Направленный поиск и фармокологические свойства веществ с антиоксидантной активностью среди конденсированных и неконденсированных производных бензимидазола

Актуальность проблемы. Свободнорадикальное окисление играет важную роль как в нормальной жизнедеятельности клеток, так и в развитии патологического процесса [Моругова Т.В., Лазарева Д. Н., 2000; Бульон В. В. и др., 2006]. Избыточная продукция свободных радикалов и (или) нарушение функционирования антиоксидантной системы рассматриваются в качестве одних из наиболее значимых факторов патогенеза старения [Голубев А.Г., 2003; Арутю-нян А.В., Козина Л. С., 2009; Golden T.R. et al., 2002], сердечно-сосудистых заболеваний [Неверов И.В., 2001; Капелько В. И., 2003; Ланкин В. З. и др., 2004; Ковалева О. Н. и др., 2005; Tardif J.C., 2005], бронхолегочной патологии [Фар-хутдинов У.Р., Фархутдинов P.P., 2000; Камышников B.C., 2003], заболеваний печени [Девяткина Т.А. и др., 2003; Камышников B.C., 2003], нейродегенера-тивных заболеваний [Федин А.И., 2002; Дзюба А. Н., Сорокин Ю. Н., 2004; Ка-тунина Е.А., 2005; Bonnefont-Rousselot D. et al., 2000; Buhmann С. et al., 2004], ишемии мозга и поражения нейронов [Зозуля Ю.А. и др., 2000; Спасов А. А. и др., 2003; Бизенкова М. Н. и др., 2006], сахарного диабета и его сосудистых осложнений [Балаболкин М.И., Клебанова Е. М., 2000; Бардымова Т. П. и др., 2006; Vincent A.M. et al., 2004] и т. д.

Важную роль в клинической практике играют антиоксидантные средства, способные поддерживать структурный гомеостаз организма в условиях патологии [Шанин Ю.Н., 2003; Меньшикова Е. Б. и др., 2008; Gutterjdge J.M.C., Halliwell В.Н., 2000; Guerra E.J., 2001]. Однако, несмотря на широкий спектр препаратов для подавления реакций свободнорадикального окисления, возникают проблемы, связанные с использованием существующих средств, такие как токсичность некоторых фенольных антиоксидантов, вытеснение эндогенных антиоксидантов при использовании синтетических соединений и т. д. [Окови-тый C.B., 2003; Шанин 1СШ., 2003; Лукк М. В. и др., 2008]. В связи с этим является актуальным поиск новых антиоксидантных веществ, на основе которых могут быть созданы лекарственные препараты для лечения заболеваний, сопровождающихся избыточной активацией процессов пероксидации.

Производные бензимидазола имеют я-электронноизбыточную структуру, что позволяет предполагать наличие у них антиоксидантной активности [Ав-дюнина Н.И., 1979; Пожарский А. Ф., 1985; Анисимова В. А. и др., 1996]. На протяжении ряда лет на кафедре фармакологии и в НИИ фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета широко исследуются различные виды биологической активности данного класса соединений, в том числе показана их способность ингибировать свободнорадикальные реакции [Спасов A.A., 1983; Островский О. В., 1996; Косолапов В А., 2005]. Учитывая вышесказанное, были проведены поиск новых высокоактивных антиоксидант-ных веществ среди конденсированных и неконденсированных производных бензимидазола и изучение их влияния на процессы пероксидации при различных патологических состояниях.

Диссертационная работа выполнена в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения» (№ государственной регистрации 1 200 116 045), является составной частью научно-исследовательской программы «Поиск, разработка и фармакологическое изучение веществ, проявляющих антиоксидантные свойства» (№ государственной регистрации 1 200 609 434), включенной в план НИР Волгоградского государственного медицинского университета. Тема работы утверждена на заседании Учёного Совета Волгоградского государственного медицинского университета (протокол № 8 от 20.04.2007 г.).

Целью настоящего исследования являлся направленный поиск высокоактивных антиоксидантных соединений в ряду конденсированных и неконденсированных производных бензимидазола с последующим детальным изучением влияния наиболее активных веществ на процессы пероксидации и доклиническим исследованием их специфической активности на различных патологических моделях.

Для достижения указанной цели представлялось необходимым решить следующие задачи:

1. Провести прогноз наличия высокоактивных антиоксидантных веществ среди ранее неиспытанных соединений из ряда конденсированных и неконден-сированных производных бензимидазола, а также изучить антиоксидантные и антирадикальные свойства веществ, отобранных при проведении прогноза, и препаратов сравнения на моделях in vitro.

2. Определить зависимость действия изучаемых соединений на свободно-радикальные процессы от их химических структур и физико-химических свойств.

3. Исследовать механизмы действия наиболее активных веществ и препаратов сравнения на различные звенья свободнорадикальных процессов на моделях in vitro.

4. Изучить острую токсичность наиболее активных соединений, рассчитать их терапевтический индекс и выбрать наиболее эффективные вещества для доклинического изучения их специфической активности.

5. Исследовать защитное действие наиболее активных соединений и препаратов сравнения на различных моделях острой гипоксии.

6. Изучить противоишемические свойства наиболее активных веществ и препаратов сравнения на модели ишемии головного мозга путем билатеральной окклюзии сонных артерий.

7. Исследовать влияние наиболее активных соединений и препаратов сравнения на процессы перекисного окисления липидов и активность ферментов антиоксидантной системы, а также их гемореологические свойства при билатеральной окклюзии сонных артерий с контролируемой гипотензией.

8. Изучить влияние наиболее активных веществ и препаратов сравнения на показатели перекисного окисления липидов и активность ферментов антиоксидантной системы, а также их защитное действие в отношении Р-клеток поджелудочной железы в условиях стрептозотоциновой интоксикации.

