Поиск и изучение иммунологических маркеров opisthorchis felineus и исследование возможности их использования для иммунодиагностики описторхоза

Актуальность проблемы.

Ежегодно в мире умирает от инфекционных и паразитарных болезней более 17 миллионов человек [1]. По официальной статистике в России в последнее пятилетие ежегодно регистрируется до 70 тысяч случаев заболеваний людей гельминтозами. В структуре этих инвазий около 97% составляют гельминтозы, возбудители которых развиваются с участием пресноводных и морских гидробионтов. Промысловые рыбы, ракообразные, моллюски, земноводные, пресмыкающиеся, и продукты их переработки, реализуемые в стране, являются потенциальными носителями 27 видов гельминтов, представляющих опасность для человека. Наиболее эпидемиолого-эпизоотически значимыми из них являются возбудители описторхоза, дифиллоботриозов, а также эндемичных трематодозов Дальнего Востока (клонорхоз, метагонимоз, нанофиетоз, парагонимоз) [2, 3].

Описторхоз — широко распространенное в России природно-очаговое заболевание [4, 5]. На территории России из печеночных паразитических трематод наибольшее распространение имеет Ор18ЛогсЫз /еМпеш. Этим паразитом в Европейской части России инфицировано приблизительно 0,02−0,1% всего населения. Данные выборочных эпидемиологических исследований показывают, что на территории высокоэндемичных районов Сибири поражено до 85−90% всего взрослого населения. Количество страдающих от этой инвазии людей только в этих районах может быть оценено в пределах 2−10 миллионов человек. Описторхозтяжелое паразитарное заболевание человека и животных. Основными патогенетическими механизмами являются токсическо-аллергическое воздействие гельминтов и продуктов их жизнедеятельности на организм человека, а также механическое повреждение тканей печени с последующим развитием симптомокомплекса, связанного с поражением печени, желчевыводящих протоков, желчного пузыря и поджелудочной железы. Инвазия способствует проникновению бактериальных и вирусных инфекций в биллиарную систему, возникновению хронического восходящего гепатита, камней в желчевыводящих протоках и протоках поджелудочной железы. Прогноз развития заболевания усугубляется возможным развитием холангиокарцином и изменениям нейроэндокринной регуляции [6, 7, 8, 9]. Г.

Описторхоз широко распространен во многих странах мира, особенно в Юго-Восточной Азии. В этом районе заболевание вызывается близкородственными гельминтами Opisthorchis viverrini и Clonorchis sinensis (китайский описторхоз). Возбудитель описторхоза — О. viverrini отнесен Международным агентством по исследованию рака к первой группе канцерогенов человека. Аналогичные онкогенные свойства имеются и у близкородственного O. felineus [10, 8]. В Западной Сибири, в высокоэндемичных районах по описторхозу, регистрируется самый высокий уровень заболеваний раком желчных протоков и гепатокарциномой [2]. Для некоторых стран описторхоз является типичной вновь возникающей инвазией, и поэтому особенно важен своевременный эпидемиологический контроль над этими печеночными гельминтами как в эндемичных так и в неэндемичных районах [11].

В иммунодиагностике паразитарных заболеваний достигнуты значительные успехи благодаря последним достижениям в таких областях, как культивирование патогенных паразитов in vitro, внедрение новых методов получения и очистки иммунодиагностических реагентов, использование в качестве диагностических реагентов моноклональных антител (МКА) [12]. Это позволяет усовершенствовать имеющиеся и разрабатывать новые альтернативные высокоспецифичные и чувствительные методы иммуноанализа, которые способны обнаруживать незначительные количества патогенов или их маркеров в физиологических жидкостях и выделениях.

В настоящее время иммунодиагностика описторхоза, вызываемого Opisthorchis felineus, страдает низкой чувствительностью и специфичностью из-за недостаточной изученности свойств этого паразита. Диагностические наборы для выявления специфических при описторхозе антител содержат в качестве антигена соматические фракции гельминта, имеющие невысокую удельную концентрацию специфических антигенов паразита, вследствие чего обладают низкой диагностической ценностью. Поэтому главной задачей разработчиков иммунодиагностикумов является отладка принципиального звена системы — этапа связывания антиген-антитело. Кроме того, несомненно, перспективным направлением в совершенствовании диагностики описторхоза является выявление маркерных антигенов паразита в физиологических жидкостях и выделениях. Проблема создания новых альтернативных способов диагностики таких опасных для человека паразитарных инфекций как описторхоз, имеет особое, принципиальное значение для современного здравоохранения.

