Структурно-функциональная организация домена альфа-глобиновых генов кур

Транскрипционная активность эукариотических генов регулируется на нескольких уровнях, в том числе на уровне индивидуальных промоторов и на уровне так называемых геномных доменов, которые правильнее было бы называть хроматиновыми доменами. Принципиальным отличием пространственной организации эукариотического генома является упаковка его в хроматин, которая позволяет значительно сократить линейные размеры ДНК, обеспечивая возможность размещения ее в относительно небольшом (~ 10 мкм в большинстве случаев) клеточном ядре. Было бы, однако, неправильным утверждать, что упаковка ДНК в хроматин обеспечивает лишь сокращение линейных размеров ДНК. На этом уровне работают и специальные регуляторные механизмы, контролирующие транскрипционный статус протяженных областей генома. Более 30 лет назад было продемонстрировано, что транскрипционная активность большинства генов коррелирует с уровнем доступности этих генов для переваривания ДНКазой I и другими нуклеазами. Позднее было продемонстрировано, что предпочтительной чувствительностью к нуклеазам обладают не только собственно транскрибирующиеся гены, но и фланкирующие геномные области, которые могут быть достаточно длинными и включать как транскрибирующиеся, так и нетранскрибирующиеся гены. Такие области и получили название геномных доменов. Мы говорим о том, что более правильно было бы называть эти области хроматиновыми доменами в связи с тем, что транскрипционный статус таких областей-доменов регулируется на уровне изменения характера упаковки ДНК в наднуклеосомные хроматиновые структуры. Имеется в виду, прежде всего 30 нм. хроматиновая фибрилла, которая может разворачиваться в так называемую нуклеосомную нить (структуру типа «бусинок на нити», описание и фотографии которой можно найти во всех современных учебниках по молекулярной биологии). Динамика конформационных изменений 30 нм хроматиновой фибриллы регулируется ацетилированием гистонов.

Четкая связь между геномными доменами (как функциональными единицами генома, находящимися под контролем определенных регуляторных механизмов) и хроматиновыми доменами впервые была продемонстрирована в экспериментах Грудина и соавторов [Forrester et. al., 1990]. Этими авторами было показано, что не затрагивающая собственно глобиновых генов делеция 5'-концевой области кластера бета-глобиновых генов человека приводит к одновременному прекращению транскрипции бета-глобиновых генов и переходу в компактную (устойчивую к ДНКазе I) конфигурацию протяженного хроматинового домена, включающего весь кластер бета-глобиновых генов и фланкирующие последовательности ДНК. Одновременно изменялось и время репликации (тайминг репликации) соответствующей геномной области. Подобно большинству геномных областей, не содержащих активных генов, репликация этой области происходила в конце S-фазы, в то время как активно работающий домен бета-глобиновых генов реплицируется в начале S-фазы. Последующие эксперименты позволили идентифицировать ключевой регуляторный элемент, контролирующий транскрипционный статус домена бета-глобиновых генов [Grosveld et. al., 1987]. С этого времени домен бета-глобиновых генов человека стал классической моделью для изучения механизмов, контролирующих транскрипционный статус протяженных геномных областей на доменном уровне. Со временем к этой модели добавились домены бета-глобиновых генов других позвоночных, домен овальбуминовых генов и гена лизоцима кур, домен гена аполипопротеина В человека. Анализируя все эти исследования в ретроспективе, невольно удивляешься тому, что целый ряд принципиальных заключений, касающихся доменной организации генома был сделан на основе анализа столь малого числа экспериментальных моделей. О каких, собственно, заключениях идет речь? Прежде всего, о том, что домены тканеспецифичных генов могут находиться в активном, либо неактивном состоянии, что четко коррелирует с чувствительностью (соответственно высокой иди низкой) этих доменов к ДНКазе I. Вторым важным заключением являлось то, что геномные домены являются изолированными и в определенном смысле самодостаточными единицами генома, что обеспечивается наличием в их составе регуляторных элементов доменного уровня получивших название Областей Контроля Локуса (Locus Control Region, LCR). Ключевым аргументом, подтверждающем это второе утверждение явилась демонстрация того, что полноценные домены либо мини-домены, сконструированные из области контроля локуса и одного или нескольких генов, были способны нормально работать в эктопических геномных позициях, в том числе и в геноме трансгенных животных других видов.