Научная новизна. Впервые для новых оригинальных химических соединений из ряда конденсированных и неконденсированных производных бензимидазола был проведен прогноз уровня антиоксидантной активности в программном комплексе «Микрокосм» 4.2 с последующим экспериментальным изучением антиоксидантных и антирадикальных свойств веществ, выбранных на основе прогноза. Обнаружено, что наиболее активными являются производные^{-замещенных} пирроло[1,2-а]бензимидазолов, а также N9-пиперидиноэтильные производные имидазо[1,2-а]бензимидазолов, имеющие в качестве радикала R2 фенил, замещенный фенил (п-оксифенил, 4-фторфенил, 3,4-дихлорфенил) или а-нафтил. В ходе выявления взаимосвязи между действием изучаемых веществ на свободнорадикальные процессы и их физико-химическими свойствами были установлены параметры, детерминирующие наличие выраженных антиоксидантных свойств у производных бензимидазола, что позволило дать рекомендации по направленному синтезу высокоактивных антиоксидантных соединений. Были исследованы механизмы действия наиболее активных веществ, относящихся к ряду производных пирроло[1,2-а]бензимидазолов, под лабораторными шифрами РУ-642 и РУ-643 на различные звенья свободнорадикальных процессов in vitro и установлена их наибольшая эффективность в отношении липопероксильного радикала и (в высоких концентрациях) стабильного свободного радикала 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил. Впервые были обнаружены противогипоксические и противо-ишемические свойства у нового высокоактивного и умеренно токсичного анти-оксидантного вещества РУ-642, а также его способность нормализовать гемо-реологический статус организма при ишемии головного мозга с последующей реперфузией и проявлять защитное действие в отношении (З-клеток поджелудочной железы при интоксикации стрептозотоцином. Доказано, что в основе эффективности исследуемого соединения в условиях данных патологий лежит антиоксидантный механизм его действия.

Научно-практическая значимость работы. Прогноз уровня антиокси-дантной активности в программном комплексе «Микрокосм» 4.2 с последующей экспериментальной проверкой может быть эффективно использован для целенаправленного поиска новых гетероциклических производных с высокой антиоксидантной активностью. Полученные данные свидетельствуют о целесообразности поиска ингибиторов перекисного окисления липидов среди производных пирроло[1,2-а]бензимидазолов. На основании выявленной зависимости антиоксидантной активности изучаемых соединений от их физико-химических параметров были даны рекомендации по оптимизации поиска субстанций в аналогичных рядах веществ и направленному синтезу эффективных антиокси-дантных соединений. Получены данные о наличии у вещества РУ-642 противо-гипоксических и противоишемических свойств, обнаружена его способность снижать количество продуктов перекисного окисления липидов, повышать активность ферментов антиоксидантной системы и улучшать реологические параметры крови при ишемии головного мозга с последующей его реперфузией, а также уменьшать образование продуктов перекисного окисления липидов, увеличивать активность антиоксидантных ферментов и проявлять протекторное действие в отношении р-клеток поджелудочной железы в условиях интоксикации стрептозотоцином. Выраженное защитное действие соединения РУ-642 при различных патологических состояниях, сопровождающихся активацией сво-боднорадикальных процессов, определяет перспективность проведения дальнейших фармакологических и токсикологических исследований данного вещества.

Реализация результатов исследования. Прогноз уровня антиоксидантной активности в программном комплексе «Микрокосм» 4.2 с последующей экспериментальной проверкой используется на кафедре фармакологии и в НИИ фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета для целенаправленного поиска высокоактивных антиоксидантных веществ среди новых конденсированных и неконденсированных производных бензимида-зола. Выявленные закономерности между химическими структурами изученных производных бензимидазола и их способностью ингибировать процессы перекисного окисления липидов принимаются во внимание при синтезе новых антиоксидантных соединений в НИИ физической и органической химии Южного федерального университета, а также в экспериментальной работе лаборатории органического синтеза НИИ фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета. Результаты работы используются в лекционных курсах на кафедрах фармакологии, химии, фармакологии и биофармации ФУВ Волгоградского государственного медицинского университета, на кафедре фармакологии Ростовского государственного медицинского университета.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Производные Ы1-замещенных пирроло[1,2-а]бензимидазолов являются перспективным классом соединений в плане поиска новых веществ, способных ингибировать процессы перекисного окисления липидов.

2. Прогноз уровня антиоксидантной активности производных бензимида-зола в программном комплексе «Микрокосм» 4.2 с последующей экспериментальной проверкой позволяет оптимизировать поиск высокоактивных антиок-сидантных соединений среди веществ данного ряда.

3. Наиболее выраженную антиоксидантную активность среди новых конденсированных и неконденсированных производных бензимидазола проявляют производные К1-замещенных пирроло[1,2-а]бензимидазолов, а также №-пиперидиноэтильные производные имидазо[1,2-а]бензимидазолов, имеющие в качестве радикала Яг фенил, замещенный фенил (п-оксифенил, 4-фторфенил, 3,4-дихлорфенил) или а-нафтил. К физико-химическим параметрам, детерминирующим наличие выраженных антиоксидантных свойств у производных бензимидазола, относятся: молекулярная рефракция ароматического цикла молекулы вещества > 45,90- 22,48 < молекулярная рефракция радикала Ыз < 30,83- липофильность ароматического цикла молекулы вещества > 2,47- 1,41 < липо-фильность радикала Яз < 2,20- суммарный заряд радикала 13.1 > 0,076- -0,062 < суммарный заряд радикала Я3 < -0,004.

4. Производное КГ1 -замещенных пирроло[1,2-а]бензимидазолов соединение РУ-642 превосходит по условному терапевтическому индексу антиоксидантной активности, полученной на модели аскорбат-зависимого перекисного окисления липидов, остальные исследуемые производные бензимидазола, а также препараты сравнения тролокс, дибунол и мексидол. Вещество РУ-642 эффективнее мексидола на различных моделях острой гипоксиине уступает ему по выраженности противоишемических свойствоказывает большее, чем препарат сравнения липоевая кислота, защитное действие при интоксикации стрептозотоцином, что является предпосылкой для дальнейших расширенных фармакологических исследований данного соединения.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на ХП-ХШ Региональных конференциях молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2007;2008 гг.) — 65−67-й итоговых научных конференциях студентов и молодых ученых Волгоградского государственного медицинского университета (Волгоград, 2007;2009 гг.) — Пятой Российской конференции «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2008 г.).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 17 работ (из них две — в центральной печати).

