Изучение экспрессии генов, контролирующих суточные ритмы, в гемопоэтических стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга

Актуальность проблемыЦиркадные (суточные, с периодом около 24 часов) ритмы сформировались в процессе эволюции для синхронизации большинства важнейших функций организма при адаптации к воздействию факторов внешней среды [Губин Г. Д., Герловин Е. LLL, 1980]. Система формирования ритмов у млекопитающих представляется в иерархическом виде: формирование ритмов происходит в нейронах супрахиазматических ядер вентрального гипоталамуса — центральном пейсмейкере, который координируют ритмы в периферических тканях [Reppert S. М., Weaver D. R., 2001]. Однако все больше новых данных свидетельствует в пользу того, что регуляция ритмов специфична для каждой ткани, и во многом определяется особым набором функций, которые ткань выполняет [Cuninkova L., Brown S. А., 2008]. Исследования последних лет показали, что клетки периферических тканей и органов способны генерировать собственные самоподдерживающие ритмы и изменять их соответственно локальным потребностям [Stratmann М., Schibler U., 2006, Моисеева Н. И., 1978].

Молекулярной основой формирования клеточных ритмов являются так называемые «clock» гены, активность которых регулируется по принципу обратной связи самими генами и их продуктами [Toh К. L., 2008]. Clock гены выявлены не только в нейронах супрахиазматических ядер, но и в клетках большинства периферических тканей и органов. Белки, кодируемые этими генами, являются транскрипционными факторами, экспрессия которых координируется в соответствие с клеточными циркадными ритмами. При изменеиии активности транскрипционных факторов может ритмично меняться и экспрессия подконтрольных им генов (clock-controlled genes) и, соответственно, клеточные процессы, этими генами опосредуемые. Масштабный сравнительный анализ суточной экспрессии более 12 000 геновв клетках печени и сердца показал, что активность около 10% исследуемых генов меняется ритмично [Storch К., et al., 2002]. За счет влияние на активность подконтрольных генов clock гены непосредственно участвуют в регуляции многих процессов в клетках. Координация clock генами основных циркадных ритмов организма с локальиыми потребностями периферических тканей позволяет клеткам этих тканей и органов оптимально адаптироваться к местным изменениям окружающей среды [Катинас Г. С., Моисеева Н. И., 1980]. Таким образом, clock гены выполняют важную роль в поддержании клеточного и тканевого гомеостаза [Stokkan К.-А.- et al., 2001].

В кроветворной ткани костного мозга циркадные изменения экспрессии clock генов детально не исследовались. Гемопоэз представлет собой высокодинамичный процесс образования и дифференцировки клеток крови, которые после созревания выполняют разные функции, в том числе иммунную [Петров Р. В., 1987, Сепиашвили Р. И., Балмасова И. П., 2005, Хаитов Р. М., 2006]. Количество клеток каждого типа и скорость их образования при гемопоэзе контролируется индивидуально, в соответствии с меняющимися потребностями, и должны четко координироваться и регулироваться во времени. Изучение молекулярных механизмов формирования ритмов в клетках кроветворной ткани необходимо для понимания регуляции гемопоэза и может дать возможность управлять этим процессом, а потому представляется актуальным.

Из клеток костного мозга, наибольший интерес представляют кроветворные стволовые клетки, которые в течение многих лет являются объектом интенсивных исследований [Петров Р. В. и др., 1972]. Эти клетки, характеризующиеся способностями к самоподдержанию и к дифференцировке [Weissman I. L., et al., 2001], являются наиболее перспективными клетками для использования в терапевтических целях при лечение онкологических заболеваний, дистрофических состояний, и врегенеративной медицине [Cerletti М., et al., 2008]. Циркадные ритмы в стволовых клетках до сих пор не изучались.

Отсутствие работ в данной области связано прежде всего с методическими сложностями изучения этих клеток. Стволовые клетки составляют очень небольшой процент (<0.1 — 0.01%) клеток костного мозга [Wcissman I. L., 2000], и выделить за короткий период времени достаточное количество клеток без потери качества РНК для детального молекулярного анализа весьма сложно. Поэтому разработка методики, позволяющей изучать изменения clock генов в высокоочищенных популяциях кроветворных стволовых клеток, является одной из актуальных задач.

Цель работы — изучить активность генов, контролирующих суточные ритмы кроветворения, в стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга мышей и человекасравнить особенности формирования ритмов в кроветворных клетках разной степени дифференцировки.

Основные задачи работы1. Разработать методический подход для исследования экспрессии генов в редких популяциях стволовых клеток лабораторных моделей и человека.

2. Определить экспрессию ключевых генов, контролирующих суточные ритмы (clock генов), в кроветворных стволовых клетках мышей. Сравнить относительные уровни экспрессии clock генов в популяции этих клеток и в общей популяции клеток костного мозга.

3. Изучить изменение активности clock генов в течение суток в общей популяции клеток костного мозга мышей и очищенной популяции стволовых клеток.

4. Провести сравнительный анализ особенностей формирования суточных ритмов в популяциях кроветворных клеток разной степени дифференцировки.

5. Оценить экспрессию ключевых clock генов в изолированной популяции стволовых клеток и клеток-предшественников и в общей популяции клеток костного мозга человека.

6. Изучить изменение активности clock генов в течение суток в изолированных кроветворных стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга человека.

Научная новизнаВпервые выявлена активность ключевых clock генов mPerl, тРег2, mCryl, mBmall, mClock и mRev-erb, а в кроветворных стволовых клетках костного мозга. Установлено, что изменения активности большинства clock генов в стволовых клетках не координируется циркадными ритмами. Полученные данные расширяют представления о биологии стволовых клеток.

Представлено экспериментальное подтверждение гипотезы о том, что формирование ритмов происходит в процессе дифферепцировки клеток. Выявленные достоверные различия в суточных изменениях активности clock генов в популяциях кроветворных клеток разной степени дифференцировки указывают на то, что регуляция ритмов в костном мозге зависит от степени зрелости клеток.

Показано, что регуляция ритмов в кроветворной ткани характеризуется особенностями, отличными от других тканей и органов. Установлено, что в кроветворных клетках отсутствует циркадные ритмы в изменениях активности Bmall, одного из ключевых регуляторов циркадных ритмов в периферических тканях. Полученные данные свидетельствуют об особом механизме формирования ритмов гемопоза и обосновывают необходимость его дальнейшего изучения.

Впервые определена экспрессия ключевых clock генов в кроветворных клетках костного мозга человека и изучены изменения активности этих геновв изолированных стволовых клетках и клетках-предшественниках человека. Выявлены ритмы в изменении суточной экспрессии трех ключевых clock генов: hPerl, hPer2 и hCry2. Полученные новые знания о системе формирования циркадных ритмов гемопоэза у человека создают предпосылки для дальнейшего развития и оптимизации методов использования стволовых клеток и клеток-предшественников с терапевтической целью.

Теоретическая и практическая значимостьРазработан новый методологический подход для изучения формирования суточных ритмов в редких популяциях кроветворных стволовых клеток, сочетающий использование высокоскоростной проточной цитометрической сортировки и метод количественной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени. Показано, что высокоскоростная сортировка клеток не вызывает деградации РНК и не влияет на экспресиию генов. Использование данного подхода позволило впервые изучить организацию системы контроля суточных ритмов в кроветворных стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга у мышей и человека. Обосновано применение разработанной методики для исследования стволовых клеток других видов.

Методика внедрена в лаборатории клинической иммунологии АНО «Институт иммунофизиологии» (г. Москва) и используется для исследования стволовых клеток и клеток-предшественников костного мозга.

Полученные в работе данные дают представление о молекулярных основах формирования ритмов в кроветворной ткани млекопитающих. Показаны особенности регуляции ритмов в изолированных популяциях стволовых клеток костного мозга. Установлено, что формирование циркадных ритмов в кроветворной ткани зависит от степенидиффференцировки клеток. Обосновано, что регуляция суточных ритмов в кроветворной ткани отличается от других периферических тканей и органов. Новые данные о формировании ритмов кроветворения у человека вносят теоретический вклад в эту малоизученную область хронобиологии.

Результаты работы используются в лекционных курсах программы первичной специализации и сертификации кадров по специальности клинико-лабораторная диагностика на кафедре аллергологии и иммунологии ФПК MP ГОУ ВПО «Российский Университет Дружбы Народов».

Положения, выносимые на защиту1. Высокоскоростная проточно-цитометрическая сортировка в сочетании с количественной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени является оптимальным методом для изучения внутриклеточных циркадных ритмов в редких популяциях кроветворных стволовых клеток. Сортировка не вызывает деградацию выделяемой РНК и не влияет на экспрессию генов. Предложенная методика может эффективно применяться для изучения стволовых клеток других видов.

2. В стволовых клетках костного мозга мышей экспрессируются все ключевые clock гены. Относительные уровни экспрессии этих генов в стволовых клетках отличаются от клеток общей популяции костного мозга, состоящей из более дифференцированных и зрелых клеток. Наиболее существенные различия установлены для mPerl и mCryl.

3. Формирования и регуляции ритмов в кроветворной ткани зависит от степени дифференцировки и зрелости клеток. В кроветворных стволовых клетках мышей не сформированы ритмы в изменении активности большинства clock генов (кроме mPerl).