Было бы очень заманчивым представить, что весь геном состоит из более или менее единообразно построенных структурно-функциональных единиц (доменов), работа которых регулируется сходными механизмами. Это, несомненно, могло бы существенно облегчить познание общих принципов работы генома, однако в природе даже для решения сходных задач часто используются совершенно различные пути. Это в полной мере относится и к геномным доменам. Известно, что гемоглобин построен из цепей альфаи бетатипов. Альфа-глобиновые цепи кодируются альфа-глобиновыми генами, которые организованы в кластер. Этот кластер находится в хроматиповом домене, который резко отличается от тех доменов, которые обсуждались выше. Основной особенностью этого домена является то, что он одинаково чувствителен к ДНКазе в эритроидных и неэритроидных клетках. Иными словами нарушается казавшийся классическим принцип корреляции между транскрипционным статусом гена (генного кластера) и чувствительностью к ДНКазе, а, следовательно, и способом упаковки хроматинового домена. Неясным становится и вопрос о том, что собственно следует считать в данном случае геномным доменом. Ведь при рассмотрении всех упоминавшихся выше модельных систем границы домена определялись по чувствительности к ДНКазе. Тем не менее, существуют веские основания считать, что альфа-глобиновые гены также являются частью протяженного хроматинового домена, транскрипционный статус которого регулируется особыми механизмами. Мы назвали такие домены доменами открытого типа или доменами с размытыми границами. В настоящей работе будут рассмотрены основные принципы организации и регуляции работы доменов открытого типа на примере домена альфа-глобиновых генов кур. Актуальность работы определяется тем, что домены открытого типа встречаются в геноме достаточно часто, а возможно, составляют большую его часть. Именно по этой причине столь узок был круг экспериментальных моделей, использовавшихся при изучении «классических» доменов, подобных домену бета-глобиновых генов кур. Раскрытие базовых принципов работы доменов открытого типа существенно расширяет наши представления об организации и работе эукариотического генома в целом. Очевидно, что эта информация является принципиально важной и для решения практических задач в области биотехнологии и генной терапии.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

I. ДОМЕННАЯ ГИПОТЕЗА ОРГАНИЗАЦИИ ЭУКАРИОТИЧЕСКОГО ГЕНОМА.

Хотя о доменах эукариотического генома написано немало экспериментальных и обзорных статей [Goldman, 1988; Razin et. al., 1993; Razin, 1996; Geyer et. al., 1997; Dillon et. al., 2000], термин этот остается неоднозначным. Можно говорить, по меньшей мере, о двух типах доменов: функциональных и структурных. Классическими функциональными доменами являются единицы транскрипции (транскриптоны) и единицы репликации (репликоны). Наиболее четко определенными структурными доменами являются предпочтительно чувствительные к нуклеазам области. Предпочтительная чувствительность к ДНКазе I активных генов была впервые продемонстрирована в работах Вайнтрауба и Грудина [Weintraub et. al., 1976]. Они показали, что в процессе обработки ДНКазой I изолированных ядер клеток из разных тканей, ДНК, кодирующая глобины, преимущественно переваривается в красных кровяных клетках, но не в фибробластах или клетках мозга. В то же время, не транскрибирующиеся в этих типах клеток гены овальбумина были относительно устойчивы к действию ДНКазы. Результаты этих экспериментов позволили предположить, что транскипционпо активные и неактивные гены по-разному упакованы в хроматине. В последующих экспериментах других авторов эта точка зрения получила дополнительные подтверждения. Кроме того, было показано, что предпочтительной чувствительностью к ДНКазе I обладают потенциально активные гены. Фактический уровень транскрипции тех или иных генов не коррелировал с чувствительностью к ДНКазе кодирующих последовательностей ДНК. Изучая домен овальбуминовых генов, Гаррел с соавторами показали, что предпочтительная чувствительность к ДНКазе I характерна для протяженного геномного домена, включающего как активные гены, так и нетранскрибирующиеся псевдогены.