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на 213 страницах машинописного текста, иллюстрирована 40 рисунками и 50 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (главы 2−4), обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего 159 отечественных и 46 зарубежных источников.

190 ВЫВОДЫ.

1. Производные 1Ч1-замещенных пиррол о [1,2-а]бензимидазолов являются перспективным классом веществ в плане поиска новых соединений, способных ингибировать процессы перекисного окисления липидов. В ходе изучения ан-тиоксидантной активности новых бензимидазольных веществ в ряду производных Ы1-замещенных пирроло[1,2-а]бензимидазолов все соединения (6/6) оказались высокоактивными. При этом 33,3% веществ (2/6) превосходили по активности тролокс, дибунол и мексидол, 16,7% веществ (1/6) — дибунол и мексидол, 50% веществ (3/6) — мексидол. Среди производных М9-замещенных имида-зо[1,2-а]бензимидазолов доля высокоактивных соединений составила 33,3% (7/21). При этом 9,5% веществ (2/21) превосходили по антиоксидантным свойствам дибунол и мексидол, 61,9% веществ (13/21) — мексидол.

2. Прогноз уровня антиоксидантной активности у новых конденсированных и неконденсированных производных бензимидазола с помощью программного комплекса «Микрокосм» 4.2 с последующей экспериментальной проверкой позволил оптимизировать поиск высокоактивных антиоксидантных соединений среди веществ данного ряда.

3. Антиоксидантные свойства бензимидазольных соединений усиливаются при наличии в их структуре пиррольного кольца. Присутствие пиперидино-этильного радикала в положении № гетероцикла производных имидазо[1,2-а]бензимидазолов в сочетании с фенилом, замещенным фенилом (п-оксифенилом, 4-фторфенилом, 3,4-дихлорфенилом) или а-нафтилом в качестве Ы2 приводит к появлению высокой антиоксидантной активности у веществ данного ряда. Изучение зависимости антиоксидантных свойств исследуемых соединений от их физико-химических параметров методом подструктурного анализа позволило выявить признаки, детерминирующие высокую антиоксидант-ную активность у данного класса веществ.

4. Наиболее высокую антиоксидантную активность проявили производные 1Ч1-замещенных пирроло[1,2-а]бензимидазолов вещества РУ-642 и РУ-643, относящиеся к классу умеренно токсичных соединений (3 класс). Вещество РУ.

642 с условным терапевтическим индексом антиоксидантной активности, полученной на модели аскорбат-зависимого перекисного окисления липидов, 4517,5 превосходило по данному параметру препараты сравнения тролокс (2457,3), дибунол (701,0) и мексидол (3,9).

5. Вещество РУ-642 проявило выраженные защитные свойства в условиях острой гипобарической гипоксии, превосходя по величине ЕД50 (0,055 мг/кг) препарат сравнения мексидол (14,22 мг/кг). При гемической, гистотоксической и гиперкапнической в гермообъеме острых гипоксиях соединение РУ-642 в дозе 0,176 мг/кг увеличивало продолжительность жизни животных на 74,1- 73,9 и 27,0% по отношению к контролю соответственно и было эффективнее мекси-дола в дозе 122,4 мг/кг (17,3- 48,4 и 21,9%).

6. Вещество РУ-642 (0,176 мг/кг) в условиях ишемии головного мозга, вызванной перевязкой сонных артерий, повышало выживаемость животных на 12,5% в течение всего опыта (мексидол в дозе 122,4 мг/кг проявил сходный эффект на 2-е и 3-й сутки после операции) — увеличивало двигательную активность крыс в актометре, превосходя по эффективности мексидол, а также горизонтальную и поисковую активности в тесте «открытое поле», несколько уступая препарату сравнения по влиянию на горизонтальную активностьснижало, также как и мексидол, выраженность неврологических нарушений.

7. На модели ишемии головного мозга с последующей его реперфузией соединение РУ-642 снижало содержание малонового диальдегида в плазме крови и мозговой ткани на 34,9 и 26,8% соответственно, не уступая мексидолу (31,6 и 27,0%), а также повышало активность супероксиддисмутазы на 52,4 и 32,7% по отношению к ишемии в плазме крови и мозге соответственно, превосходя по эффективности препарат сравнения (47,4 и 27,9%). Исследуемое вещество уменьшало индекс агрегации эритроцитов на 7,0% относительно ишемии, незначительно превосходя по гемореологическим свойствам мексидол (6,6%), а также индекс агрегации тромбоцитов и максимальный наклон агрега-тограммы на 33,1 и 80,1% соответственно (мексидол — на 28,2 и 71,0%).

8. При интоксикации стрептозотоцином вещество РУ-642 в дозе 26,6 мг/кг оказывало выраженное позитивное влияние на состояние крыс в виде повышения выживаемости до 100%, уменьшения потребления воды, увеличения потребления корма и массы тела, тенденции к снижению уровня глюкозы в плазме крови и моче, а также кетоновых тел в моче. Липоевая кислота (10 мг/кг) была менее эффективна по влиянию на данные показатели. В указанной дозе исследуемое соединение снижало уровень малонового диальдегида на 46,8- 69,5- 45,7 и 35,4% в плазме крови, поджелудочной железе, сердце и почках соответственно, а также увеличивало активность супероксиддисмутазы в плазме крови, поджелудочной железе и сердце на 36,1- 62,2 и 47,0% относительно стрептозотоциновой интоксикации соответственно. Липоевая кислота в дозе 10 мг/кг была менее эффективна и уменьшала содержание малонового диальдегида на 40,3 и 24,5%, а также повышала активность супероксиддисмутазы на 31,8 и 36,4% в плазме крови и поджелудочной железе соответственно.

9. При интоксикации стрептозотоцином вещество РУ-642 в дозе 26,6 мг/кг увеличивало процентное соотношение площади, занимаемой (З-клетками, к общей площади панкреатического островка с 3,0 ± 1,5 до 59,2 ± 9,6, тогда как препарат сравнения (10 мг/кг) оказывал менее выраженное протекторное действие в отношении {3-клеток поджелудочной железы.

4.4.

Заключение

.