4. У человека в кроветворных стволовых клетках и в клетках-предшественниках костного мозга суточные изменения активности hPerl, hPer2 и hCry2 подчиняются циркадным ритмам. Система формированияритмов в кроветворной ткани мышей и человека характеризуется видовыми особенностями.

5. Изменения суточной активности Bmall, играющего важную роль в регуляции циркадных ритмов во многих периферических тканях, происходят неритмично в кроветворных клетках разной степени дифференцировки, т. е. на всех этапах гемопоза. Формирование ритмов процесса кроветворения происходит без участия Bmall.

6. Система формирования суточных ритмов в кроветворной ткани млекопитающих, в частности в стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга, отличается от других периферических тканей и органов.

Апробация работыРезультаты исследований по диссертационной работе представлены на российских и международных конференциях и конгрессах: Международном конгрессе по иммунофизиологии (Дагомыс, 2003) — International meeting on advanced flow cytometry (Paris, 2003) — Danish meeting on flow cytometry (Copenhagen, 2004) — Norwegian Stem Cell Network meeting (Rosendal, 2005) — Norwegian Stem Cell Network meeting (Oslo, 2006), International Congress on Stem Cells (Cancun, 2006), Объединенном иммунологическом форуме — 2008 (Санкт-Петербург, 2008) — Международной конференции по физиологии и патологии иммунной системы (Москва, 2008) — Royan International Twin Congress on Regenerative Biomedicine and Stem Cell Biology and Technology (Tehran, 2008).

ПубликацииПо материалам диссертации опубликовано 18 печатных работ (из них 9 — в международной печати), включающих 1 монографию, 1 главу книги, 7журнальных статей и 9 материалов российских и международных конференций.

ФОРМИРОВАНИЕ ЦИРКАДНЫХ РИТМОВ (обзор литературы) Время является фундаментальной составляющей биологических процессов. В процессе эволюции у клеток и многоклеточных организмов развивались механизмы адаптации к циклическим изменениям окружающей среды [Агаджанян Н. А., 1967, Виру А. Л., 1980, Гаркави Д. X. и др., 1990, Павлов И. П., 1951]. Формирование системы, способной регулировать во времени, синхронизировать с действием факторов внешней среды (света, температуры и др.) различные функции организма, создало значительные преимущества при естественном отборе [Казначеев В. П., 1980, Катинас Г. С., Моисеева Н. И., 1980, Комаров Ф. И., Моисеева Н. И., 1983, Моисеева Н. И., 1978, Моисеева Н. И., Сысуев В. М., 1981].

До недавнего времени изучение ритмичных процессов, происходящих на разных уровнях организации живого, в основном сводилось к их описанию [Агаджанян Н. А., 1967, Голиков А. П., Голиков П. П., 1973, Емельянов И. П., 1976]. Однако, значительный прогресс в развитии науки в последние десятилетия позволил получить представление об устройстве внутренних часов, определить их функции и выявить механизмы, регулирующие биологические ритмы [Koukkari W. L., Sothern R. В., 2006, Алпатов А. М., 2000, Губин Г. Д., Герловин Е. Ш., 1980, Деряпа Н. Р. и др., 1985, Дубинины. П., 1976].

Были обнаружены ключевые гены, ответственные за циркадные внутриклеточные ритмы — clock гены, и предложена простая модель, описывающая, как эти гены и кодируемые ими белки формируют и поддерживают внутриклеточные циркадные ритмы [Albrecht U., Eichele G., 2003, Balsalobre A., 2002, Reppert S. M., Weaver D. R., 2001, Reppert S. M., Weaver D. R., 2002]. Результаты исследований последних лет свидельствуют, что система формирования циркадных ритмов организована значительно более сложно, чем считалось ранее [Takahashi J. S., 2004, Виноградова И. А., 2005]. Несколько новых генов рассматриваются в качестве кандидатов clock генов. Показано, что контроль внутриклеточных ритмов может осуществляться на посттрансляционном уровне путем модификации clock белков, что стало объектом интенсивного изучения в последние годы [Okamura Н., 2004, Richter Н. G., et al., 2004, Rutter J., et al., 2002]. Более того, накапливаются данные, связывающие активность ключевых clock генов с состоянием хроматина, что добавляет новый уровень в регуляцию циркадных ритмов.

В данном обзоре изложены современные представления о системе формирования ритмов на уровне многоклеточного организма, тканевом, клеточном и молекулярном уровнях, обсуждаются механизмы регуляции ритмов и влияние ритмов на различные клеточные процессы [Цынкаловский О. Р. и др., 2008].

Общие сведения о циркадных ритмахБольшинство процессов в живых организмах контролируются во времени и происходят ритмично [Голиков А. П., Голиков П. П., 1973, Деряпа Н. Р. и др., 1985, Ефимов М. Л., 1981, Катинас Г. С., Моисеева Н. И., 1980, Комаров Ф. И., Рапопорт С. И., 2000, Моисеева Н. И., Сысуев В. М., 1981]. Биологические ритмы — циклические колебания интенсивности и характера биологических процессов с различным периодом [Агаджанян II. А., 1967, Голиков А. П., Голиков П. П., 1973, Емельянов И. П., 1976]. Чаще всего биологические ритмы принято разделять по длине периода — длительности одного полного цикла ритмических колебаний в единицу времени. Соответственно различают ультрадианные (с периодом менее 20 часов), циркадианные или циркадные (с периодом от 20 до 30 часов) и инфрадианные (с периодом более 30 часов) [Koukkari W. L., Sothern R. В., 2006, Сорокин А. А., 1981]. Наиболее важное значение в биологии имеют циркадные ритмы (от лат. circa — около, dies — день). Термин «циркадные» обычно используют для обозначения ритмов с периодом, стремящимся к 24 часам, т. е. суточных ритмов [Деряпа Н. Р. и др., 1985, Ефимов М. JI. и др., 1985, Комаров Ф. И., Рапопорт С. И., 2000]. Именно с циркадными ритмами сиихронизуется большинство важнейших физиологических функций живых систем [Albrecht U., Eichele G., 2003, Комаров Ф. И., Моисеева Н. И., 1983, Кузьмин В. И., Жирмунский А. В., 1980, Моисеева Н. И., 1978].

Биологический ритм характеризуют несколько основных параметров: период (частота), мезор, акрофаза, амплитуда и фаза [Катинас Г. С., Моисеева Н. И., 1980]. Периодом обозначается длительность одного полного цикла ритмических колебаний в единицу времени. Частота — величина, обратная периоду, число полных колебаний в единицу времени. Мезор — уровень среднего значения показателей. Акрофаза — точка времени в периоде, когда отмечается максимальное значение (пик) показателя, максимальное отклонение от мезора. Амплитуда ритма — разность междумаксимальным (или минимальным) значением процесса и его средним уровнем. Нередко приводят величину двойной амплитуды (2А). Фазавеличина, характеризующая состояние колебательного процесса в определенный момент времени, определяется отрезком времени от какой-либо точки отсчета до условного момента — начала ритма.

Систему, образующую и контролирующие циркадные ритмы, -внутренние часы, можно обнаружить практически в любых светочувствительных организма — от цианобактсрий до человека. Этот факт свидетельствует о том, что наличие таких часов давало организму определенные преимущества при естественном отборе в процессе эволюции [Гаркави JI. X. и др., 1990, Голиков А. П., Голиков П. П., 1973, Ефимов М. Д., 1981, Казначеев В. П., 1980, Катинас Г. С., Моисеева Н. И., 1980]. Так как эволюция происходила в условиях ритмичности, обусловленной вращением Земли, формирование генетически закрепленной ритмичной организации жизнедеятельности, например, поведенческих реакций или физиологических функций, способствовало лучшей адаптации организма к условиям внешней среды [Алпатов А. М., 2000, Виру А. А., 1980, Гаркави JI. X. и др., 1990, Казначеев В. П., 1980, Романов Ю. А., 2000, Саркисов Д. С. и др., 1975].

Согласно недавно сформулированной гипотезе [Gchring W., Rosbash М., 2003] эволюция внутренних часов организма, появившихся более 500 миллионов лет назад, стимулировалась необходимостью ограничивать воздействие ультрафиолетового света, токсичного для генома. Примитивные микроорганизмы, относящиеся к морскому зоопланктону, могли использоватьь рецепторы к голубому свету (например, криптохромыбудующие гены Cry) для того, чтобы во избежание действие ультрафиолета ежедневно перемещаться на большую глубину. Эти рецепторы позже могли свзаться с циркадным оссцилятором, что способствовало более адекватной координации во времени этой приспособительной поведенческой реакции.

Такой механизм давал преимущества при естественном отборе и мог закрепиться генетически.

Ключевым свойством внутренних часов является способность генерировать самоподдерживающиеся, т. е. существующие даже при отсутствие внешних стимулов, эндогенные ритмы [Cuninkova L., Brown S. А., 2008, Ко С. Н., Takahashi J. S., 2006]. Причем многие процессы в организме чаще координируются с эндогенными ритмами, задаваемыми внутренними часами, а не внешними стимулами при смене дня и ночи. Например, лабораторные мыши в стандартных световых условиях (12 часов свет/ 12 часов темнота) основную активность проявляют в период темноты. При помещении этих животных в условия постоянной темноты начинают преобладать так называемые «свободные» ритмы, задаваемые внутренними часами. Животные сохраняют «ночную» активность, но период регестрируемых ритмов начинает отличаться от 24-часового. Например, у мышей линии C57BL/6J этот период составляет ровно 23.6 часа.