Цель работы и задачи исследования.

Основной целью исследования явились поиск и изучение иммунологических маркеров половозрелой трематоды О./еИпет, а также создание иммунодиагностических систем для определения специфических антигенов и антител в клиническом материале.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

• изучение специфических свойств половозрелой печеночной трематоды О./еИпет и ее основных антигенных фракций;

• определение иммунологических маркеров половозрелого паразита О./еИпет и изучение их свойств;

• получение моноклональных антител к маркерным антигенам О./еИпеиь и изучение их свойств;

• исследование перекрестной активности антигенов О./еИпет и ряда гельминтов — паразитов человека с использованием гомологичных и гетерологичных поликлональных антисывороток и моноклональных антител;

• оптимизирование стандартной системы непрямого-ИФА для выявления специфических антител при описторхозе, вызываемом О./еИпеш, с использованием МКА;

• разработка альтернативной системы для диагностирования маркерных антигенов О./еИпет в физиологических жидкостях и выделениях.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В результате проделанной научной работы:

• получены и охарактеризованы антигены половозрелой печеночной трематоды О./еИпет',.

• впервые определены для человека белки-маркеры при описторхозе, вызываемом О./еИпет'. р105 и р74, р70, рбб;

• впервые создана и охарактеризована панель мышиных гибридом-продуцентов МКА к основным антигенам О./еИпет, среди которых основную долю составляют МКА к основному иммуногену р105 кДа экскреторно-секреторного антигена печеночной трематоды О./еНпеш,.

• с использованием МКА и иммунных человеческих сывороток на ультраструктурном уровне изучены гистоиммунохимические свойства половозрелых марит O. felineus, в результате чего определены места локализации основных иммуногенов паразита;

• исследованы перекрестные реакции антигенов O. felineus с другими гельминтами — паразитами человека, показана выраженная перекрестная активность антигенов O. felineus с антигенами O. viverrini, С. sinensis и умеренная с N.salmincolica. Выявлены белки, ответственные за перекрестную активность;

• на основе МКА к белку 105 кДа экскреторно-секреторного антигена O. felineus модифицирована стандартная система непрямого-ИФА для выявления специфических антител, что привело к увеличению чувствительности, специфичности, а также повысило достоверность иммунологического анализа;

• на основе модифицированной МКА системы ИФА впервые разработан иммунодиагностический метод для выявления растворимого антигена печеночной трематоды O. felineus в желчи и кале. Метод позволяет проводить исследование по одному или нескольким доступным физиологическим образцам: желчь, кал, и требует минимальных объемов исследуемых материалов, отбор которых безболезнен и потенциально не опасен. Анализ с использованием МКА-ИФА позволяет обнаруживать незначительные количества маркеров паразитов в физиологических жидкостях и выделениях.

В результате проделанной работы получены весьма обнадеживающие результаты, показывающие перспективность разработанных иммуно диагностических методов для использования в клинических и эпидемиологических исследованиях людей с целью ранней диагностики острого и хронического описторхоза, а также для оценки эффективности лечебно-профилактических мероприятий. Дальнейшее расширение арсенала иммунодиагностических тестов на описторхоз является не только важным диагностическим направлением работы, но и одним из звеньев расширения эпидемиологического надзора, позволяющего контролировать ситуацию по паразитозам на качественно новом уровне.

Апробация работы и публикации.

Материалы диссертации представлены на международном симпозиуме «Тяжелые инфекционные заболевания: эпидемиология, экспресс-диагностика и предупреждение» (Киров, 1997), научной конференции «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск,.

1998) и семинаре перспективных исследований «Оценка спонсируемых биологических исследований в России для нового тысячелетия» (Новосибирск,.