В результате проведенных исследований установлено, что новое производное ТчГ'-замещенных пирролло[1,2-а]бензимидазолов вещество РУ-642 обладает выраженными противогипоксическими свойствами в условиях острой ги-побарической гипоксии и превосходит по величине ЕД50 препарат сравнения мексидол. Изучаемое соединение продемонстрировало защитное действие на модели острой гемической гипоксии, превосходя по активности мексидол, и на модели острой гистотоксической гипоксии, не уступая препарату сравнения по антигипоксическим свойствам. Однако, при гипоксии с гиперкапнией в гермо-объеме противогипоксический эффект вещества РУ-642, также как и эффект мексидола, оказался умеренным.

При изучении противоишемической активности соединения РУ-642 была отмечена его способность повышать выживаемость животных, улучшать их двигательную и поведенческую активности и восстанавливать неврологический дефицит в условиях ишемии головного мозга, вызванной билатеральной окклюзией сонных артерий. Следует отметить, что по проявленным на данной модели защитным свойствам соединение РУ-642 не уступало мексидолу.

Исследуемое вещество при ишемии головного мозга с последующей его реперфузией уменьшало проявления перекисных процессов, снижая концентрацию МДА в плазме крови и мозговой ткани, и не уступало по эффективности мексидолу. Соединение РУ-642 оказалось эффективнее препарата сравнения по способности повышать активность СОД и ГП в плазме крови и мозге в условиях ишемически-реперфузионного повреждения головного мозга.

Вещество РУ-642 оказывало стабилизирующее действие на вязкость крови и функциональную активность тромбоцитов при ишемии-реперфузии головного мозга, превосходя мексидол по антиагрегантному эффекту.

Изучение защитного действия соединения РУ-642 при интоксикации стрептозотоцином показало, что данное вещество повышает выживаемость животных, способствует нормализации веса, потребления воды и корма и превосходит по эффективности препарат сравнения липоевую кислоту в эквимоляр-ной ей дозе.

Соединение РУ-642 эффективно снижает содержание МДА в плазме крови и органах, особенно в поджелудочной железе, крыс со стрептозотоциновой интоксикацией. При введении исследуемого вещества наблюдалась нормализация показателей антиоксидантного статуса организма. Так, активность СОД увеличивалась в плазме крови и поджелудочной железе, а также имелась тенденция к повышению активности СОД в сердце и почках и ГП в плазме крови и исследуемых органах. Защитное действие липоевой кислоты в условиях исследуемой патологии было менее выраженным.

Наконец, вещество РУ-642 оказалось способным снижать цитотоксиче-ское действие стрептозотоцина на р-клетки поджелудочной железы, в то время как препарат сравнения подобного эффекта не продемонстрировал.

Таким образом, новое производное пирролло[1,2-а]бензимидазола вещество РУ-642 обладает широким спектром биологической активности, что, по-видимому, связано с его способностью вступать в реакции СРО и уменьшать выраженность патологических процессов, сопровождающихся их активацией.

ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Свободнорадикальное окисление является необходимым звеном метаболизма [Моругова Т.В., Лазарева Д. Н., 2000; Журавлева Т. Д. и др., 2003]. Однако, чрезмерное образование СР приводит к активации ПОЛ и соответственно к дезинтеграции биологических мембран, дефициту АТФ, подавлению энергозависимых реакций в клетках, окислению SH-групп ферментов, инактивации глу-татиона и дезорганизации нуклеиновых кислот и белков [Бульон В.В. и др., 2006]. Предотвращение избыточной активации процессов СРО осуществляется благодаря наличию специальной АОС, основу которой составляет комплекс веществ энзимной и неферментативной природы [Поварова О.В. и др., 2003; Румянцева С. А. и др., 2006]. В настоящее время установлено, что возникновение и развитие широкого круга заболеваний сопровождается нарушениями деятельности своеобразной функциональной системы ПОЛ-АОС [Федин А.И., 2002; Оковитый С. В., 2003]. В связи с этим являются актуальными поиск и фармакологическое изучение антиоксидантных средств для лечения ряда патологических состояний, сопровождающихся избыточной активацией процессов пероксидации.

На кафедре фармакологии и в НИИ фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета было установлено, что производные бензимидазола проявляют антиоксидантную активность [Островский О.В., 1996; Косолапов В. А., 2005]. Наличие антиоксидантных свойств у веществ данного ряда обусловлено тем, что они обладают определенной л—избыточностью и могут быть донорами электронных пар, не являющихся частью ароматической 7г-системы [Пожарский А.Ф., 1985], а, следовательно, ингибировать свободно-радикальные процессы. Так, структура производных имидазо[1,2-а]бензимидазолов имеет 14 л-электронную систему и две пары неспаренных электронов на орбиталях, перпендикулярных тс-системе. Производные пирро-ло[1,2-а]бензимидазолов обладают еще более выраженной л-избыточностью [Авдюнина Н.И., 1979], в связи с чем антиоксидантные свойства у веществ данного ряда усиливаются.

В целях оптимизации поиска высокоактивных антиоксидантных соединений среди новых конденсированных и неконденсированных производных бен-зимидазола был использован компьютерный прогноз антиоксидантной активности с помощью программного комплекса «Микрокосм» 4.2 [Васильев П.М., 2006]. При этом из 100 неиспытанных веществ, содержащихся в существующей в Волгоградском государственном медицинском университете компьютерной базе данных по бензимидазолам, для исследования были выбраны 27 соединений под лабораторными шифрами «РУ». Отобранные вещества принадлежат к двум классам производных бензимидазола: производные 1Ч9-замещенных ими-дазо[1,2-а]бензимидазолов (21 соединение) и производныезамещенных пир-роло[1,2-а]бензимидазолов (6 соединений).

Установлено, что в ряду производных И1-замещенных пирроло[1,2-а]бензимидазолов все 6 соединений были высокоактивными. При этом 33,3% веществ (2/6) превосходили по активности тролокс, дибунол и мексидол, 16,7% веществ (1/6) — дибунол и мексидол, 50% веществ (3/6) — мексидол. В то же время среди производных^{-замещенных} имидазо[1,2-а]бензимидазолов только 33,3% соединений (7/21) проявили высокую антиоксидантную активность. При этом 9,5% веществ (2/21) превосходили по антиоксидантным свойствам дибунол и мексидол, 61,9% веществ (13/21) — мексидол.