Под действием факторов внешней среды внутренние часы легко подстраиваются под 24-часовой ритм (более подробно обсуждается в последующих главах). Здесь можно отметить, что высокая чувствительность внутренних часов и генерируемых ими ритмов к внешним воздействиям делают изучение хронобиологических процессов у человека крайне сложным, так как требуют создания достаточно строгих условий для исследуемых объектов [Романов Ю. А., 2000, Саркисов Д. С. и др., 1975, Смирнов К. М., 1980, Чиркова Э. Н. и др., 1990, Шабатура Н. Н., 1984]. В экспериментах на лабораторных животных эту проблему решить легче, так как их можно содержать в условиях котролируемого светового и пищевого режимов при постоянной температуре окружающей среды [Казначеев В. П. и др., 1978]. Перед началом экспериментов для исключения сильных световых влияний животных нередко на 1−2 суток помещают в условия постоянной темноты.

На внутриклеточном уровне циркадные ритмы формируются за счет взамодействействия между собой молекул, содержание которых меняется циклично в течение суток, и «точное время» зависит от концентрации этих молекул в ядре и цитоплазме. Механизмы этих процессов обсуждаются в следующей главе.

Молекулярные компоненты внутренних часов. Современная модель формирования внутриклеточных ритмовНа молекулярно-генетическом уровне циркадные ритмы начали изучаться около 30 лет назад. Существование генов, контролирующих циклические процессы и получивших название «clock генов», было впервые показано на Drosophila melanogaster, Chlamydomonas reinhardi и Neurospora crassa путем изолирования организмов с мутировавшими генами [Dunlap J. С., et al., 1996, Loros J. J., 1998]. Позже, мутации в clock генах были обнаружены у млекопитающих [Ките К., et al., 1999]. Первый clock ген period (per) был клонирован у Drosophila в 1984 году, а в последующие годы были клонированы все известные на настоящий момент clock гены млекопитающих [Вае К., et al., 1998]. Ген обычно относят к группе clock генов, если его продукт необходим для возникновения и/или поддержания циркадных ритмов [Okamura Н., 2004]. Последовательность clock генов практически одинакова у различных видов животных [Bell-Pedersen D., et al., 2005].

Клонирование clock генов сыграло решающую роль в понимании механизмов формирования и регуляции ритмов на внутриклеточном уровне [Meyer-Bernstein Е. L., Sehgal А., 2001]. Было показано, что регуляция ритмов происходит примерно одинаково в разных типах клеток, включая клетки прокариотов, растений, низших и высших животных [Takahashi J. S., 2004]. Современная модель внутриклеточных часов млекопитающих (Рис.1), базируется на экспериментальных данных, полученных в исследованиях па мышах и крысах [Ко С. Н., Takahashi J. S., 2006, Reppert S. M., Weaver D. R., 2001].

Рис. 1. Современная модель формирования внутриклеточных циркадных ритмов. Ритм устанавливается за счет взаимодействия позитивных и негативных элементов петлей отрицательных обратных связей, формируемых самими генами и их продуктами. Обозначенния: «+» -стимулирующие влияния, «-» -тормозящие влияния.

К ключевым генам, контролирующим циркадные ритмы, относятся Clock (в некоторых тканях его функцию возможно выполняет Npas2), Brual 1, гены Period Perl и Рег2 и Cryptochrome Cry J и Сгу2. Транскрипция в ядре с clock генов приводит к образованию мРНК, которая перемещается в цитоплазму, где в результате трансляции происходит синтез clock белков [Ко С. Н., Takahashi J. S., 2006]. В цитоплазме происходит опосредованное киназами фосфорилирование, которое влият на стабильность белков [Toh К. L., 2008]. Постепенно увеличивается концентрация белков и формируются белковые гетеродимеры, которые перемещаются обратно в ядро, где онирегулируют экспрессию генов по механизму положительных и отрицательных обратных связей (Рис. 1).

Гетеродимер CLOCK-BMAL1 представляет собой транскрипционный фактор, который распознает последовательность CACGTG (так называемую «E-box») и, связываясь с ней, запускает транскрипцию с генов Рег/Рег2 и Cryl/Cry2. Продукты этих генов образуют гетеродимер PER: CRY, который переносится обратно в ядро и тормозит собственную транскрипцию за счет подавления активности комплекса CLOCK: BMALl, — то есть замыкается петля отрицательной обратной связи (Рис.1). Через определенное время происходит деградация гетеродимера PER: CRY, и комплекс CLOCK-BMAL1 может снова запускать новый цикл транскрипции.

Полный цикл завершается в течение примерно 24 часов, формирую тем самым внутриклеточный циркадный ритм. О кинетике отдельных реакций известно крайне мало.

Существует еще одна регуляторная петля, которая запускается при активации комплексом CLOCK: BMALl транскрипции ядерных рецепторов Rev-erb и Ror [Preitner N., et al., 2002]. REV-ERB и ROR регулируют транкрипцию Bmall, конкурируя между собой за связывание с так называемой «RORE последовательностью» (AAAGTAGGTCA) промоутера этого гена [Guillaumond F., et al., 2005]. При этом ROR стимулирует синтез BMAL1, a REV-ERB — подавляет, замыкая тем самым петлю отрицательной обратной связи [Triqueneaux G., et al., 2004]. Данный механизм не является основным в регуляции ритма, но, по-видимому, его наличие добавляет надежности в работу внутриклеточных часов, в частности способствует стабильности ритмов.

Кроме того, транскрипция Bmall может активироваться PER2 через неизученный механизм [Takahashi J. S., 2004].

Активность большинства ключевых clock генов (уровень мРНК) и содержание кодируемых ими белков изменяется ритмично в течение суток, спериодом около 24 часов [Albrecht U., Eichele G., 2003]. Исключение составляют CLOCK и казеин-киназы е и 8 [Balsalobre А., 2002]. Содержание PER и CRY, формирующих петлю отрицательной обратной связи и являющихся ингибиторами осцилляций, достигает максимума в конце дняначале ночи [Ко С. Н., Takahashi J. S., 2006]. Содержание REV-ERB и ROR достигает максимума между пиками BMAL1 и PER: CRY, а гетеродимер CLOCK: BMALl, поддерживающий оссциляции, — в течение светового дня [Balsalobre А., 2002, Cuninkova L., Brown S. А., 2008, Ко С. Н., Takahashi J. S., 2006, Reppert S. M., Weaver D. R., 2001].

Для четкой работы внутриклеточных часов необходимо, чтобы максимально точно контролировалось время задержки перемещения белков из цитоплазмы в ядро. Как осуществляется контроль этого процесса остается до конца не изученным. Однако, показано, что регуляция перемещения белковых комплексов осуществляется на посттрансляционном уровне, например, как указывалось выше, за счет фосфорилирования белков. Этот процесс, влияя на стабильность ключевых циркадных белков, поддерживают точность работы часов. Например, фосфорилирование PER изменяет его стабильность [Kawamoto Т., et al., 2004] и тормозит скорость перемещения как этого белка, так и CRY в ядро клетки (для попадания в ядро CRY должен связаться с PER). Основными ферментами, ответственными за фосфорилирование этих белков, являются казеин-киназы е и 8 (Рис.1). Показано, что их мутации могут вызывать значительные изменения суточных ритмов.

Предполагается, что кроме описанных выше, ряд других генов могут являться потенциальными clock генами, например Npas, Мор4, Arnt2, Мор9, Fbxl3, однако их роль в формировании циркадных внутриклеточных ритмов до сих пор не доказана [Takahashi J. S., 2004]. Заметим, что связь с хронобиологическими нарушениями обнаружена только для нескольких генов, например, для Рег2 и Clock [Iwase Т., et al., 2002] и для казеин-киназ sи 5 [Lawson D. A., et al., 2005], поэтому неясно, насколько важным для формирования нормальных ритмов является проявление активности всех компонентов внутренних часов клетки.

Следует отметить, что изложенная выше традиционная модель организации системы циркадных часов млекопитающих в основном базируется на данных, полученных в экспериментах на различных моделях и на лабораторных животных, и прямых доказательств правильности этой теории для человека немного. Более того, в одном из недавних исследований было показано, что экспрессия Clock, одного из ключевых циркадных генов, не является необходимой для формирования суточных ритмов [Debruyne J. P., et al., 2006]. Хотя у мышей, лишенных CLOCK, изменялась реакция на свет, четкие циркадные ритмы полностью сохранялись. Подробное обсуждение фактов, противоречащих транскрипционной-трансляционной модели, приводится в одном из критических обзоров [Lakin-Thomas P. L., 2006]. Весьма вероятно, что традиционная модель формирования циркадных ритмов может притерпеть некоторые изменения, по крайней мере для клеток млекопитающих.

Можно предположить, что механизмы формирования и регуляции ритмов в клетках СХЯ (в центральном пейсмейксре) и периферических тканей (в периферических пейсмейкерах) не полностью идентичны, и, кроме того, могут различаться между разными тканями [Balsalobre А., 2002, OkamuraH., 2004].