1999). По материалам диссертации опубликовано 5 работ в отечественной печати и тезисы 3 докладов. Получено авторское свидетельство на МКА к р105 экскреторно-секреторному антигену Ор1з&огсЫ$/еИпеш.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста, включая 26 рисунков и 22 таблицы, и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (89 наименований).

выводы.

1. Впервые охарактеризован белковый состав печеночной трематоды O. felineus по антигенным фракциям. Показано, что антигены половозрелой трематоды весьма разнообразны по белковому составу, большинство из белков являются хорошими иммуногенами при активной иммунизации. Впервые обнаружена ограниченность иммунного ответа человека при описторхозе белками 105 кДа экскреторно-секреторного и соматического антигена и 74, 70, 66 кДа яичного антигена.

2. Исследована перекрестная активность основных антигенов O. felineus и ряда гельминтов — паразитов человека Показана выраженная перекрестная активность антигенов O. felineus с антигенами O. viverrini, С. sinensis и умеренная с N.salmincolica. Установлено, что за перекрестное реагирование отвечает белок 100 кДа O. viverrini, 70 и 90 кДа С. sinensis и 76 и 110 кДа N. salmincolica.

3. Впервые получена и охарактеризована панель из 21 мышиной гибридомной линии, стабильно продуцирующей МКА, специфические к O.felineus. МКА к O. felineus, как и иммунные сыворотки человека, лучше взаимодействовали в ИФА с экскреторно-секреторным антигеном, чем с соматическим или яичным. МКА взаимодействующие в иммуноблоттинге с р105 экскреторно-секреторного антигена перекрестно реагировали с теми же белками O. viverrini, С. sinensis и N. salmincolica, что и иммунные сыворотки к O.felineus.

4. С использованием иммунной электронной микроскопии для качественной и количественной иммунолокализации на суборганном уровне антигенов O. felineus, узнаваемых МКА и иммунной сывороткой человека было установлено, что основные иммуногены половозрелого паразита связаны в основном со слизеподобными структурами кишечника, матки и семенника паразита. Ткани гельминта и его поверхностные структуры вызывают слабый иммунный ответ В-клеточной системы человека, а иммунный ответ формируется в основном на продукты экскретоно-секреторной системы паразита.

5. Впервые предложена и апробирована модификация стандартной системы непрямого-ИФА для диагностирования специфических антител при описторхозе. Суть модификации заключается в использовании МКА к р105 иммуногену О./еИпеия в качестве подложки для аффинной очистки на начальной стадии ИФА наиболее специфической фракции антигена О./еМпет, в результате чего повышается её удельная концентрация на поверхности твердой фазы. Предложенная модификация увеличила чувствительность и специфичность системы до 92,68% и 97,50% соответственно по сравнению со стандартной непрямого-ИФА (85,36% и 87,50% соответственно).

6. Впервые разработан новый способ диагностирования маркерного антигена О./еИпет в физиологических образцах (желчь, кал) с использованием модифицированной анти-р105-МКА системы ИФА. Специфичность метода для образцов желчи составила 93,7% при 92% чувствительности, для образцов фекалий 85,71% и 71,42% соответственно.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Автор считает своим долгом поблагодарить своего научного руководителя Валерия Борисовича Локтева за организацию работы и помощь в оформлении диссертации. Автор выражает глубокую признательность Киселеву Николаю Николаевичу за обучение, консультации и техническую поддержку работы. Также автор благодарит Протопопову Елену Викторовну, Перебоева Александра Владимировича и Коновалова Евгения Евгениевича за бескорыстную помощь в работе. Искреннюю благодарность автор выражает Коротченко Людмиле Ивановне, чье трудолюбие и аккуратность способствовали выполнению работы, а также всем сотрудникам отдела молекулярной вирусологии за советы и научные дискуссии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Основной целью исследования явились поиск и изучение иммунологических маркеров половозрелой трематоды О./еИпеая, а также создание иммунодиагностических систем для определения специфических антигенов и антител в клиническом материале.