Garel et. al., 1976; Garel et. al., 1977]. Мультигенное семейство овальбуминовых геновклассический пример ДНКаза-чувствительного домена, который включает как активные, так и неактивные гены, а именно: два псевдогена (X, Y) и собственно ген овальбумина.

Рисунок 1. Относительная чувствительность ДНК к расщеплению ДНКазой I в клетках яйцеводов курицы. Домен овальбуминовых генов кур. Положение овальбуминовых генов показано прямоугольниками.

Транскрипция генов происходит под воздействием эстрогена в яйцеводе курицы в пропорции C>V:X:Y=100.i0:l [Knoll et. al., 1981]. Лоусон и соавт. [Lawson et. al., 1982] показали, что область, включающая овальбуминовый ген, упомянутые выше псевдогены, спейсерные и фланкирующие последовательности, находится в ДНКаза-чувствительной конфигурации в клетках яйцеводов (Рис.1). ДНКаза-чувствительная область распространяется и далее в 5'-направлении от псевдогена X приблизительно на 20 т.п.и., и на такое же расстояние в З'-сторону после овальбуминового гена. На границах домена переход к закрытой (нечувствительной к ДНКазе I) области происходит достаточно быстро — на отрезке в 10 т.п.н. Таким образом, полный размер ДНКаза-чувствительного домена составляет около 100 т.п.н. Надо сказать, что организация ДНКаза-чувствительного домена связана с клеточной дифферецировкой, а не с транскрипцией овальбуминового гена. При прекращении гормональной стимуляции транскрипция овальбумина останавливается, но конфигурация домена остается открытойчувствительной к ДНКазе I. В других тканях (печени, селезенке) весь домен характеризуется относительной устойчивостью к ДНКазе I. Авторы цитированной выше работы предложили модель, связывающую феномен предпочтительной чувствительности к ДНКазе тканеспецифичных генов и клеточную дифференцировку (Рис.2). Они предположили, что в процессе дифференцировки эмбриональных стволовых клеток тканеспецифичные гены в разных типах клеток включаются в состав предпочтительно чувствительных к нуклеазам доменов. В отсутствие дополнительных модуляторов транскрипции эти декомпактизованные домены не транскрибируются. Под воздействием индукторов, таких как гормоны для овальбуминового семейства в клетках яйцевода, гены в домене становятся транскрипциоппо активными, а домен продолжает оставаться ДНКаза-чувствительпым. В настоящее время схема поэтапной активации генов (сначала на уровне хроматинового домена, а потом на уровне индивидуальных промоторов) является общепризнанной.

Изменение чувствительности к ДНКазе I в зависимости от типа клеточной дифференцировки характерно и для доменов ряда других тканеспецифичных генов. Так, домен гена лизоцима кур характеризуется повышенной чувствительностью к ДНКазе I в клетках макрофагов и относительной резистентностью к ДНКазе в других типах клеток. [Janzen et. al., 1986]. ДНКаза-чувствителыгая область включает в себя транскрипционную единицу размером 4 т.п.н. и распространяется на 14 т.п.н. в 5'- и на 6 т.п.н. в 3'-направлении. Переход к ДНКаза-устойчивой конфигурации хроматина достаточно постепенный с 5'-стороны и резкий в З'-области, как и в случае доменов генов овальбумина [Lawson et. al., 1982] и GAPDH [Alevy et al., 1984]. эмбриональные, стволовые клетки.

IDUJIUDDIC М1С1ЯЛ> дифференцировка «(гормоны?) ^ Е.

Шл Ш, клеточный тип 1 клеточный тмп 2 индукция |.

I | (гормоны) | | транскрипционно неактивный ген ¦ транскрипционно активный ген.

ДНКаза I устойчивая структура.

ДНКаза I чувствительные домены.

Рисунок 2. Модель образования чувствительных к ДНКазе I доменов во время клеточной дифференцировки (комментарий в тексте) [Lawson et. al., 1982].

