаторе ABI373.

Электрофорез белков в 12,5% полиакриламидном геле с SDS проводили согласно методике Лемли (Laemmli, 1970).

Транспорт ацетамида и глюкозы изучали с использованием радиоктивномеченных соединений- ['''С]иодацетамида и [", ЛС ]глюкозы. Отобранные пробы анализировали на сцинтилляционном счетчике «Tractor Analytic Delta 300» .

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ И ТАКСОНОМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ СКРИНИНГА.

БАКТЕРИЙ, СПОСОБНЫХ УТИЛИЗИРОВАТЬ НИТРИЛЫ.

Для выбора стратегии скрининга микроорганизмов с определенной ферментативной активностью важное значение имеют данные о распространенности в окружающей среде субстратов (природньк и синтетических) и о таксономической принадлежности микроорганизмов, обладающих такой активностью.

Нитрильные соединения, содержащие функциональную группу (-CN), такие как цианогликозиды, цианолипиды, индол-З-ацетонитрил, р-циано-Ь-аланин, являются широко распространенными природными соединениями и образуются во многих видах растений и микроорганизмов (bCnowles, 1976). Наиболее многочисленной группой растительных нитрилов являются цианогликозиды, которые играют важную роль в механизме защиты у растений (путем освобождения цианида), а также могут использоваться в качестве источника азота (Conn, 1981).

Синтетические нитрильные соединения производятся в значительных количествах (сотни тысяч тонн) и широко используются в различных областях промышленности. Нитрильные гербициды, хлори бромпроизводные бензонитрила, такие как Касарон, Бентрол, Бромоксинил и др. широко используются в сельском хозяйстве. В результате хозяйственной деятельности синтетические нитрилы попадают в окружающую среду с промышленными сточными водами и накапливаются в почвах при использовании гербицидов. Таким образом, нитрилы довольно часто являются компонентами антропогенных и природных биогеоцинозов.

Исходя из распространенности нитрильных соединений в окружающей среде можно было предполагать, что основными нишами для выделения нитрилутилизирующих микроорганизмов являются участки с антропогенными загрязнениями-территории производств нитрилов, их сточные воды, а также природные биогеоцинозы, где активно происходит процесс разложения растительного опада и где присутствуют растительные нитрилы.

Для выделения нитрилутилизирующих бактерий были изучены свыше 50 образцов, отобранных из естественных и антропогенных биогеоценозов с 5 участков. Два участка имели высокий уровень антропогенных загрязнений и находились на территории производственных обьединений «Полимир» г. Новополоцк (Белоруссия) и «Нитрон» г. Саратов, производящих акрилонитрил. Образцы содержали ил, воду из отстойников, смывы баков, содержащих нитрилы, а также почву, листья, траву из загрязненных мест.

Естественными биогеоцинозами служили участки хвойно-щироколиственного леса с дерново-подзолистьми почвами около г. Новополоцка, участок степной зоны под городом Саратовом и участок тундры вблизи Нарьян-Мара. На этих участках образцы отбирали из слоев лесной подстилки (опавщие листья, ферментативный слой и гумусовый слой), а также ветощь и верхние части растений.

Вьщеление нитрилутилизирующих бактерий проводилось методом накопительных культур на минеральной синтетической среде с алифатическими нитрилами (ацетонитрилом или изобутиронитрилом) или с ароматическим нитрилом (бензонитрилом) в качестве единственного источника азота.

Изучение новых изолятов проводили по следующей схеме:

1. Распределение на грамположительные и грамотрицательные бактерии.

2. Идентификация рода, а в некоторых случаях и вида, на основании морфологических и физиологических тестов.

3. Изучение роста на нитрилах и амидах.

4. Анализ продуктов трансформации акрилонитрила. 1.1. Таксономическое разнообразие изолятов.

Всего бьшо изолировано свыще 100 щтаммов, растущих на алифатических и ароматических нитрилах. Родовая принадлежность изолятов была установлена на основании микроскопии клеток и физиологических тестов (Табл.3). Таблица 3. Таксономическое разнообразие новых изолятов нитрилутилизирующих бактерий.

Окраска по Граму Род Количество изолятов.

Грам-положительные 26.

Якойососсиз 3.

Овг>ъкоу1а 1.

Сиг1оЬас (егшт.

Грам-отрицательные 7.

Р5еис1отопа5 1.

Е1ауоЬас1егшт.

Alcaligenes.