На первом этапе проводимых исследований наше внимание было сосредоточено на изучение белкового состава половозрелого гельминта и его основных антигенов с целью определения основных маркеров характерных для инвазии О./еИпет. Для детального изучения белкового состава О./еНпеш нами были использованы несколько видов АГ половозрелого паразита: гомогенат марит, метаболический, соматический, экскреторно-секреторный и яичный. Белковый состав основных антигенов половозрелого паразита был исследован методом разделения в полиакриламидном геле и полученные результаты показали, что содержание иммуногенных белков относительно невелико, хотя белковый состав его основных антигенов очень разнообразен. Удельная концентрация высокоиммуногенных белков была максимальной в препаратах метаболитных антигенов: метаболического и Э-С, которые в десятки раз лучше реагирует с иммунными сыворотками в ИФА по сравнению с соматическими антигенами. Соматические АГ обычно используются в коммерческих иммунодиагностикумах и, по-видимому, имеют более низкую концентрацию высокоиммуногенных полипептидов. Полученные результаты показали перспективность использования метаболитных антигенов в иммуноферментных тест-системах для диагностики описторхоза. Антигенные свойства белков половозрелого паразита изучались в иммуноблоттинге с использованием панели полученных нами антисывороток. Различия между спектрами белков, взаимодействующих с гипериммунными и иммунными сыворотками в иммуноблоттинге, свидетельствуют о том, что при естественной инвазии формируется гуморальный иммунный ответ только на ограниченное число белков О./еМпет, а именно 105, 74, 70, 66 кДа полипептидов, как в основных антигенах паразита: гомогенате марит и метаболическом антигене, так и в отдельных видах антигеновр105 в Э-С и соматическом и р74, р70, рбб в яичном АГ. Была обнаруженна ограниченность иммунного ответа человека, которая была связана с р 105. Это отчетливо указало на дальнейшие пути совершенствования иммунодиагностики описторхоза. В коммерческих тест-системах ИФА для определения специфических АТ к О./еМпеш в сыворотке крови человека, в основном, используются препараты соматического АГ с низкой удельной концентрацией белка 105 кДа. Это говорит о неадекватности использования этого вида АГ для диагностических тест-систем и объясняет значительно лучшие результаты с использованием Э-С АГ, так как концентрация белка 105 кДа в нем значительно выше. Таким образом можно предположить, что совершенствование тест-систем должно быть связано с повышением удельной концентрации высокоиммуногенных белков в препаратах АГ для иммунодиагностических систем.

Специфичность иммунодиагностики является важнейшим показателем системы и поэтому возможность выраженного антигенного перекреста должна учитываться исследователями при диагностике паразитарных инфекций, особенно в случае наличия общего ареала обитания гельминтов. Для понимания характера перекрестных специфических взаимодействий O. felineus с другими паразитами человека был исследован белковый состав антигенов некоторых гельминтов паразитов человека: Opisthorchis viverrini, Clonorchis sinensis, Nanophyetus salmincolica, Trichinella spiralis, Echinococcosus granulosus, Echinococcosus multilocularis, Toxocara canis. Электрофоретический анализ показал довольно сложный белковый состав их антигенов. Наличие на электрофореграммах белков с подобным молекулярным весом у некоторых гельминтов дает основание предположить, что эти белки могут выполнять сходную функцию и иметь сходные антигенные свойства. Исследована перекрестная активность антигенов O. felineus и ряда гельминтов, паразитов человека, методом ИФА и иммуноблоттинга с использованием антисывороток к O. felineus и С.sinensis. Была обнаружена выраженная перекрестная активность антигенов O. felineus с антигенами О. viverrini, С. sinensis и умеренная с антигенами N. salmincolica. Степень перекреста, по-видимому, обусловлена видовым сродством, что косвенно подтверждается нашими исследованиями АГ O. felineus, О. viverrini, С. sinensis и литературными данными по перекрестной реактивности АГ гельминтов, полученными разными группами исследователей. Взаимодействие АГ паразитов с гетерологичными иммунными сыворотками O. felineus установило сходство антигенных свойств метаболитов этих гельминтов. По данным иммуноблоттинга, за перекрестное реагирование отвечает белок 100 кДа О. viverrini, 70 и 90 кДа С. sinensis и 76 и 110 кДа N. salmincolica.