Более того, циркадные ритмы могут различаться в разных клетках одной ткани. В частности, показано, что в тимусе и ткани яичек изменение экспрессии clock генов различается в клетках разной степени зрелости [Alvarez J. D., et al., 2003, Alvarez J. D., Sehgal A., 2005, Morse D., et al., 2003]. Была сформулирована гипотеза о том, что формирование ритмов зависит от степени дифференцировки клеток [Morse D., et al., 2003]. Эта гипотеза получила экпериментальное подтверждение в работах нашей лаборатории.

Изучение 24-часовых изменений активности clock генов в клетках кроветворной ткани мышей выявило значительные различия в формировании и регуляции циркадных ритмов в стволовых клетках и более дифференцированных и зрелых клетках костного мозга [Tsinkalovsky О., et al., 2006]. Полученные результаты позволи сделать вывод о том, что в кроветворных стволовых клетках мышей не сформированы циркадные ритмы в изменении активности большинства clock генов.

Механизмы формирования циркадных ритмов в организмеРабота внутренних часов зависит от нескольких составляющих, которые формируют ритмы и опосредуют их влияние на основные функции организма. К компонентам, стимулирующим осцилляции в центральном и периферических пейсмейкерах организма, относятся прежде всего факторы внешней среды [Van Gelder R. N., Herzog E. D., 2003]. Среди них основным стимулятором (Zeitgeber) безусловно является свет, а другими важными факторами — пища и температура (Рис. 2). Осцилляции пейсмейкеров запускают ряд механизмов, с помощью которых внутренние часы могут регулировать различные физиологические процессы в организме.

Центральный пейсмейкерСвет стимулирует центральный пейсмейкер (водитель ритма), функцию которого выполняют билатеральные супрахиазматические ядра (СХЯ) гипоталамуса, каждое из которых включает 10 000−16 000 нейронов [Yamaguchi S., et al., 2003]. Электрический потенциал этих нейронов изменяется ритмично с периодом примерно 24 часа. У человека период свободных ритмов в СХЯ несколько больше, но под действием внешних возбудителей, в основном световых, они легко подстраивается под 24-часовой период.

Световой сигнал воспринимается высокочувствительными ганглиозными клетками сетчатки [Brown Т. М., Piggins Н. D., 2007, Yamazaki S., et al., 2002], которые посредством фотопигмента меланопсина [Dkhissi-Benyahya О., et al., 2006] вызывают возбуждение в сетчатке и через ретиногипоталамичсский тракт проводят его к СХЯ [Challet Е., 2007, Tosini G., et al., 2008]. Нейроны СХЯ функционируют автономно, споптанно генерируя электрические потенциалы. Синхронизация нейронов СХЯ осуществляется через синапсы и за счет паракриновых влияний. В частности, медиатором, опосредующим синхронизацию работы клетко, являетсяРис. 2. Схема формирования ритма внутренними часами организма под действием внешних стимулов (факторов внешней среды) и локальных факторов. вазоактивный интерстициальный полипептид, активирующий соответствующий ему рецептор.

При возбуждении в нейронах СХЯ происходит резкий сдвиг концентрации основных компонентов внутриклеточных часов [Yamaguchi S., et al., 2003, Yan L., et al., 2007], изменяется активность clock генов и стабильность кодируемых ими белков [Aton S. J., Herzog Е. D., 2005]. В клетках происходит активация clock генов Perl и Per2 [Quintero J. Е., et al., 2003] (без необходимого предварительного синтеза стимулирующих белков) и запускаются связанные с этими генами реакции, описанные выше. На транскрипцию генов в нейронах СХЯ могут влиять изменения концентраций многих факторов: митоген-активированного протеина, киназ [Takahashi J. S., 2004], внутриклеточного кальция [Kononenko N. I., et al., 2008], кальмодулина [Agostino P. V., et al., 2004], c-Fos протеина [van der Veen D. R., et al., 2008] и оксида азота [Plano S. A., et al., 2007].

СХЯ посредством нервных и гуморальных сигналов в другие отделы головного мозга и в периферические ткани координируют во времени различные функции организма [Hastings М., et al., 2007]. Влияниями через субпаравентрикулярную зону и медиальный преоптический отдел контролируется терморегуляция, циркадные изменения температуры тела [Scheer F. A., et al., 2005], через латеральный гипоталамус и вентролатеральное преоптическое ядро — циклы сна-бодрствования [Moore R. Y., 2007], через дорсомедиальное и паравентрикулярное ядра гипоталамуса регулируется выделение гормонов [Hastings М., et al., 2007]. Особенно важным представляется стимуляция выработка глюкокортикоидов, опосредующих влияние1 центрального пейсмейкера на многие метаболические процессы [Maywood Е. S., et al., 2007, Дедов И. И., Дедов В. И., 1992]. Эти гормоны регулируют метаболизм глюкозы, жиров и белков, обладают противовоспалительным действием и другими достаточно хорошо изученными эффектами.

Безусловно важную роль в передаче сигналов от СХЯ играют выделяемые нейронами гуморальные факторы, например, трансформирующий фатор роста a (TGFa), кардиотрофин-подобный цитокин и прокинетицин-2 [Zhang С., et al., 2007]. Доказательством важности гуморальных влияний являются результаты работы Silver с соавторами, которые обнаружили, что пересадка СХЯ, инкапсулированных в пористый материал, может приводить к восстановлению циркадных локомоторных ритмов у реципиентов с поврежденным СХЯ [Yan L., et al., 2007].

Формирование ритмов в периферических тканях и органахХотя наиболее детально молекулярно-генетические основы циркадных ритмов изучены в центральном пейсмейкере — СХЯ гипоталамуса [Reppert S. М., Weaver D. R., 2002], за последние десять лет опубликовано большое количество исследований, описавших циркадные изменения активности clock генов в клетках различных органах и периферических тканей: печени, сердца, легких, поджелудочной железы, скелетных мышц, гладкомышечной мускулатуры, слизистной оболочки ротовой полости, кожи, в лейкоцитах периферической крови и других [Balsalobre А., 2002, Cuninkova L., Brown S. А., 2008, Gachon F., et al., 2004, Hastings M., et al., 2007]. Интересно отметить, что только небольшая часть работ выполнены на клетках человека [Bjarnason G. A., et al., 2001].

Более того, элегантными исследованиями с регистрацией экспрессии Рег2 в отдельных клетках, было доказано, что угасание ритма в культуре не связано с затуханием внутриклеточных осцилляторов — индивидуальные ритмы в клетках сохраняются в течение нескольких недель [Welsh D. К., et al., 2004]. Авторы доказали, что в условиях in vitro нарушается координация ритмов между отдельными клетками. Воздействия различных стимуляторов, описанных выше, могут восстанавливать и поддерживать синхронизацию ритмов.

Важным вопросом, который продолжает активно дискутироваться, является вопрос о механизмах координации периферических часов. Долгое время было считалось, что влияние центральный пейсмейкера являются абсолютно доминирующими. В настоящее время, хотя иерархическая схема организации внутренних часов (по крайней мере у млекопитающих) не ставится под сомнение, принято считать, что периферические часы обладают определенной автономностью. В ествественных условиях периферические осцилляторы координируются сигналами, поступающими от нейронов СХЯ, однако, при изменении условий внешней среды, мобилизующих адаптационные процессы, связь между осцилляторами может прерываться. Например, в экспериментах с моделированием синдрома смены часового пояса («jetlag»), вызывающим 6-часовой сдвиг циркадного периода, было показано, что при возвращении к привычному периоду синхронизация СХЯ наступает достаточно быстро, но восстановление ритмов на перифериизанимает более недели. Воздействие на периферические осцилляторы таких сильных (и более адекватных Zeitgeber для периферических тканей, чем свет) стимулов, как пища, изменение концентрации гормонов (особенно глюкокортикоидов), сдвиги температуры, может перекрывать влияние центрального пейсмейкера — СХЯ. В таких случаях, именно локальные стимуляторы осуществляют синхронизацию ритма между отдельными клетками [Balsalobre А., 2002].

Интересное исследование об участии периферических осцилляторов в формировании ритмов в клетках печени провели Kornmann с коллегами [Kornmann В., et al., 2007]. Они изучали изменения активности clock генов в клетках печени мышей при искусственном угнетении одного из ключевых компонентов внутриклеточных часов — mBmall за счет постоянной экспрессии mRev-erb а. Исследователи показали, что локальное выключение mBmall in vivo приводит к потери ритмов в изменениях суточной экспрессия большинства clock генов, однако небольшая часть генов, в частности тРег2, продолжает изменяться ритмично. Результаты данного исследования свидетельствуют о том, что при формировании ритмов активности большинства генов в периферических тканях (по крайней мере в печени) доминируют периферические осцилляторы, однако некоторые гены могут оставаться под контролем центрального пейсмейкера.

Регуляция clock генами различных клеточных функцийБольшое количество исследований посвящено выяснению функций внутренних часов, их роли в регуляции различных физиологических процессов в организме. Использование высокопродуктивных методов анализа транскриптомов в различных тканях показали, что активность до 10% генов изменяется в течение суток ритмично [Oishi К., et al., 2003, Storch К., et al., 2002]. Значительная часть этих генов (и их продуктов) была связана с метаболизмом питательных веществ. В частности, циркадные ритмы были выявлены в изменении активности многих ферментов, участвующих в метаболизме белков, жиров и углеводов. Было высказано предположение, что внутренние часы в печени регулируют разобщение процессов синтеза и расщепления гликогена и могут координировать детоксикацию различных продуктов метаболизма, например ксенобиотиков, способных генерировать реактивные метаболиты кислорода [Balsalobre А., 2002]. Таким образом, наличие внутренних часов в тканях, участвующих в пищеварении (желудочно-кишечном тракте, печени, поджелудочной железе), позволяет адекватно координировать метаболические процессы.