Таким образом, антиоксидантные свойства бензимидазольных соединений усиливаются при наличии в их структуре пиррольного кольца, в то время как замена пиррольного кольца на имидазольное приводит к уменьшению исследуемого вида активности. Полученные данные согласуются с представлениями о значении определенной л-избыточности для проявления веществами антиоксидантных свойств.

Отдельные радикалы в различных положениях гетероцикла могут усиливать донорно-акцепторные свойства производных бензимидазола. Исследование зависимости антиоксидантной активности веществ от различных заместителей в их структуре показало, что присутствие пиперидиноэтильного радикала в положении N9 гетероциклического кольца производных имидазо[1,2 а]бензимидазолов в сочетании с фенилом, замещенным фенилом (п-оксифенилом, 4-фторфенилом, 3,4-дихлорфенилом) или а-нафтилом в качестве R2 приводило к появлению выраженных антиоксидантных свойств у соединений данного ряда. Активность производных N1-замещенных пирроло[1,2-а]бензимидазолов была высокой и не зависела от характера заместителя в положении N1 гетероцикла. Однако, большинство веществ среди данного ряда имели фенильный и замещенный фенильный (4-хлорфенильный, 4-метоксифенильный) радикалы у 9-го и 8-го атомов углерода соответственно.

При изучении зависимости антиоксидантных свойств исследуемых соединений от их физико-химических параметров методом подструктурного анализа были выявлены признаки, детерминирующие высокую антиоксидантную активность у соединений данного ряда: молекулярная рефракция ароматического цикла молекулы вещества > 45,90- 22,48 < молекулярная рефракция радикала R3 < 30,83- липофильность ароматического цикла молекулы вещества > 2,47- 1,41 < липофильность радикала R3 < 2,20- суммарный заряд радикала Ri > 0,076- -0,062 < суммарный заряд радикала R3 < -0,004. Это обстоятельство позволит прогнозировать антиоксидантные свойства новых веществ среди производных бензимидазола.

Прогноз уровня антиоксидантной активности новых производных бензимидазола с помощью программного комплекса «Микрокосм» 4.2 с последующей экспериментальной проверкой позволил оптимизировать поиск высокоактивных антиоксидантных соединений и выбрать наиболее активные вещества под лабораторными шифрами РУ-642 и РУ-643 для дальнейшего детального изучения их антиоксидантных и антирадикальных свойств на моделях in vitro.

В ходе изучения возможных молекулярных механизмов действия отобранных производных N1-замещенных пирроло[1,2-а]бензимидазолов на сво-боднорадикальные процессы были обнаружены следующие закономерности.

Соединения РУ-642 и РУ-643 обладали наибольшей эффективностью в отношении липопероксильного радикала, ингибируя Ре2±индуцированную XJI липидов, были менее активны в отношении радикалов люминола и АФК (преимущественно супероксида) в модельной системе с аутоокислением люминола, а также радикала АБТС в методе окисления АБТО (рис. 37−38).

Способность изучаемых веществ подавлять образование пероксильного радикала в ходе термического разложения АБАП была незначительной и проявлялась только в концентрации 100 мкмоль/л.

В отношении стабильного свободного радикала ДФПГ исследуемые соединения в концентрации 1 мкмоль/л оказались неактивными, однако, повышение концентрации до 100 мкмоль/л приводило к полному обесцвечиванию раствора ДФПГ*.

Препараты сравнения значительно уступали соединениям РУ-642 и РУ-643 по способности ингибировать реакцию аскорбат-зависимого ПОЛ (рис. 3940). Кроме того, тролокс в меньшей степени тормозил реакцию окисления АБТС*, а дибунол в концентрации 1 мкмоль/л терял активность в отношении данного радикала.

Рис. 37. Активность вещества РУ-642 в концентрации 1 мкмоль/л на моделях изучения антиоксидантных и антирадикальных свойств, % ингибирования реакции.

Обозначения: * - данные статистически значимы (0 по отношению к контролю, р<0,05.

АФК 2,24.

ПОЛ.

АБТО 11,23*.

ГОО-0,00 аоо*.

34,01*.

ДФПГ-0,00.

АФК 9,16.

Рис. 38. Активность вещества РУ-643 в концентрации 1 мкмоль/л на моделях изучения антиоксидантных и антирадикальных свойств, % ингибирования реакции.

Обозначения: * - данные статистически значимы (/) по отношению к контролю, р<0,05.

Рис. 39. Активность тролокса в концентрации 1 мкмоль/л на моделях изучения антиоксидантных и антирадикальных свойств, % ингибирования реакции Обозначения: * - данные статистически значимы (/) по отношению к контролю, р<0,05.

ПОЛ.

АФК 41,58*.

ПОЛ.

100/к 38,16*.

АБТО 0,00 ДФПГ-3,25.

LOO 67,11*.

Рис. 40. Активность дибунола в концентрации 1 мкмоль/л на моделях изучения антиоксидантных и антирадикальных свойств, % ингибирования реакции Обозначения: * - данные статистически значимы (?) по отношению к контролю, р<0,05.

Выраженные антиоксидантные и антирадикальные свойства в сочетании с умеренной токсичностью (LU5o=792 мг/кг) позволили выбрать новое производное N1-замещенных пирроло[1,2-а]бензимидазолов соединение РУ-642 для дальнейшего исследования его специфической активности на патологических моделях, сопровождающихся активацией свободнорадикальных процессов, -гипоксии, ишемических повреждений головного мозга, интоксикации стрепто-зотоцином.

Гипоксия и ишемия составляют основу патогенетических механизмов многих острых и хронических заболеваний [Скороход A.A., 2004; Лукк М. В. и др., 2008].

Гипоксия приводит к комплексной модификации функций биологических мембран, затрагивающей как липидный бислой, так и мембранные ферменты. Основными причинами этого явления служат энергодефицит и активация на его фоне фосфолиполиза и ПОЛ. Последнее стимулируется в результате подавления активности антиоксидантных систем из-за распада и торможения синтеза их белковых компонентов [Коваль И.В. и др., 2008]. В связи с этим одним из основных направлений коррекции гипоксических состояний является защита клеточных структур от СРО с помощью антиоксидантных средств [Бизенкова М.Н. и др., 2006].