Следующим этапом было получение МКА на основные иммуногены O.felineus. Нами была получена и охарактеризована уникальная панель из 21 мышиной гибридомной линии, стабильно продуцирующей МКА, специфические к O.felineus. Все МКА, как и иммунные сыворотки человека, лучше взаимодействовали с Э-С АГ, чем с соматическим или яичным. По характеру взаимодействия с антигенами O. felineus в иммуноблоттинге полученные МКА условно разделили на 3 группы: 1) 18 МКА реагировали с белками 105 и 160 кДа соматического и экскреторно-секреторного антигенов и преимущественно с белками 74, 70 и 66 кДа яичного антигена- 2) 2 МКА реагировали с белками 160 кДА соматического и экскреторно-секреторного антигенов и исключительно с белками 74, 70 и 66 кДа яичного антигена- 3)1 МКА реагировало с белками 90, 80, 60 кДа соматического антигена и с белками 85, 74, 66 и 50 кДа яичного антигена, но не обнаружило взаимодействия с экскреторно-секреторным антигеном. Нужно отметить, что МКА, не обнаружившие взаимодействия с Э-С антигеном в иммуноблоттинге, хуже других связывались в ИФА со всеми основными АГ половозрелого паразита, МКА не реагировавшие с р105 Э-С АГ также имели очень низкий уровень связывания в ИФА. С использованием МКА доказана несомненная взаимосвязь белков 105 кДа Э-С, соматического и 66, 70, 74 кДа яичного АГ. Изучена перекрестная активность МКА к O. felineus первой группы с O. viverrini, С. sinensis и N. salmincolica и показано их взаимодействие с белками той же молекулярной массы, что и иммунных сывороток к O.felineus.

Для качественной и количественной локализации на суборганном уровне основных АГ O. felineus, узнаваемых МКА и иммунной сывороткой человека, была использована иммунная электронная микроскопия с визуализацией иммунных комплексов коллоидным золотом. Было установлено, что основные иммуногены половозрелого паразита связаны со слизеподобными структурами матки, семенников и кишечника. Результаты иммунохимического ультраструктурного исследования позволили подтвердить тот факт, что ткани гельминта и его поверхностные структуры вызывают слабый иммунный ответ В-клеточной системы человека, а иммунный ответ формируется в основном на продукты Э-С системы паразита.

Полученные данные по белковому, антигенному и иммуногенному составу O. felineus позволили выявить новые маркеры этой глистной инвазии. Наиболее значимым является высокоиммуногенный для человека белок 105 кДа, который является основным в Э-С антигене гельминта. Получение панели МКА к этому белку создало предпосылки для конструирования новых альтернативных иммунодиагностических систем для выявления этого маркера описторхозной инвазии. С нашей точки зрения, хорошую перспективу имеет модификация стандартных систем непрямого-ИФА анти-р105 МКА для обнаружения антител к 105 кДа белку в сыворотках крови. Обнаружение этого белка как основного маркера в составе экскреторных АГ паразита позволяет использовать анти-р105 МКА для создания макетных иммунодиагностических систем для обнаружения этого антигена в физиологических образцах человека.

Завершающим логическим этапом работы явилась разработка и апробация диагностических систем. Нами впервые предложена и апробирована модификация стандартной ИФА системы для обнаружения специфических к р105 антител при описторхозе. Суть модификации заключается в использовании анти-р105 МКА к О./е/шеш1 на начальной стадии ИФА в качестве подложки для аффинной очистки белка 105 кДа, как наиболее иммуногенного для человека специфического антигена О./еНпет, В результате этого повышается его удельная концентрация на поверхности твердой фазы, что в конечном итоге должно было привести к повышению чувствительности и специфичности иммуноферментного теста, а также уменьшению времени анализа образцов. Было показано, что специфический комплекс МКА-АГ полностью сохраняет способность взаимодействия с анти-описторхозными АТ сыворотки крови человека и надежно фиксируется на твердой фазе сорбированными МКА. Предложен и отработан новый диагностический критерий, связанный со сравнением значения оптической плотности образца на специфическую и неспецифическую фракции. Анализ полученных данных по применению альтернативного диагностического критерия в стандартной и модифицированной МКА системе показали несомненную их перспективность.