Глобальные генетические исследованиия позволили сделать два важных заключения. Во-первых, было выявлено, что ритмические изменения активности генов в разных группах клеток в пределах ткани различаются по фазе ритмов. Это по-видимому может объясняться тем, что разные популяции клеток участвуют в биохимически разнонаправленных процессах, например, в синтезе и расщеплении гликогена в печени.

Во-вторых, было обнаружено, что набор генов, координирующих активность с циркадными ритмами, специфичен для каждой ткани. Например, при сравнении ритмично экспреесирующихся генов в печени и сердце был выявлен очень небольшой процент одинаковых генов. На основании данных анализов был сделан вывод, что циркадная активность генов в периферических тканях и органах преимущественно регулируетсялокальными факторами. Подобная организация периферических часов представляется биологически оправданной. Основные процессы, происходящие в различных тканях должны координировться во времени соответственно специфическим для данной ткани стимулам. Например, в печени изменяется метаболизм питательных веществ координирование с поступлением пищи, в почках эфффективно изменяется фильтрация и реабсорбция воды и электролитов соответственно циклам сна-бодрствования и т. д.

Следует отметить, что кроме метаболических процессов, участие внутренних часов в регуляции многих других функций остаются крайне мало изученным. Например, получено немало данных о том, что процесс кроветворения координируется во времени [8таа1апс1 II., е1 а1., 2002]. Циркадные ритмы выявлены в изменениях количества стволовых клеток и клеток-предшественников, выделяемых в течение суток из костного мозга добровольцев [АЬгаЬашзеп.Г., е1 а1., 1998], в синтезе ДНК и уровнях пролиферации клеток-предшественников костного мозга различных линий [8таа1апс1 II., е1 а1., 1992, 8таа1апс1 II., е1 а1., 1995] и в способности клеток костного мозга образовывать колонии в организме летально облученных рецепиентов [О'Нопск Ь., еЬ а1., 2004]. Однако, до сих пор не исследовано, как происходит координация во времени гемопоэза в костном мозге.

Описательный характер носят и хронобиологические исследования системы иммунитета. Показано, что многие составляющие системы клеточного и гуморального иммунитета [Петров Р. В., 1987, Хаитов Р. М., 2006] (количество Ти В-лимфоцитов, концентрации иммуноглобулинов и интерлейкинов, изменения количества фагоцитов и их функциональной активности, общее количества лейкоцитов периферической крови) регулируются циркадными ритмами [Бородин Ю. И. и др., 1992]. Однако, данные о механизмах такой регуляции иммунной системы отсутствуют.

Механизмы регуляции физиологических процессов внутренними часамиНаиболее изученный механизм регуляции клеточных функций clock генами заключается в изменении активности контролируемых ими генов (так называемых «clock controlled genes») [Albrecht U., Eichele G., 2003].

Белки, кодируемые clock генами, и образуемые белковые гетеродимеры являются транскрипционными факторами, экспрессия которых меняется в соответствие с клеточными циркадными ритмами [Gachon F., et al., 2004]. За счет измепеппия активности транскрипционных факторов может ритмично меняться и экспрессия подконтрольных им генов и, соответственно, клеточные процессы, этими генами опосредуемые [Balsalobre А., 2002]. Такой механизм позволяет клеткам периферических тканей и органов быстрее и лучше адаптироваться к местным изменениям окружающей среды.

Одним из примеров регуляции клеточных процессов внутриклеточными часами через подконтрольные транскрипционные факторы является изменение clock генами суточной экспрессии Dbp в клетках печени [Lavery D. J., et al., 1999]. В частности, показано, что циркадные изменения активности этого гена в клетках печени контролируются непосредственно гетеродимером CLOCK: BMALl через последовательность E-box. Dbp является транскрипционным фактором, кодирующим экспрессию несколько ключевых ферментов в печени, и регулируя экспрессию Dbp, CLOCKrBMALl может соответственно регулировать активность печеночных ферментов. Весьма вероятно, что такой механизм регуляции характерен для многих тканей [Balsalobre А., 2002]. Подобный контроль выглядит биологически рациональным: несколько ключевых clock генов способны регулировать значительное количество подконтрольных генов и соответственно связанных с ними процессов за счет воздействие на относительно небольшое число транскрипционных факторов. При этом набор генов, подконтрольных clock генам, и набортранскрипционных факторов зависит от типа тканей и выполняемых ею функций. Учитывая специфичность генного репертуара в разных тканях, можно предположить, что механизмы регуляции ритмов в этих генах также имеют свои особенности.

В свою очередь, внутриклеточные часы в периферических тканях и органах настраиваются не только при получении координирующих сигналов от центральногт пейсмейкера, по и при локальном воздействии внутренних факторов, например, метаболических, которые могут действовать непосредственно на clock гены и белки [Hastings М., et al., 2007, Ко С. Н., Takahashi J. S., 2006]. Так, было показано, что способность гетеродимера CLOCK-.BMAL1 связываться с ДНК напрямую зависит от соотношения восстановленной и окисленной форм никотинамиддинуклеотида [Rutter J., et al., 2002]. Поскольку это соотношение определяется уровнем клеточного метаболизма, ограничение поступления в клетки питательных веществ может перенастраивать клеточные часы.

Приведенные примеры дают представление об механизмах координации clock генами различных физиологических процессов в клетках и демонстрируют важную роль внутренних часов в поддержании клеточного и тканевого гомеостаза. Можно ожидать, что интенсивные исследования системы формирования циркадных ритмов достаточно скоро приведут к раскрытию новых механизмов, опосредующих функции этой системы в различных тканях [Takahashi J. S., 2004].

Настоящая работа посвящена изучению внутриклеточных ритмов в системе кроветворения млекопитающих. Кроветворная ткань является динамичной, быстро обновляющейся тканью, состоящей из многих типов клеток, которые находятся на разных стадиях диффсренцировки [Петров Р. В., 1987, Хаитов Р. М., 2001, Хаитов Р. М., 2006]. Основные типы клеток (лейкоциты, эритроциты и тромбоциты), образующиеся в процессе кроветворения, выполняют разные функции: иммунную, обеспеченияорганизма кислородом, поддержания гемостаза, поэтому механизмы регуляции гемопоэза достаточно сложные. При этом безусловно важным в регуляции гемопоэза является поддержание ритмичности процессов, его составляющих. В данной работе основное внимание было уделено характеристике молекулярных часов в кроветворных клетках различной степени зрелости и дифференцировки и обсуждению особенностей системы формирования циркадных ритмов в костном мозге в сравнении с другими тканями и между различными видами организмов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Эксперименты на мышахЖивотныеДля проведения экспериментов на лабораторных животных мною был окончен курс «Методы работы с лабораторными животными» при Бергенском университете и получен соответствующий сертификат. На все эксперименты с животными было получено разрешение комиссии вивариев Института им. Гаде Бергенского университета и университетской клиники Хокеланд.

Для хронологических экспериментов по оценке изменения активности clock генов исользовались мыши B6D2F1, в возрасте 5−6 недель (Charles Rivers, L'Arbresle, France), которые в течение трех педель до начала опытов находились в стандартных световых условиях 12 часов при свете (с 06:00 до 18:00)/12 часов в темноте, LD 12:12). Для подтверждения синхронизации основных ритмов организма к указанному режиму у 28 мышей с помощью цифровых датчиков Digital Thermometer 49А (YSI, Dayton, OH, USA) измерялась ректальная температура. В течение 24 ч до начала экспериментов животные находились в полной темноте во избежания стимулирующего маскирующего влияния света на эндогенные ритмы животных. В каждой из 3-х групп экспериментов использовали по 28 мышей. Шесть раз в сутки через каждые 4 ч забивали 4 мышей для получения образцов костного мозга и печени и забора крови. Обозначение времени забора (circadian time, СТ) соответствовало времени LD до начала экспериментов (например, 6 00 СТ -06:00). Седьмой забор проводили через 24 ч после начала эксперимента, то есть по времени (СТ) этот забор совпадал с первым забором. Мышей усыпляли ингаляционным наркозом (СОг) и забивали путем быстрого смещения шейных позвонков, а затем извлекали кости бедра и голени и печень. При забивании у животных собирали кровь из сердечной полости, которая после обработки эфиром использовалась для определения концентраций кортикостерона и мелатонина методом радиоизотопного анализа [Claustrat В., et al., 1984, Filipski Е., et al., 2004]. Для оценки концентрации кортикостерона образцы растворяли в стандартном буфере для радиоиммунного анализа, а затем инкубировали с 1,2,6,7-ЗНкортикостероном (Amersham, Orsay, France) и кроличьими антителами к кортикоетерону (Valbiolech, Paris). Для определения мелатонина использовали меченную сыворотку с антителами к мелатонину, для экстракции использовали эфир. Чувствительность метода составляла 5 пг мелатонина/мл плазмы.