Полученные на различных моделях острой гипоксии данные позволили выявить выраженное антигипоксическое действие нового производного N1-замещенных пирроло[1,2-а]бензимидазолов соединения РУ-642, обладающего выраженными антиоксидантными свойствами в экспериментах in vitro. Так, исследуемое вещество в дозе 0,176 мг/кг увеличивало продолжительность жизни животных на 160,27 (р<0,05) — 74,13- 73,88 (р<0,05) и 26,96 (р<0,05) % по отношению к контролю при ОГБГ, ОГеГ, ОГТГ и гипоксии с гиперкапнией в гермо-объеме соответственно. В то же время препарат сравнения мексидол в дозе 122,4 мг/кг повышал время жизни мышей на 182,14 (р<0,05) — 17,30- 48,40 (р<0,05) и 21,86% в тех же условиях. Десятии стократное увеличение дозы вещества РУ-642 на модели ОГБГ привело к возрастанию его противогипокси-ческого эффекта. При расчете величины ЕД50 было выявлено значительное превосходство исследуемого соединения (ЕД50=0,055 мг/кг) над мексидол ом (ЕД5о=14,22 мг/кг) на данной модели. Наиболее вероятно, что в основе обусловленного веществом РУ-642 повышения резистентности организма животных к острой гипоксии лежит торможение свободнорадикальных процессов.

Известно, что активация процессов СРО и угнетение АОС сопровождают эпизоды ишемии и постишемический период [Зозуля Ю.А. и др., 2000; Спасов A.A. и др., 2003; Бизенкова М. Н. и др., 2006]. Особенно чувствительны к недостатку кислорода клетки центральной нервной системы. Являясь строгим аэробом, они способны функционировать без кислорода всего несколько минут, после чего начинаются необратимые структурные изменения, приводящие к их гибели [Власова И.Г., Торшин В. И., 2004; Скороход A.A., 2004]. Последние могут иметь место не только при остром дефиците кислорода, но и возникать в период реоксигенации. В основе этих изменений лежит токсический эффект кислорода, содержание которого в крови, притекающей к мозгу после его длительной ишемии, становится избыточным. На фоне повреждения систем утилизации кислорода и дефицита антиоксидантов происходит усиление процессов ПОЛ, что приводит к еще более серьезным нарушениям в деятельности мозга [Болдырев A.A., 2001]. В этих условиях очевидна целесообразность использования антиоксидантных средств, способных защитить мозговую ткань от ише-мического повреждения [Гусев Е.И., Скворцова В. И., 2002; Суслина З. А., Максимова М. Ю., 2004; Румянцева С. А. и др., 2009].

При изучении защитных свойств соединения РУ-642 в условиях ишемии головного мозга, вызванной перевязкой сонных артерий, была выявлена его способность увеличивать выживаемость животных, улучшать их двигательную и поведенческую активности, восстанавливать неврологический дефицит. Так, под действием исследуемого вещества отмечалась тенденция к повышению выживаемости на 12,5% относительно ишемии в течение всего опыта, в то время как мексидол проявил сходный эффект только на 2-е и 3-й сутки.

Способность соединения РУ-642 оказывать долгосрочный противоише-мический эффект чрезвычайно важна, так как истощение антиоксидантных систем и активное накопление продуктов ПОЛ происходят при длительной ишемии мозга [Kessiova М. et al., 2006; Atahan Е., 2007].

Вещество РУ-642 увеличивало двигательную активность животных в 6,3 (р<0,05) — 5,6 и 4,5 раз по отношению к ишемии в 1-е, 2-е и 3-й сутки после перевязки сонных артерий соответственно. Мексидол оказывал менее выраженное защитное действие ив 1-е, 2-е и 3-й сутки после операции повышал двигательную активность крыс в 3,1- 4,6 и 1,6 раз относительно ишемии соответственно.

Введение

вещества РУ-642 сопровождалось статистически значимым увеличением горизонтальной (на 80,69 и 190,38% по отношению к ишемии в 1-е и 2-е сутки опыта соответственно) и поисковой активности (на 300,0% по отношению к ишемии на 2-е сутки после операции) животных в тесте «открытое поле». Мексидол несколько превосходил исследуемое вещество по влиянию на горизонтальную активность, статистически значимо увеличивая ее на 228,56 и.

182,79% относительно ишемии на 2-е и 3-й сутки опыта соответственно, а также обладал способностью увеличивать поисковую активность животных в данном тесте, но данные являлись статистически незначимыми.

При оценке неврологического статуса ишемизированных животных по суммарной 12-ти балльной системе под действием соединения РУ-642 отмечалась тенденция к уменьшению проявлений неврологического дефицита в 1 -е и 3-й сутки исследования на 8,47 и 11,11% по отношению к ишемии соответственно. Мексидол в 1-й день исследования несколько превосходил по эффективности вещество РУ-642, снижая выраженность неврологического дефицита на 22,03% относительно ишемии, но к 3-му дню его защитное действие полностью исчезало.

Исследование неврологического статуса животных с ишемией головного мозга по шкале Stroke-index McGrow (в модификации И.В. Ганнушкиной) позволило выявить уменьшение выраженности неврологических нарушений на 57,65 (р<0,05) — 29,17- 63,51 и 90,23% по отношению к ишемии в 1-е, 3-й, 7-е и 14-е сутки опыта соответственно на фоне введения соединения РУ-642. Мексидол снижал выраженность неврологической симптоматики на 29,85- 79,63 (р<0,05) — 85,14 (р<0,05) и 67,44% относительно ишемии в 1-е, 3-й, 7-е и 14-е сутки после операции соответственно.

В настоящее время накоплен значительный объем экспериментальных данных, свидетельствующих о сложной перестройке мозгового метаболизма в условиях острой и хронической ишемии, приводящей к активации свободнора-дикальных процессов и гибели нейронов [Гусев Е.И., Скворцова В. И., 2001; Карнеев А. Н. и др., 2006]. В то же время имеется тесная положительная корреляционная связь между сосудистой мозговой недостаточностью и нарушениями в когнитивной сфере, изменениями оптико-пространственного восприятия, расстройствами психической деятельности и т. д. [Рыжак Г. А. и др., 2003; Никифоров А. С. и др., 2004; Романова Г. А., Шакова Ф. М., 2006]. Таким образом, можно предположить, что в основе улучшения выше описанных показателей под действием вещества РУ-642 лежит устранение негативных сдвигов в системе.