Изоляты были отнесены к 6 родам: Rhodococcus, Oerskovia, Curtobacterium, Pseudomonas, Flavobacterium и Alcaligenes. Первых три рода составляют группу грам-положительных бактерий, а остальные тригруппу грамотрицательных бактерий. В количественном отношении среди изолятов превалировали родококки (более 50% от обш, его числа). В пределах этого рода доминировали представители вида Rhodococcus erythropolis, которые, как известно, являются эвритопными.

Не удалось выявить корреляции между местообитанием бактерий,)п:илизируюшим нитрилы и их таксономической принадлежностью. Однако расширение круга биогеоцинозов для отбора образцов позволили дополнить уже известный перечень родов новыми таксонамиOerskovia, Curtobacterium, Flavobacterium и Alcaligenes.

выводы.

1. Продемонстрированы таксономическое разнообразие и широкое распространение в природных и антропогенных биогеоцинозах бактерий, утилизируюш-их нитрильные соединения. Создана большая коллекция штаммов нитрилутилизирующих бактерий (свыше 100 штаммов), в которой представлены бактерии из 6 таксономических групп (Rhodococcus, Oerskovia, Curtobacterium, Pseudomonas, Flavobacterium и Alcaligenes), обладающих разным набором ферментовнитрилгидратазой, нитрилазой и амидазой, отличающих по субстратной специфичности. Показано, что бактерии рода Rhodococcus составляют самую многочисленнзто группу (свыше 50%) среди изолированных нитрилутилизирующих бактерий.

2. Селекционирован штамм Rhodococcus rhodochrous М8, нитрилгидратаза которого обладает комплексом уникальных свойств — высокой рН и термостабильностью и широкой субстратной специфичностью. Ферментная система утилизации нитрилов штамма М8, состоящая из двух ферментовнитрилгидратазы и амидазы, представляет собой удобную модель для изучения механизмов регуляции синтеза белков у почвенных Грам-положительных микроорганизмов.

3. Разработана оригинальная система клонирования и переноса генов для бактерий рода Rhodococcus, основу которой составляют плазмидные вектора, способные передаваться из E. coli в Rhodococcus при коньюгации. Разработанная система открывает новые возможности для конструирования штаммов родококков, в том числе клонирование генов, введение их в клетки разных видов родококков, интеграцию генов в хромосому, введение мутантных алелей в хромосому путем замещение аллелей гена в хромосоме.

4. Осуществлено клонирование локуса хромосомы штамма М8, контролирующего катаболизм нитрилов. Секвенирование, компьютерный поиск гомологии, и функциональный анализ позволили установить основные элементы генетической организации НГ локуса: структурные гены двух субъединиц ИГ (nhmB и nhmA) и 0RF3 с неизвестной функцией составляют единый оперон. Ген амидазы в штамме М8, в отличие от изученных ранее штаммов, не входит в состав этого оперона и не обнаружен в областях, фланкирующих гены НГ. Общий для НГ и AM регуляторный ген, nhmC, контролирующий индукцию обоих ферментов, локализован на растоянии 2 тпн от гена НГ. Таким образом, особенностью НГ локуса в штамме М8 является отсутствие оперонной организации: гены НГ, АМ и регуляторные гены представляют собой единый регулон, обеспечивающий индуцибельное координированое образование двух ферментов НГ и, А М, вовлеченных в деградацию нитрилов.

5. Показано, что синтез ферментов утилизации нитрилов в штамме R. rhodochrous М8 подвержен глюкозной репрессии, тем самым, впервые продемонстрировано наличие у родококков углеродной катаболитной репрессии. Отсутствие в штамме М8 фосфотрансферазной системы для транспорта Сахаров (глюкозы и фруктозы), а также отсутствие эффекта сАМР на репрессию свидетельствует, что механизмы катаболитной репрессии у родококков отличаются от таковых у энтеробактерий и бацилл.

6. Установлено, что основными элементами регуляции синтеза ферментов НГ и АМ являются: координированная индукция обоих ферментов, вызываемая амидами, кобальт-зависимая регуляция НГ, углеродная катаболитная репрессия и репрессия аммонием. Продемонстрировано, что все эти системы регулируют НГ активность на транскрипционном уровне.

7. С помощью оптимизации условий индукции и отбора мутантов уровень НГ активности штамма М8 повышен в 9000 раз, что позволило разработать на его основе промышленные биокатализаторы для получения амидов. Полученный новый биокатализатор МЗЗ по уровню активности превышает все известные в мире аналоги и используется в настоящее время для производства акриламида в России и Южной Корее. Вследствие широкой субстратной специфичности биокатализатор МЗЗ является универсальным катализатором для получения алифатических, ароматических и гетероциклических амидов из соответствующих цианосоединений.