Определение способности кроветворных клеток мышей образовывать колонии in vitroСмешаиую популяцию кроветворных клеток костного мозга и SP клетки культивировали в 35-мм чашках Петри в растворе метилцеллулозы MethoCult 3434 (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada), содержащим 3 U/мл эритропоэтина, 10 нг/mji интрлейкина 3, IL-3, 10 нг/мл IL-6, и 50 нг/мл фактора стволовых клеток (Stem cell factor). Способность образовывать колонии оценивали на 12 день культивирования по стандартным критериям (http://www.stemcell.com/technical/28405methocult%20M.pdi), подсчитывая колонии, которые содержали более 50 клеток [Петров Р. В., et al., 1974, Петров Р. В., 1987]. В тестах со смешаной популяцией кроветворных клеток костного мозга концентрация клеток при посеве составляла 2×104 клеток/мл (2.2×104 клеток в одной чашке Петри). Так как оптимальная концентрация SP клеток для подобного анализа была неизвестна, мы провели предварительные тесты с концентрациями от 20 до 1000 SP клеток/мл. На основании результатов этих экспериментов в качестве оптимальной для теста была выбрана концентрация 100 клеток/мл, использование которой приводило к наилучшему соотношению индекса колониеобразования (количество колоний/количество посеянных клеток).

Эксперименты на рыбах Danio rerioРыбыДля экспериментов использовано 780 взрослых рыб Danio rerio TAB, которые были получены и содержались в аквариуме международного центра молекулярной биологии Sars (г. Берген, Норвегия) согласно соответствующим инструкциям этого центра по работе с лабораторными рыбами (www.sars.no/manual.doc). На все эксперименты с рыбами было получено разрешение Комиссии по этике биомедицинских исследований Sars центра.

ЦитологияДля приготовления препаратов с применением цитоспинов 2−10×103 отсортированных клеток осаждали в центрифуге Shandon Cytospin 3 (Thermo Electron Corporation, Pittsburgh) при скорости 1000 ротаций/мин в течение 5 мин на полилизиновые стекла для микроскопирования (Menzel GmbH & Co., KG, Braunschweig, Germany). Затем часть препаратов окрашивалась набором Diff-Quik kit (Dade-Behring AG, Switzerland) для анализа в световом микроскопе. Неокрашенные препараты использовали для полученния снимков в режиме интерференционного контраста с помощью детектора проходящего света на конфокальном сканирующем микроскопе Leica TCSSP2 AOBS (Wetzlar, Germany), объектив НС х PL АРО 63×1.4 NA.1Миелосупрессивная терапияДля получения миелосупрессивного эффекта рыбам 10-мкл шприцом для микроинъекций Hamilton вводили внутрибрюшинно 5-флуоурацил (Sigma-Aldrich) в концентрации 250 мкг/кг веса в 5 мкл физиологического раствора [Arai F., et al., 2004, Venezia Т., et al., 2004]. Аналогичный объем физиологического раствора без препарата использовался в качестве контроля. Влияние миелосупрессивной терапии на кроветворные клеткиоценивали на следующий день после инъекций методом проточной цитометрии после окраски клеток Hoechst.

Эксперименты на костном мозге человекаДонорыДонорами костного мозга явились 10 мужчин-добровольцев в возрасте от 21 до 28 лет. Первая серия экспериментов (5 доноров) проведена в период с декабря 1999 года по январь 2000 года, вторая (5 доноров) — в период с декабря 2003 года по январь 2004 года. Все доноры были подробно проинформированы о цели и задачах экспериментов, и от всех доноров получено письменное согласие участвовать в исследовании. Для проведения этих экспериментов было получено разрешение Комитета по медицинской этике Бергенского университета. Все процедуры проведены соответственно Инструкциям по этике биомедицинских исследований Совета международных организаций по медицинским наукам.

Все доноры соблюдали обычное расписание с подъемом утром между 7:00 и 9:00 и отходом ко сну между 23:00 и 00:30 по меньшей мере в течение недели, предшествующей экспериментам. Никто из доноров в течение месяца до начала экспериментов не работал ночью. Пищевой режим включал четырехразовое питание ' (соответственно норвежским стандартам) с завтраком утром, ланчем между 11:30 и 12:00, обедом между 16:00 и 17:00 и легким ужином между 19:00 и 20:00.

Выделение клеток костного мозга человекаОбразцы костного мозга получали 6 раз в течение суток, пунктируя грудину и бедренные кости в 08:00, 12:30, 17:00, 21:30, 02:00 и 07:00 ч. Для исключения методических погрешностей последовательность взятия образцов из разных анатомических участков меняли у разных доноров.

Кроме того, у половины доноров забор костного мозга начинали в 08:00, а у другой половины — в 12:30. Для обезболивания место пункции предварительно обкалывали 8 мл раствора лидокаина, 10 мг/мл (Astra, Sweden). Для дезинфекции использовали хлоргексидин. Около 8 мл костного мозга набирали в 20-мл шприц, предварительно смоченный 100 1Е/мл раствором гепарина (Leo Pharma AS, Norway), и сразу смешивали в 50-мл пробирках (ТРР, Trasadingen, Switzerland) с 13 мл физиологического раствора, содержащего 2 мМ EDTA (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО). Из полученного раствора 1 мл замораживали (см. описание процедуры ниже) для последующих исследований, а остальной объем (примерно 20 мл) использовали для выделения мононуклеарных клеток на градиенте плотности Lymphoprep (Nycomed, Norway).

Проточная цитометрия: анализ и высокоскоростная сортировка клетокАнализ кроветворных клеток мышейДля анализа и сортировки кроветворных клеток мышей и рыб использовали высокоэффективный проточный цитометр-сортировщик MoFlo (Cytomation, Fort Collins, USA), оборудованный лазером Coherent Enterprise 621 с излучением в двух спектрах: с длиной волны 488 нм, мощностью 1000 мВ, и 365 нм (ультрафиолетовый спектр), с мощностью 60 мВ, а также диодом, мощностью 25 мВ, с длиной волны 635 нм. Для анализа клеток, которые были окрашенны антителами, коиъюгированными с FITC или RPE, использовали соответственно фильтры 530/40 и 580/30 (все оптические фильтры/зеркала — от Omega Optical, USA), и 488 нм лазер [Shapiro H. H. M., 2001, Shapiro H. M., 2003]. Для анализа клеток, окрашенных Hoechst, использовали лазер с длиной волны 365 нм, а флуорисценцию Hoechst, проходящую через оптическое зеркало 610 DMSP, за счет использования оптических фильтров регистрировали в голубом (450/20 BP) и красном (675 EFLP) спектрах [Goodell M., et al., 1996]. При анализе клеток исключали клеточные агрегаты, мертвые клетки и клеточные обломки [Nolan J. Р., Yang L., 2007]. На Рис. 3 представлен пример логической последовательности анализа клеток для выявления SP [Tsinkalovsky О., et al., 2007, Цынкаловский О. Р. и др., 2008].

Анализ кроветворных клеток рыб Danio rerioПроточно-цитометрический анализ клеток рыб проводили, как описано выше для клеток мышей. Для оценки экспрессии DiD [Gregory M., Jagadeeswaran P., 2002, Lin H. F., et al., 2005] использовали 635-нм лазер и фильтр 670/30 BP. Интенсивность флуорисценции DiD (в логарифмическом режиме) в клетках, окрашенных Hoechst, оценивали на гистограмме SSC и FL6 после исключения клеточных агрегатов и мертвых клеток. Клетки, неокрашенные DiD, использовали в качестве контроля.

Высокоскоростная сортировка клетокКлетки сортировали на проточном сортировщике MoFlo в режиме «purify 1» со скоростью до 30 000 событий (клеток)/с в 5-мл полипропиленовые пробирки с холодным раствором буфера, содержащим 10% телячей сыворотки [van den Engh G., 2000]. Небольшую объем из частиотсортированных образцов использовали для оценки качества сортировки. Обычно, чистота сортировки составляла 94 — 99% (в среднем — 97.3%), выживаемость клеток, которая определялась после окраски трипановым синим, — более 90% для кроветворных клеток мышей и более 70% для клеток рыб, а потери клеток из выбранной для сортировки популяции не привышали 30%.

При сортировке образцов смешаной популяции костного мозга мышей клеточные агрегаты, мертвые клетки и клеточные обломки исключались на следующих гистограммах: прямого свсторасссивания, forward seatter (FSC) и пульсовой ширины (pulse width) — FSC и флуоресценции иодида пропидия (PI) и FSC и бокового светорассеивания, side scatter (SSC). Отсортированные таким образом клетки подсчитывались, 2×105 клеток использовали для оценки способности клеток образовывать колонии, а 25×105 клеток распределялись в 2-мл пробирки (по 5×105 клеток/пробирку), выдерживающие заморозку в жидком азоте (ТРР AG, Trasadingen, Switzerland), и пробирки замораживались, как описано выше.

Выделение РНК и определение экспрессии генов методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени с обратной транскрипциейВыделение РНКСуммарную клеточную РНК клеток мышей и человека выделяли с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen Sciences, Germantown, MD, USA), aиз клеток рыб — с помощью набора GenElute Mammalian Total RNA extraction kit (Sigma-Aldrich). Во избежание примесей клеточной ДНК, которые могут влиять на результат ПЦР [Bustin S., 2002], все образцы обрабатывали ДНазой с последующей экстракцией фенол-хлороформом (Promega, Madison, WI, USA). Полученнную РНК растворяли в 10 мкл раствора для сохранения РНК (Ambion, Houston, ТХ, USA). Для качественного контроля и определения количества выделенной РНК каждый образец (1 мкл) тестировали на биоанализаторе Agilent 2100 и NanoLabChip согласно инструкции производителя. В каждую реакцию в качестве стандарта включали образец (Ambion, Houston, ТХ, USA), состоящий из 6 фрагментов РНК, который позволял определить количество РНК в образцах. В среднем из образцов неочищенной популяции клеток костного мозга выделяли 3.2−4.1 мкг общей РНК, а из образцов SP клеток — от 50 до 240 нг.