ПОЛ-АОС.

С целью выяснения механизма противоишемического действия соединения РУ-642 была использована модель ишемии головного мозга с последующей его реперфузией. При этом исследуемое вещество при профилактическом введении оказывало нормализующее действие на показатели ПОЛ, не уступая по эффективности мексидолу, и антиоксидантный статус организма, превосходя по активности препарат сравнения.

Так, у животных с патологией, получавших соединение РУ-642, содержание МДА в плазме крови и мозговой ткани снижалось на 34,88 и 26,77 (р<0,05) % по отношению к ишемии соответственно. Мексидол продемонстрировал сходную активность, уменьшая данный показатель на 31,61% в плазме крови и на 27,01% (р<0,05) относительно ишемии в мозге.

Исследуемое вещество статистически значимо повышало активность СОД на 52,35 и 32,68% по отношению к ишемии в плазме крови и головном мозге соответственно. Препарат сравнения был менее эффективен и в плазме крови увеличивал активность фермента на 47,41% (р<0,05), в мозговой ткани — на 27,87% относительно ишемии.

Введение

соединения РУ-642 способствовало повышению активности ГП на 21,43 и 86,87% по отношению к ишемии в плазме крови и головном мозге соответственно, однако, данные являлись статистически незначимыми. Мексидол не оказывал влияния на активность фермента в плазме крови, но вызывал ее увеличение в мозговой ткани на 47,86% относительно ишемии.

Известно, что роль активации ПОЛ и дефицита АОС в патогенезе ишемии мозга определяется их участием в изменении реологии крови, в формировании системных мембранопатий с нарушением структурно-функциональных свойств эритроцитов, тромбоцитов, эндотелия сосудов [Шилов A.M. и др., 2008]. Ухудшение деформируемости эритроцитов на фоне интенсификации ПОЛ затрудняет диффузию кислорода через мембрану, способствует развитию гипоксии в тканях, агрегации форменных элементов крови и замедлению кровотока, спазму сосудов и нарушению тканевого метаболизма [Плотников М.Б. и др., 1999; Ройтман Е. В. и др., 2001; Шилов A.M. и др., 2008]. Учитывая способность антиоксидантных средств ограничивать этот патологический процесс, были изучены гемореологические свойства вещества РУ-642 в условиях репер-фузии головного мозга после его ишемии.

Исследуемое соединение статистически значимо снижало вязкость крови на 8,80- 9,47- 10,72- 12,24 и 16,26% по отношению к ишемии при скоростях сдвига 300 с" 1, 200 с1, 100 с" 1, 50 с 1 и 20 с" соответственно. Мексидол несколько превосходил вещество РУ-642 по активности, уменьшая показатели вязкости крови при скорости сдвига 300 с" 1 на 12,00%, 200 с" 1 — на 12,59%, 100 с'1 — на 13,65%, 50 с" 1 — на 15,02% и 20 с" 1 — на 18,84% относительно ишемии. Снижение показателей вязкости крови крыс с ишемией-реперфузией головного мозга как при высоких, так и при низких скоростях сдвига свидетельствует о нормализации гемореологического статуса в крупных артериях и артериолах, а также в посткапиллярных венулярных отделах микроциркуляторного русла.

Изучаемое соединение продемонстрировало значительный антиагрегант-ный эффект, превосходя по активности препарат сравнения. Так, при введении вещества РУ-642 индекс агрегации тромбоцитов и максимальный наклон агре-гатограммы статистически значимо снижались на 33,13 и 80,11% относительно ишемии соответственно. Мексидол также уменьшал функциональную активность тромбоцитов, но данные были статистически незначимыми.

Принимая во внимание роль активации свободнорадикальных процессов в гемореологических нарушениях, можно предположить, что гемореологиче-ский эффект соединения РУ-642 обусловлен выраженными антиоксидантными свойствами данного вещества.

В ряде работ показано, что развитие сахарного диабета сопровождается окислительным стрессом с генерацией АФК, истощением запасов эндогенных антиоксидантов и интенсификацией ПОЛ клеточных мембран [Haffner S.M., 2000; Зенков Н. К. и др., 2001; Бардымова Т. П. и др., 2006]. В свою очередь, повреждающее действие свободнорадикальных продуктов на р-клетки поджелудочной железы приводит к нарушению их функции и усугубляет течение сахарного диабета [Балаболкин М.И. и др., 2002; Колесниченко Л. С. и др., 2009]. Учитывая роль процессов пероксидации при сахарном диабете, было проведено изучение защитного действия соединения РУ-642 при профилактическом применении в условиях интоксикации стрептозотоцином.

Протекторный эффект исследуемого вещества при стрептозотоциновой интоксикации проявлялся прежде всего в виде повышения выживаемости животных. Так, соединение РУ-642 в дозах 0,176 и 1,76 мг/кг увеличивало выживаемость крыс на 25,0 и 66,75% соответственно. При введении доз 8,8 и 26,6 мг/кг выживаемость достигала 83,3 и 100,0% соответственно. В то же время липоевая кислота в дозе 10 мг/кг повышала выживаемость животных только на 25,0% относительно патологии.

Выраженное позитивное влияние на состояние животных со стрептозотоциновой интоксикацией вещество РУ-642 оказывало в дозе 26,6 мг/кг: уменьшало потребление воды на 65,31% (р<0,05) — увеличивало потребление корма и массу тела на 40,74 (р<0,05) и 10,48% соответственноснижало уровень глюкозы в плазме крови и моче на 20,54 и 22,28% соответственно, а также кетоновые тела в моче — на 52,22% по отношению к патологии. Препарат сравнения в дозе 10 мг/кг был менее эффективен по влиянию на данные показатели и снижал потребление воды на 7,14% (р<0,05), увеличивал потребление корма на 20,16% (р<0,05), уменьшал содержание кетоновых тел в моче на 11,11% по отношению к группе животным с интоксикацией стрептозотоцином.