Феномен повышенной чувствительности к ДНКазе I обычно объясняют переходом 30 нм хроматиновой фибриллы в так называемую развернутую структуру типа «бусинок на нити». Постепенное изменение чувствительности на границе может быть связано с тем, что в популяции клеток изменение копформации хроматиновой фибриллы начинается в разных точках в пределах некоторой зоны на молекуле ДНК. Помимо общей повышенной чувствительности к ДНКазе I существуют так называемые участки гиперчувствительности к этому ферменту. Как правило, это свободные от нуклеосом участки, в которых расположены разные регуляторные последовательности. В домене гена лизоцима цыпленка участки гиперчувствительности к ДНКазе I расположены кластерами перед и после транскрипционной единицы, за одним исключением, и все в границах домена. Наличие гиперчувствительных сайтов на достаточном расстоянии от гена, но внутри домена указывает на возможность контроля экспрессии из отдаленных районов. Эта точка зрения нашла прямое подтверждение в работах Тейсена [Theisen et. al., 1986] и Гревала [Grewal et. al., 1992]: выяснилось, что гиперчувствительный сайт -6.1 т.п.н. проявляет энхансерную активность и является мишенью для связывания ядерного фактора NF1 и некоторых других регуляторных белков.

Домен бета-глобиновых генов кур необычен с точки зрения расположения генов и компактности (Рис.3).

HSA.

FR ген v.

Инсулятор CTCF 5'HS4.

LCR ш p|3H (3Ae.

Ш II I I.

16 т.п.н. конденсированный хроматин.

CTCF 3'HS.

V7.

3/8 0RreH энхансер

Рисунок 3. Схематическое изображение домена бета-глобиновых генов кур.

Гены расположены в следующем порядке 5'-р-р" -рд-б-3'- расположенные в центре гены взрослых животных (Рн и (3А) окружены эмбриональным геном р и фетальным геном е [Villeponteau et. al, 1982]. Согласно гипотезе К. Шеррера о том, что АТ-богатые области являются естественными границами геномных доменов, считалось, что домен имеет размер порядка 20 т.п.н. [Moreau et al., 1982], однако более поздние эксперименты Хеббса и соавт. расширили его границы до 33 т.п.н. Также в работе Хеббса было продемонстрировано, что область чувствительности хроматина к ДНКазе I совпадает с областью гиперацетилирования коровых гистонов [Hebbes et al., 1994]. Индивидуальные промоторы регулируют экспрессию каждого бета-глобинового гена при участии эритроидных и общих транскрипционных факторов: GATA-1, EKLF, NF-E2, Spl и других. Кроме того, в состав домена входит эритроидспецифичный энхансер (fiA/e), который расположен между взрослым 13Л и эмбриональным е генами [Choi et al., 1986; Hesse et al., 1986]. Энхансер BA/e является общим для двух генов и содержит сайты связывания различных транс-действующих факторов, специфичных для каждой стадии развития. Конкуренция между этими регуляторными факторами и определяет предпочтительную мишень для действия энхансера [Foley et al., 1992]. Энхансер BA/s может направлять экспрессию, зависящую от количества копий, репортерного гена у трансгенных мышей [Reitman et al., 1990], но этот энхансер сам по себе не может «открывать» хроматин. В 5'-некодирующей области домепа идентифицировано четыре сайта гиперчувствительности к ДНКазе I [Reitman et al., 1993] В домене бета-глобиновых генов три эритроидспецифичных гиперчувствительных сайта расположены относительно близко к генам. С 5'-стороны домен отделен от прилегающего хроматина четвертым сайтом гиперчувствительности, который содержит CTCF-зависимый инсулятор и определяет границы домена [Reitman et al., 1990; Chung et al., 1993; Bell et al., 1999]. Еще один участок гиперчувствительности к ДНказе I колокализуется с ВА/е энхансером. В З'-концевой области домена бета-глобиновых генов не обнаружено никаких регуляторных элементов. З'-граница домена отмечена, по-видимому, сайтом гиперчувствительности, расположенным на расстоянии 3 т.п.н. после эмбрионального гена. В этом участке гиперчувствительности к ДНКазе I располагается CTCF-зависимый инсулятор. Любопытно, что этот инсулятор обладает способностью блокировать активность энхансеров, но не защищает трансгены от позиционных эффектов [Saiton et al., 2000]. Таким образом, весь домен бета-глобиновых генов кур расположен между двумя инсуляторами. Перед доменом располагается область конденсированного хроматина, протяженность которой (на молекуле ДНК) составляет 16 т.п.н. [Prioleau et al., 1999; Litt et al., 2001]. Далее следует ген фолатного рецептора. С З'-стороны к домену бета-глобиновых генов примыкает кластер генов обонятельных рецепторов.