Суммарную клеточную РНК клеток рыб выделяли с помощью набора GenElute Mammalian Total RNA extraction kit (Sigma-Aldrich). Количество выделенной РНК оценивали с помощью анализатора NanoDrop-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). Из образцов отсортированных кроветворных клеток рыб обычно выделяли от 10 до 90 нг суммарной РНК.

ПраймерыДля дизайна праймеров и флюоресцентно меченых проб (способных присоединяться к внутреннему сегменту ДНК-мишени) для всех реакций использовали программу Primer Express (Applied Biosystems). Последовательности праймеров и проб, использованных в пашей работе, приведены в отдельно для генов кроветворных клеток мышей (Таблица 1), рыб Danio rerio (Таблица 2) и человека (Таблица 3). Праймеры для генов клеток печени опубликованы отдельно [Tsinkalovsky О., et al., 2006]. Для дополнительного контроля экспрессии помеченные на 5'-конце флюоресцентным красителем-репортером FAM (reporter dye), а на 3'- концеблокатором TAMRA (quencher dye). Праймеры и пробы для реакций по оценке экспрессии clock генов в клетках мышей (mPerl, mPer2, mBmall, mCryl, mClock, mRev-erb а) и человека (hPerl, hPer2, hCryl, hCry2, hBmall, hRev-erb, а и hClock), а также m36B4, m Wee I, mDbp, mDlll и mHesl приобретали y MedProbe (Oslo, Norway). Гены 18S, GAPDH, hPO, hfi-cictin, которые характеризуются выраженной постоянной экспрессией в клетках, использовались в качестве эндогенного контроля. Готовые праймеры для анализа экспресии этих генов приобретали у Applied Biosystems.

Праймеры для генов рыб Danio rerio (1то2, tie I, c-myb, scl, tie2, c-fos, tobla, stat3, Ickl, ikaros, rag2, и c-mpl) приобретали y Sigma-Aldrich. В качестве эндогенного контроля в клетках рыб использовали 18S.

Таблица 1. Праймеры и пробы для тестируемых генов в клетках мышей.

Ген Праймер/проба Последовательность (5> 3')тРег1 Прямой ТСАСАССАССААСАСТАСАААСТСАОбратный СТСССАСТСАССАСССТСТАСПроба АСАСС С САТСС С САС С САС САСтРег2 Прямой СТССАССТСССТССАСАСААОбратный ТСАТТАСССТТСАССТССТТСАСПроба СТСССААСССТСААСТАТССССТССmRev-егЬ, а Прямой САТАССТССССТТСТТСТАСАТСАТСОбратный ТТССАТССССАСТТСТАСАСТТСПроба ТСАТС СТСТТСАТС СТССТС СТССТТСТАТААССтВта11 Прямой АС АС СТС СС АС С ААС С С АТАОбратный ТСАСААТТАССЮТТТСАСТТСАТСАТПроба С АС АС ААС С АААСТАСААС С С ААС АТТТСТАТС АСтСгу1 Прямой СТССССТСАССАССТТТТСТТОбратный САСТТССТСТАСССАСАССТТСААПроба ААСССССССТСАТААСССАСАССТтС1оск Прямой С ААААТСТС АСС АС С АСТТААТС СОбратный АТАТС С АСТС СТС С С СТТТС СПроба ТСАССААТСТАТАСТААСАССАТТТСССТТТТССАТАТТтЛ/ее1 Прямой СССАСАСТСССААСАСТТТСОбратный АТС ААТАС АС ААСТАСС С С С С АСТТТПроба АСАСССССААТСААТААСТСССССТТТтйЬр Прямой СССТСАССААСАСААССАТСАС-Обратный ТСТТССАТСТСТССАССТСТТСПроба ТТСАТТСТТСТТСТАССТСССССТССАтОН1 Прямой САСТСТСТТАТАСССАСТСАССТСТААОбратный С С С СТАТАТС СТТС С ААТТТТАТТТААС АПроба ТСС С ААТТТТС С С АС АТС С СТТС СтНез1 Прямой ССТСТСАССАСАСАААСТСАТСАОбратный СТСТТТТСАСТТСССТТАСАСТТТСАТПроба ТТАТТСТТССССТТССССТСТТСТССАТт36В4 Прямой СССАССАТТСАААТТСТСАСТСАОбратный АТСТТСАССАТСТТСАССАСТСТПроба ТСССТСССАССТТСТСТССАСТСТТТАТСТаблица 2. Праймеры для тестируемых генов в клетках рыб Danio rerio.

Ген Праймер Последовательность (5'—> 3')1то2 Прямой AAATGAGGAGCCGGTGGATОбратный GCTCGATGGCCTTCAGAAAtiel Прямой CTGGCGAGATAGACCTTAОбратный CCTCTTCAGCGGTAGCATc-myb Прямой GGTGATTGAGTTGGTGCAGAAGОбратный TCGCCCCTTTAAATGCTTTGsel Прямой AAAGGAGGTGGCGGTGATОбратный AGCGGGCGGACTCAAtie2 Прямой TGGCGGAGGGCGAGTCTGОбратный AGCTGGTATCCGGTGTTGc-fos (srf) Прямой TACG G ACCCTTCAACAG АССОбратный TGGAGCAAAATTGTGCAGAGtobla Прямой AATTTGGCTCCACGAAAATGОбратный CCTGGAGATTGGGAAAGACAstat3 Прямой CAGTTGGAGACGCGGTATОбратный GACCAGCGTGGCGTGAGAIck1 Прямой ACCAGTGTAACTGCCCCAAGОбратный TCACTGTGGGCTGGATCATAikaros Прямой AG G С С АТС ААС AGTG С ААТТАОбратный AAGGTGCTCTGCGGCGCTGTCrag2 Прямой CGAGATCAGCCACAGTCGTAОбратный AAGGTGCAGAGTCCTCGAAALc-mpl Прямой CGCCAACCAAAGCCAGAGTTAОбратный ACTTTTCAACAGGTGCATCCCAДля оценки экспресии генов кДНК анализировали К-ОТ-ПЦР на оборудовании Applied Biosystems Sequence Detection System в 96-луночныхТаблица 3. Праймеры для тестируемых генов в клетках здоровых доноров.

Ген Праймер Последовательность (5'—> 3')hPerl Прямой ACACACTTCAGAACCAGGATACCTTОбратный TGCTCCGAAATGTAGACGATTChPer2 Прямой GTCCACCTCCCTGCAGACAAОбратный CTGGTAATACTCTTCATTGGCTTTCAhCryl Прямой GCCAGGCGGAGAAACTGAAОбратный AAAATTTG С С АСС С AAG СТТТhCry2 Прямой CCTACCTGCGCTTTGGTTGTОбратный TGCTGTTCCGCTTCACCTTThRev-erb a Прямой CCATGAACCTGGCCAACAAОбратный GTGCTGGGTGGGTGAAGTCThBmall Прямой GAAATCATGGAAATCCACAGGATAAОбратный GAGGCGTACTCGTGATGTTCAAThClock Прямой CTACACCTCAGTTCATCAAGGAAATGОбратный ATATCCACTGCTGGCCTTTGGпланшетах на инструменте ABI PRISM 7700 (для клеток мышей и человека) и в 384-луночных планшетах на инструменте ABI PRISM 7900 (для клеток рыб). В каждую реакцию включали 6 (для клеток мышей) или 9 (для клеток человека) образцов кДНК (полученных с контрольной РНК) для построения стандартной кривой.

Образцы приготавливали путем последовательного двухкратного разведения контрольной РНК, начиная с концентрации 250 нг для клеток мышей или с 500 нг для клеток человека. При проведения каждого теста включали также образец, содержащий реакционную смесь без кДНК. Каждый образец кДНК анализировали в триплетах. Все образцы, относящиеся к одной популяции клеток (SP клетки, смешанная популяция костного мозга, СБ34±клетки) включали в одну реакцию (на одномпланшете). Все образцы клеток рыб анализировались для каждого гена в одной реакции на одном планшете.

Реакционная смесь К-ОТ-ПЦР кДНК образцов клеток рыб Danio rerio содержала 5 мкл 2 х SYBR Green Universal PCR Master Mix (для оценки экспрессии генов-мишеней) или 0.5 мкл 2 х TaqMans Gene Expression Assays и 5 мкл 2 x TaqMan Universal PCR Master Mix (для определения экспрессии 18S), по 300 нМ (по 0.25 мкл) каждого праймера, 2 мкл кДНК и дистиллированную воду до конечного объема 10 мкл.

Стандартные кривые, полученные в результате анализа образцов контрольной кДНК использовали для оценки качества и эффективности проведенной реакции и для определения относительного количества каждого из тестируемых образцов. Величина наклона стандартных кривых составляла -3.1 — -3.3, что подтвердило эффективность поставленных К-ОТ-ПЦР.