Предложенные модификации системы позволили сократить время проведения анализа образцов, увеличили чувствительность и специфичность системы до 92,68% и 97,50% соответственно по сравнению со стандартной непрямой-ИФА системой (85,36% и 87,50% соответственно). Все это позволяет сделать вывод, что предлагаемый способ тестирования маркерных АТ в сыворотках с использованием модификации подложкой из специфического комплекса МКА-АГ может быть широко использован для клинической диагностики и серо-эпидемиологических исследований при описторхозе. Метод обладает повышенной чувствительностью и специфичностью по сравнению со способом прототипом. Более высокие индексы достоверности результатов и достоверности самой модифицированной МКА системы показывают, что предлагаемый способ диагностирования описторхоза обладает существенно более высокой диагностической достоверностью, чем прототип непрямой-ИФА. Модификация с использованием высокоспецифичных МКА к О./еМпет позволяет дополнительно выявлять отдельные случаи заболевания, которые не определяются в непрямом варианте ИФА. Модифицированная система может быть рекомендована для использования в клинической диагностики и сероэпидемиологических исследований при описторхозе.

Одна из особенностей иммунного ответа на описторхоз заключается в характерном низком уровне специфических АТ в период хронической фазы заболевания, но титр АТ держится достаточно продолжительное время, что исключает повторное тестирование для оценки результатов лечения обычно в течение года. Поэтому традиционный анализ описторхоза основанный на обнаружении специфических АТ, в лучшем случае, можно рассматривать как метод предварительной лабораторной диагностики. Этих недостатков лишен способ иммуноанализа, связанный с регистрацией специфических АГ в физиологических жидкостях и выделениях больных. Вышеуказанные соображения подтолкнули нас на разработку новых альтернативных способов диагностирования O.felineus. За основу мы взяли разработанную нами систему сэндвич-ИФА с использованием подложки анти-р105 МКА. Сконструированная иммунодиагностическая система на основе МКА для выявления АГ O. felineus обладала чувствительностью порядка 0,5−1 нг/мл Э-С АГ и была использована для выявления р105 АГ в желчи или кале больных описторхозом людей. Было установлено, что концентрация р 105 АГ в клинических образцах желчи и кала от больных людей составляет 10−2000 нг/мл и 30−500 нг/мл, соответственно. Хотя пока нам не удалось непосредственно связать эти показатели с количеством гельминтов, которые могут находиться у исследуемого, мы имеем данные, которые показывают, что взрослый гельминт, культивируемый in vitro, может секретировать до 5000 нг растворимого АГ ежедневно. Перенося эти результаты по продукции паразитом АГ на in vivo и учитывая, что Э-С АГ секретируемый в желчь может обычно разводиться в 1:500−1:1000 в кале взрослого человека. Можно оценить нижний предел чувствительности 5-Юнг/мл/паразит как нижний предел детекции системы.

Таким образом, нами впервые разработан новый альтернативный способ диагностирования маркерного антигена O. felineus в физиологических образцах (желчь, кал) с использованием МКА к белку 105 кДа O.felineus. Специфичность этого метода для образцов желчи составила 93,7% при 92% чувствительности, для образцов фекалий 85,71% и 71,42% соответственно. В противоположность стандартному методу непрямого ИФА он имеет перспективы использования в клинических и эпидемиологических исследованиях как для ранней диагностики острого и хронического описторхоза, так и для оценки эффективности лечебно-профилактических мероприятий. Таким образом, метод позволяет свести к минимуму названные ограничения в оценке диагноза и достоверно поставить его без привлечения опытных, квалифицированных паразитологов и микроскопистов. Анализ с использованием МКА позволяет обнаруживать незначительные количества маркеров паразитов в физиологических жидкостях и выделениях. Способ позволяет использовать доступные образцы, требует минимальных объемов исследуемых материалов. Отбор диагностического материала безболезнен и потенциально не опасен. Дальнейшее расширение арсенала иммунодиагностических тестов на описторхоз является не только важным диагностическим направлением работы, но и одним из звеньев расширения эпидемиологического надзора позволяющего контролировать ситуацию на качественно новом уровне.