Можно привести и другие примеры доменов тканеспецифичных генов, обладающих повышенной чувствительностью к ДНКазе в тех типах клеток, где соответствующие гены экспрессируются. Это домены гена глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH) [Alevy et al., 1984], аполипопротеина В человека [Levy-Wilson et al., 1989], вителлогенина [Tata et al., 1980], протамина [Levy-Wilson et al., 1980 ], инсулина [Wu et al., 1981], домены бета-глобиновых генов млекопитающих [Stalder et. al., 1980; Tuan et. al., 1985; Forrester et. al., 1986]. Все перечисленные домены являются достаточно протяженными (более 100 т.п.и. в случае домена овапьбуминовых генов кур) и характеризуются предпочтительной чувствительностью к ДНКазе только в определенных типах клеток. Они могут включать один или несколько (часто функционально сцепленных) генов и межгенные пространства. Границы ДНКаза-чувствительных доменов являются достаточно четкими. Переход от ДНКаза-чувствительной области к области, характеризующейся относительной устойчивостью к ДНКазе, происходит в пределах фрагмента ДНК протяженностью в несколько т.п.н. Это позволяет предположить, что существуют некие специальные элементы генома и соответствующие им структуры хроматина, которые являются границами ДНКаза-чувствительных доменов. Разумеется, ДНКаза-чувствительные домены не являются единственным типом структурных доменов хроматина. Существуют еще закрепленные на ядерном матриксе петли ДНК, имеющие размеры, сопоставимые со средними размерами ДНКаза-чувствительных доменов [Razin et. al., 1996] и существенно более протяженные домены — «изохоры», характеризующиеся относительным постоянством нуклеотидпого состава ДНК [Bernardi, 2000].

ДНКаза-чувствительные домены генома привлекли особое внимание исследователей, прежде всего потому, что очевидна была определенная зависимость между статусом этих доменов и транскрипционной активностью соответствующих генов.

Механизм этой зависимости долгое время оставался неясным. Серия недавно проведенных исследований позволяет предложить, что переход геномного домена в открытую (чувствительную к ДНКазе) конфигурацию связан с ацетилированием гистонов [Davie, 1996].

Можно говорить о том, что чувствительные к ДНКазе I домены хроматина являются некими структурно-функциональными блоками генома, которые могут находиться в активном либо неактивном состоянии в зависимости от типа клеток, или, иными словами, в зависимости от неких дополнительных сигналов. Это положение составляет основу так называемой доменной гипотезы структурно-функциональной организации эукариотического генома [Bodnar, 1988; Goldman, 1988]. Данная гипотеза приобрела особую привлекательность после того, как были обнаружены так называемые области контроля локуса (LCRs), которые, как следовало из результатов первоначальных экспериментов, осуществляют контроль над всеми параметрами (характер ацетилирования гистонов, транскрипционный статус и время репликации) протяженных доменов генома [Grosveld et. al., 1987; Forrester et. al, 1990].

II. ПОДТВЕРЖДЕНИЕ ДОМЕННОЙ ГИПОТЕЗЫ В ЭКСПЕРИМЕНТАХ ПО ИЗУЧЕНИЮ ДОМЕНА БЕТА-ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ.

