Получение и использование магнитных частиц для стабилизации белков в водно-органических смесях: На прим. 
моноклон. 
антител и ?-химотрипсина

В последние несколько десятилетий внимание многих исследователей в области белковой химии и энзимологии сконцентрировано на проблеме стабилизации белков, главным образом ферментов и антител, в системах, содержащих полярные органические растворители. Интерес к стабильности белков в системах водаполярный органический растворитель вызван перспективностью широкого применения таких систем для решения прикладных задач, таких как: проведение ферментативных реакций с участием гидрофобных субстратов и эффекторов, иммуноанализ и аффинная очистка соединений, нерастворимых и плохо растворимых в воде Также, проблема функционирования белков в водно-органических смесях актуальна с фундаментальной точки зрения. За годы исследований в этой области разработан ряд подходов, направленных на повышение устойчивости белков к инактивирующему и денатурирующему действиям органических растворителей. За годы исследований в области неводной белковой химии разработан целый ряд подходов, направленных на повышение стабильности белков в системах «вода — смешивающийся с водой органический растворитель». Разработанный подходы можно условно разделить на две группы: Первая — эта группа методов стабилизации, позволяющих сохранить гомогенность системы. К этой группе методов относятся введение в систему различных аддитивов, таких как полиэлектролиты и хаотропные агенты и химическая модификация белковой глобулы [1]. «Гомогенные» методы крайне удобны в фундаментальных исследованиях, например для прояснения роли воды в биокатализе, выявления данных о взаимосвязи структуры и функциональных свойств ферментов путем перехода к различным формам надмолекулярной организации биокатализаторов, не реализующимся в водных растворах. Основным недостатком таких систем является сложность разделения белка и реакционной среды.

Вторая группа методов — эта «гетерогенные» методы. Отличительной чертой этих методов является пространственное разделение белка и реакционной среды. Одним из наиболее часто применяемых таких приемов является иммобилизация на разного рода носителях. При всех очевидных преимуществах этого подхода он имеет ряд существенных недостатков. Зачастую проведению реакций в гетерогенных системах мешают диффузионные ограничения. Уменьшение размеров носителей для увеличения скоростей протекания реакций приводит к усложнению отделения белков от реакционной среды. Таким образом, весьма актуальной представляется разработка методов стабилизации белков, позволяющих объединить преимущества как гомогенных, так и гетерогенных методов.

Одним из возможных путей решения этой проблемы является иммобилизация белков на мелкодисперсных магнитных носителях. Иммобилизация белков приводит к фиксации их активной конформации и повышению устойчивости к инактивации под действием органического растворителявысокая дисперсность частиц позволяет избежать диффузионных ограничений при взаимодействии антитела с антигеноммагнитная восприимчивость дает возможность быстро перевести систему из микрогетерогенного (псевдогомогенного) состояния в истинно гетерогенное (твердая фаза и оптически прозрачный супернатант).

В данной работе мы предлагаем методы синтеза мелкодисперсных магнитных носителей для иммобилизации белков с целью стабилизации в водно-органических смесях и демонстрируем возможность использования таких систем в практических приложениях.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Белки в водно-органических смесях.

Литературные данные по поведению антител в системах «вода-смешивающийся с водой органический растворитель» крайне разрознены. Поэтому свойства природных полипептидов в водно-органических средах будут в основном рассмотрены на примере другого класса белков — ферментов, для которых накоплен существенно больший экспериментальный материал. Ферменты во многом аналогичны антителам, поскольку также являются макромолекулами связывающими лиганды, в данном случае называющиеся субстратами. Как и антитела, ферменты имеют специализированный участок — активный центр, в котором происходит связывание субстрата, предшествующее его химическому превращению.

Каталитические свойства ферментов характеризуются двумя основными параметрами: константой скорости ферментативной реакции (ккат) и эффективной константой связывания субстрата (Кт). Последняя по своему физическому смыслу аналогична константе связывания антигена с антителом.

Взаимодействия белков с органическими растворителями можно разделить на специфические и неспецифические. Ниже будут рассмотрены оба типа взаимодействия белков с органическими растворителями.

6. выводы.

1. Синтезированы и охарактеризованы по физическим и химическим свойствам магнитные частицы с покрытиями из гидроксиапатита, окиси титана (IV), полиэтиленимина и полиакриламида. Установлено, что все полученные покрытия пригодны для целей иммобилизации белков.

2. Продемонстрировано, что иммобилизация а-химотрипсина на магнитных частицах с гидроксиапатитным и полиакриламидным покрытиями приводит к существенному расширению интервала концентраций органического растворителя, в котором фермент сохраняет высокую каталитическую активность. Это создает предпосылки для использования ферментов, иммобилизованных на магнитных частицах в практических приложениях, например в ферментативном синтезе в неводных средах.

3. Показано, что иммобилизация на магнитных частицах с полиакриламидным покрытием приводит к значительной стабилизации монокпональных антител против циклоспорина А.

4. На основе антител, стабилизированных иммобилизацией на магнитных частицах разработана новая система иммуноанализа циклоспорина, А в водно-органических смесях со значительным содержанием органической компоненты. Статистический анализ и сравнение с результатами твердофазного иммуноферментного анализа и радиоиммуноанализа показывают перспективность использования разработанной аналитической системы в клинической и лабораторной практике.