8. Разработан биотехнологический способ получения акриламида на основе созданных биокатализаторов. Основными преимуществами нового способа являются высокое качество акриламида, прямое получение 50% растворов, которые без дополнительной очистки и концентрирования могут использоваться для полимеризации, экологическая безопасность и низкая себестоимость продукции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Важнейшим результатом представленной работы является создание новых типов биокатализаторов и развитие на их основе современного биотехнологического процесса получения акриламида. Практика промышленного использования этого процесса дала доказательства значительных преимуществ разработанной технологии по сравнению с традиционно используемой. При этом главными преимуществами процесса являются: высокое качество продукта, экологическая чистота, малая энергоемкость и низкие капитальные затраты на освоение. Высокое качество акриламида, полученного биотехнологическим методом, позволяет получать всю гамму полимеров, применяемых сегодня для очистки питьевой воды и сточных вод, для нефтедобычи, производства бумаги. Процесс получения акриламида с помощью биокатализа является первым примером в России использования биотехнологий в крупномасштабной химии.

Работа по созданию новых биокатализаторов опиралась на изучение природного разнообразия микробных нитрилгидратаз и на детальные исследования метаболизма нитрильных соединений у родококков. Большое разнообразие природных ферментов свидетельствовало о перспективности дальнейшего поиска новых нитрилгидролизующих ферментов среди природных изолятах. Расширение круга биогеоцинозов для выделения нитрилутилизирующих бактерий позволило продемонстрировать, что доминирующей группой бактерий, обладающих способностью утилизировать нитрилы, являются бактерии из рода Ккоёососсиз. Следует отметить, что родококки обладают значительными преимуществами для их использования в качестве биокатализаторов, Родококки устойчивы к стрессовым факторам, обладают значительной механической прочностью, их клетки не разрушаются в ходе трансформации. Поэтому именно из родококков был выбран штамм, который в конечном счете стал основой для создания промышленных биокатализаторов.

Комплексный подход к изучению утилизации нитрилов в штамме К. гкос1оскгои$ М8 позволил выявить основные элементы регуляции синтеза ферментов НГ и АМ-ключевых ферментов для получения амидов из нитрилов. Нами было установлено, что основными элементами регуляции являются координированная индукция, вызываемая амидами, кобальт-зависимая регуляция НГ, углеродная катаболитная репрессия и азотная репрессия. Впервые было продемонстрировано, что в штамме М8 все эти системы регулируют НГ активность на транскрипционном уровне. Изучение влияния кобальта позволило обнаружить принципиально новый механизм регуляции НГ. Ионы кобальта, входящие в состав простетической группы фермента, усиливали транскрипцию гена НГ в.

105 штамме М8. Такой механизм регуляции позволяет блокировать образование НГ уже на ранней стадии, если в среде отсутствуют необходимые условия для активности фермента. Такой механизм регуляции является эффективным в случае металло-зависимых ферментов.

Ряд особенностей образования НГ и АМ в клетках М8-необычный механизм индукции, в котором роль индуктора выполняет продукт реакцииамид, а не субстраткобальт-зависимый синтез НГкатаболитная репрессия, а также значительные различия в уровне синтеза НГ и АМ, несмотря на координированную индукцию, позволяют рассматривать НГ/АМ ферментную систему штамма М8 в качестве удобной модели для изучения систем регуляции у родококков.

Штамм R. rhodochrous М8 и особенно его мутант МЗЗ в условиях индукции накапливают в клетках значительные количества белка НГ (до 40% от всех растворимых белков). Причем следует обратить внимание, что такой высокий урожай достигается не за счет увеличения копийности генов. Ген НГ присутствует к клетке в одной копии. При индукции НГ наблюдается мощная транскрипция генов НГ с индуцибельного сильного промотора. Таким образом, штаммы М8 и МЗЗ и их регуляторная система синтеза НГ могли бы использоваться для суперпродукции различных внутриклеточных ферментов. Сконструированные в настоящей работе оригинальные вектора и разработанные методы клонирования генов, их переноса между штаммами, замещения аллелей свидетельствуют о том, что это задача является реальной.

Таким образом, настоящая работа не только ввела штамм R. rhodochrous М8 в круг промышленных бактерий, но и создало предпосьшки для превращения этого штамма в модельный объект для изучения генетики и физиологии родококков.