Для подтверждения роли антиоксидантной активности вещества РУ-642 в реализации его защитного действия при интоксикации стрептозотоцином изучалось влияние данного соединения на интенсивность ПОЛ и активность антиоксидантных ферментов. При этом исследуемое вещество статистически значимо снижало уровень МДА: в плазме крови — на 25,59- 26,35- 26,47 и 46,75% в дозах 0,176- 1,76- 8,8 и 26,6 мг/кг соответственнов поджелудочной железе — на 59,50- 62,92 и 69,49% в дозах 1,76- 8,8 и 26,6 мг/кг соответственнов сердцена 45,66% в дозе 26,6 мг/кгв почках — на 33,62 и 35,39% относительно стрептозотоциновой интоксикации в дозах 8,8 и 26,6 мг/кг соответственно. Липоевая кислота статистически значимо уменьшала содержание МДА только в плазме крови и поджелудочной железе на 40,25 и 24,52% по отношению к патологии соответственно.

Под действием соединения РУ-642 в дозах 1,76- 8,8 и 26,6 мг/кг активность СОД в плазме крови статистически значимо повышалась на 27,95- 28,85 и 36,11% по отношению к патологии соответственно. В поджелудочной железе отмечалось увеличение активности фермента на 41,94% (р<0,05) при введении изучаемого вещества в дозах 0,176 и 1,76 мг/кг и на 51,15% (р<0,05) и 62,21% (р<0,05) при использовании доз 8,8 и 26,6 мг/кг соответственно. Статистически значимое изменение активности СОД в сердце (повышение на 47,03% относительно стрептозотоциновой интоксикации) наблюдалось при введении соединения РУ-642 в дозе 26,6 мг/кг. Липоевая кислота существенно увеличивала активность фермента только в плазме крови и поджелудочной железе на 31,78% (р<0,05) и 36,41% (р<0,05) соответственно.

Под действием соединения РУ-642 во всех изучаемых дозах наблюдалась тенденция к повышению активности ГП в плазме крови и исследуемых органах, в то время как при введении липоевой кислоты активность фермента в плазме крови и почках оставалась без изменений.

Принимая во внимание тот факт, что токсическое действие АФК способствует деструкции и гибели Р-клеток поджелудочной железы, было проведено исследование защитного действия вещества РУ-642 в отношении Р-клеток поджелудочной железы при интоксикации стрептозотоцином. В результате в поджелудочной железе крыс, которым вводили изучаемое соединение в дозах 8,8 и 26,6 мг/кг, площадь, занимаемая р-клетками, статистически значимо увеличивалась в 4,6 и 19,7 раз по отношению к патологии соответственно. Липоевая кислота оказывала менее выраженное протекторное действие в отношении р~ клеток поджелудочной железы в условиях интоксикации стрептозотоцином.

Учитывая важную роль процессов ПОЛ в патогенезе сахарного диабета, можно предположить, что именно антиоксидантные свойства вещества РУ-642 лежат в основе его позитивного влияния при развитии стрептозотоциновой интоксикации.

Таким образом, в результате прогноза уровня антиоксидантной активности новых конденсированных и неконденсированных производных бензимида-зола с помощью программного комплекса «Микрокосм» 4.2 с последующей экспериментальной проверкой было установлено, что производные 1ЧГ1-замещенных пирроло[1,2-а]бензимидазолов, а также №-пиперидиноэтильные производные имидазо[1,2-а]бензимидазолов, имеющие в качестве радикала Я2 фенил, замещенный фенил (п-оксифенил, 4-фторфенил, 3,4-дихлорфенил) или а-нафтил, обладают выраженными антиоксидантными свойствами. Наиболее активные вещества под лабораторными шифрами РУ-642 и РУ-643, относящиеся к производным Ы'-замещенных пирроло[1,2-а]бензимидазолов, особенно эффективны в отношении липопероксильного радикала, менее активны в отношении радикалов люминола и супероксида, а также АБТС. В концентрации 100 мкмоль/л указанные соединения подавляют образование пероксильного радикала в ходе термического разложения АБАП и полностью обесцвечивают раствор ДФПГ*.

При исследовании фармакологического действия вещества РУ-642 было установлено наличие у данного соединения выраженных противогипоксиче-ских свойств, что выражалось в его способности увеличивать продолжительность жизни животных в условиях острой гипоксии различного генеза: гипоба-рической, гемической, гистотоксической и гиперкапнической в гермообъеме. В то же время препарат сравнения мексидол проявил антигипоксическую активность в значительно больших дозах. Подобная закономерность отмечалась и при изучении противоишемических свойств вещества РУ-642. При этом исследуемое соединение оказывало защитное действие в условиях ишемии головного мозга, повышая выживаемость животных, нормализуя их локомоторную активность, поведение и неврологический статус, и не уступало по активности мек-сидолу.

Введение

вещества РУ-642 и мексидола на фоне ишемии головного мозга с последующей его реперфузией сопровождалось нормализацией показателей ПОЛ, антиоксидантного и гемореологического статуса организма. Изучение защитного действия соединения РУ-642 при интоксикации стрептозотоци-ном показало, что данное вещество повышает выживаемость животных, способствует нормализации их веса, потребления ими воды и корма, а также в дозе 26,6 мг/кг имеет тенденцию к снижению уровня глюкозы в плазме крови и моче и кетоновых тел в моче.

Введение

изучаемого производного пирроло[1,2-а]бензимидазола в дозах 8,8 и 26,6 мг/кг сопровождалось увеличением площади, занимаемой р-клетками, в поджелудочной железе животных с патологией. В то же время липоевая кислота не продемонстрировала достаточной активности на данной модели. Снижение количества продуктов ПОЛ и увеличение активности антиоксидантных ферментов под действием вещества РУ-642 позволили объяснить его эффективность в условиях данной патологии.

Учитывая выраженное защитное действие вещества РУ-642 при различных патологических состояниях, сопровождающихся нарушениями деятельности системы ПОЛ-АОС, можно считать перспективным дальнейшее изучение фармакологических и токсикологических свойств данного соединения.