Обработка данных и статистический анализНормализация данныхАнализ результатов реакций К-ОТ-ПЦР проводили с использованием метода калибровочных кривых. Стандартные кривые, построенные по данным показателей разведений контрольных РНК, использовали для вычисления экспрессии генов [Bender J. G., et al., 1992, Bustin S., 2002]. Такой метод позволял стандартизировать данные, полученнные при анализе генов в разных К-ОТ-ПЦР (на разных планшетах). В хронобиологических экспериментах для уменьшения неточности вычислений экспрессии генов при нормализации данных вместо одного контрольного гена (эндогенного контроля) использовали среднюю геометрическую величину от трех (мышиные клетки) или четырех (человеческие клетки) генов, выбранных вкачестве эндогенного контроля [Уапёезошре1е I., е1 а1., 2002]. При этом экспрессию каждого из контрольных генов определяли как среднюю от показателей триплетов, полученных в отдельной К-ОТ-ПЦР. Экспрессия тестируемых генов определялась путем деления средней величины экспресии гена в триплетах (количество определялось по данным стандартных кривых) на среднюю геометрическую величину экспресии трех или четырех эндогенных контролей. В остальных экспериментах экспрессия генов определялась таким же методом, но в качестве величины эндогенного контроля использовалась средняя величина (значений в триплетах) экспрессии одного контрольного гена — 36В4 в опытах с кроветворными клетками и клетками печени мышей, и 18Б — в опытах с клетками рыб.

В каждой серии экспериментов на основании данных экспресии всех образцов, предварительно нормализованных к экспрессии эндогенных контролей (как описано выше), вычисляли среднюю величину экспрессии отдельного гена. Эту величину принимали за 100%, и относительно этой величины в процентах выражали экспрессию каждого отдельного образцаотносительный уровень экспрессии гена, или точнее — мРНК. Данные, соответствующие определенному времени забора клеток (СТ) в разных сериях экспериментов, объединялись для окончательного статистического анализа, т. е. при анализе хронобиологических экспериментов на мышах объединялись 3 значения, а у доноров — 10 значений. Кроме того, определяли стандартную ошибку средней (± 8ЕМ).

Изменения концентрации гормонов и количества клеток крови также выражали в процентах от средней величины всех значений этих показателей (принятой за 100%) в данной серии экспериментов.

Статистическая обработка результатовВ хронологических экспериментах на мышах и у доноров для выявления суточных ритмов данные изменения температуры тела, концентраций/Icroplias"ipesK of fitted towne) ->i• 'Amplitude (tfiSiSrt" from Щ50Г to peak or trough of cosine)/II11 lllVpliaS*ffoiresi poinf ofco5i'ieJBpst-fming cosine curve by least-squares methodIWiud ofBesl-Шпд Conn" f" 36Q'jHlcnp/Kfistera0306 Oil 12 15 18 TIME.

В остальных экспериментах вычислялся t-критерий Стьюдента с помощью программы GraphPad Prism, версия 3 (GraphPad Software, San Diego, CA). Эту же программу использовали для построения части графиков.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

1. Методический подход, сочетающий использование высокоскоростной проточно-цитометрической сортировки и методы молекулярной биологии, позволяет изучать внутриклеточные суточные ритмы в редких популяциях кроветворных стволовых клеток. Этот подход также успешно использован для изучения кроветворных стволовых клеток рыб Danio rerio.

2. Впервые определена экспрессия ключевых clock генов и изучены изменения активности этих генов в течение суток в стволовых клетках в сравнение с общей популяцией клеток костного мозга. В этих популяциях выявлены различия в относительных уровнях экспрессии генов, наиболее выраженные для mPerl и mCryl.

3. Показано, что в отличие от клеток общей популяции костного мозга мышей в стволовых кроветворных клетках отсутствуют суточные ритмы в колебаниях активности большинства clock генов (кроме тРег2). Выявленные различия позволяют предположить, что регуляция ритмов в кроветворной ткани зависит от степени зрелости клеток.

4. Впервые определена активность ключевых clock генов в общей популяции клеток костного мозга человека и в изолированной популяции стволовых клеток и клеток-предшественников.

5. В кроветворных стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга человека впервые выявлены достоверные суточные ритмы в изменение активности hPerl, hPer2 и hCry2.

6. Отсутствие циркадных ритмов в изменениях экспрессии В mall в течение суток в разных популяциях кроветворных клетках мышей и человека, позволяет считать, что изменение активности этого гена в кроветворной ткани в отличие от других периферических тканей и органов происходит неритмично.

7. Формирование и регуляция ритмов в кроветворной ткани млекопитающих имеют характерные отличия от других периферических тканей и органов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В последние годы благодаря успехам молекулярной биологии удалось охарактеризовать систему формирования циркадных ритмов на внуриклеточном (молекулярном) уровне. Clock гены, являющиеся основными компонентами этой системы, были описаны не только в центральном осцилляторе — нейронах СХЯ гипоталамуса, но и в клетках многих периферических тканей и органов. Более того, накопилось большое количество данных, свидетельствующих об участии периферических часов в адаптационных реакциях организма посредством регуляции его многих жизненно важных функций.

Вместе с тем, не во всех периферических тканях и функциональных системах организма процессы регуляции циркадных ритмов изучены одинаково хорошо. Так, несмотря на наличие достаточного количества фактов, свидетельствующих о том, что процесс гемопоэза происходит ритмично, система координации ритмов в кроветворной ткани, в иммунной, системе изучена крайне мало. До сих пор не исследовались кроветворные и иммунные клетки человека, отсутствовали данные о процессах формирования ритмов в стволовых клетках. Представленная работа, относящаяся к двум наукам — иммунологии и хронобиологии, планировалась для восполнения этих пробелов, и этим определяется ее актуальность. Целью данного диссертационного исследования явилось изучение clock генов в стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга мышей и чнловека.

Научные задачи работы можно обобщить в две основные группы: (1) определить экспрессию clock генов в кроветворных стволовых клетках и клетках-предшественниках мышей и человека и (2) изучить изменение активности clock генов в течение суток в стволовых клетках и клеткахпредшественниках костного мозга мышей и человека. Однако, для выполнения указанных задач прежде всего было нужно найти решение методологической задачи — разработать адекватный современный методический подход для изучения clock генов в очищенных популяциях стволовых клеток. Эту задачу удалось решить, объединив два современных метода — высокоскоростной проточно-цитометрической сортировки и К-ОТ-ПЦР (в режиме реального времени). Результаты тестовых экспериментов на кроветворных клетках мышей показали, что сортировка не вызывает изменения качества выделяемой РНК, не влияет на экспрессию тестируемых генов (clock генов) и не отражается на способности клеток костного мозга образовывать колонии клеток in vitro. Более того, разработанный методический подход был апробирован на кроветворных клетках рыб Danio rerio, что позволило впервые описать стволовые клетки у данного вида. Внедрение методики в нескольких лабораториях и ее успешное использование для анализа редких популяций стволовых клеток и клеток-предшественников, подтверждает ее универсальность.

Использование данного подхода позволило прежде всего определить экспрессию ключевых clock генов в разных популяциях кроветворных клеткок: стволовых клетках и клетках смешаной популяции костного мозга, включающей клетки, находящиеся на разной стадии дифференцирови, и зрелые клетки, в том числе клетки иммунной системы. Были выявлены различия в относительном уровне экспрессии clock генов как между тестируемыми популяциями кроветворных клекок (в частности, mPerl у мышей и hBmall у человека), так и между клетками разных видов (человека и мышей).

Впервые были изучены суточные изменения активности clock генов в кроветворных стволовых клетках мышей в сравнении со смешаной популяцией клеток костного мозга. В противоположность более зрелым клеткам в стволовых клетках циркадные ритмы в изменении экспрессии большинства тестируемых генов (кроме mPerl) отсутствовали. Полученные в этих экспериментах данные подтвердили гипотезу о том, что формирование ритмов в кроветворной ткани зависит от степени дифференцировки клеток.

В представленном диссертационном исследовании впервые проведена оценка экспрессии основных clock генов в стволовых клетках и клетках-предшественниках костного мозга человека. При изучении изменении активности clock генов были выявлены циркадные ритмы в трех ключевых генах. Полученные результаты свидетельствуют о наличие молекулярных механизмов регуляции циркадных ритмов в системе кроветворения у человека, которые могут быть использованы для регуляции гемопоэза с лечебной целью в клинической онкологии, гематологии и иммунологии.

Эсперименты на клетках костного мозга мышей и человека показали, что изменение активности одного из ключевых clock генов Bmall, играющего ключевую роль в формировании циркадных ритмов во многих периферических тканях, в кроветворных клетках происходят неритмично. Интересно отметить, что отсутствие циркадных ритмов в изменении активности этого гена было выявлено во всех тестируемых популяциях кроветворных клеток — от стволовых до дифференцированных и зрелых клеток, то есть на всех этапах гемопоза. Полученные данные указывают на то, что система формирования ритмов в кроветворной ткани отличается от других периферических тканей и органов. Можно предположить, что выявленные особенности регуляции циркадных ритмов в клетках костного мозга связаны с их специальной функцией — гемопоэзом.

Таким образом, полученные в исследовании данные позволяют сформировать представление о молекулярных основах формирования ритмов в кроветворных стволовых клетках и клетках-предшественниках мышей и человека и обосновывают возможность разработки хронобиологически-обоснованной регуляции гемопоэза для терапевтических целей.