Домен бета-глобиновых генов человека расположен в GC-бедной области (изохоре) 11-й хромосомы. Для подобных бедных генами и поздно реплицирующихся областей характерны высокая степень упаковки хроматина и множественность контактов с ядерным матриксом [Hardison et al., 1998; Craddock et al., 1995]. Домен бета-глобиновых генов, размером около 100 т.п.н., включает эмбриональный ген — е, два фетальных генаGy и Ау и два взрослых гена — 8 и р (Рис.4). Все эти гены транскрибируются в одном направлении. Порядок генов в домене соответствует времени их активации в процессе развития. В эритроидных клетках взрослого человека экспрессируются только 5 и |3 гены. При изучении домена бета-глобииовых генов человека была обнаружена первая, и в известном смысле «классическая» область контроля локуса (рис.4). Областью контроля локуса — LCR (locus control region) принято называть регуляторный элемент, контролирующий транскрипционный статус одного или группы генов на уровне геномного домена. В экспериментах для идентификации области контроля локуса часто используют тест на обеспечение независимого от позиции интеграции уровня экспрессии трансгенов (смотри ниже). Первые свидетельства существования области контроля локуса домена бета-глобиновых генов человека были получены при изучении делеций, приводящих к талассемиям (заболеваниям, связанным с нарушением экспрессии глобиновых генов). Анализ характера геномных нарушений при разных формах талассемии показал, что участки ДНК, расположенные на расстоянии более 5 т.п.н. перед кластером бета-глобиновых генов человека, необходимы для нормальной экспрессии этих генов [Kiossis et. al., 1983; Curtin et. al., 1985]. А.

HSS -6.1 — -21.5 10 т.п.н. I-1 5 р П П.

5 4 3 2 1 та п Gy Ay П П.

11 эмбриональный L | фетальные '— | взрослые.

Ранореплицирующийся. ДНКазочувствнтельный. транскрнпционно активный 1.

Испанская делеция G-/ g ^ п? ?? ?

I—I II II эмбриональный фетальные взрослые.

Позднореплицирующийся. ДНКазоустойчивый. транскрипцнонно неактивный.

HSS-6.1- -21.5.

10 т.п.н., шшшш.

Строение мини-домена.

Опыты на трансгенных мышах чшшш.

Рисунок 4. А — Идентификация области контроля локуса домена бета-глобиновых генов человека. Схема нормального бета-глобинового локуса человека и локуса. поврежденного Испанской делецией. Гены обозначены белыми прямоугольниками. Стрелками показаны позиции ДНКаза I гиперчувствительных сайтов (HSS)l-5. Пунктиром обозначена область распространения Испанской делении [Grosveld et. al., 1987; Forrester et. al., 1990]. Б. Демонстрация активности области контроля локуса из домена бета-глобиновых генов человека. в экспериментах с трансгенными мышами [Grosveld et. al., 1987]: схема конструирования мини-домена (слева) — анализ экспрессии трансгена — зависимость уровня синтеза [3-глобиновой мРНК от количества копий интегрированного конструкта (справа).

В независимых экспериментах было установлено, что на расстоянии 6−22 т.п.н. перед кластером бета-глобиновых генов человека находится блок участков гиперчувствительности к ДНКазе I, включающий четыре эритроидспецифичных и один перманентный участок [Forrester et. al., 1986; Tuan et. al., 1985]. Как уже говорилось, участки гиперчувствительности к ДНКазе I в хроматине, как правило, обозначают положение различных регуляторных последовательностей в ДНК. Были обнаружены делеции 5'-концевой области домена, не затрагивающие собственно глобиновые гены и их промоторы, но приводящие, тем не менее, к развитию талассемий. В данном случае делеции и другие геномные перестройки, приводящие к талассемиям, всегда затрагивали блок участков гиперчувствительности к ДНКазе I. Наиболее короткая из известных делеций такого типа, так называемая Испанская делеция (приводящая к у5р-талассемии), содержит четыре участка гиперчувствительности и 25 т.п.н. перед ними (рис.5А). В эритроидных клетках, с Испанской делецией, домен бета-глобиновых генов находится в транскрипционно неактивном состоянии, является устойчивым к действию ДНКазы и позднореплицирующимся, в то время как в нормальных эритроидных клетках он активно транскрибируется и реплицируется в начале S-фазы [Forrester et. al., 1990].

Это позволило предположить, что блок участков гиперчувствительности к ДНКазе I, находящийся на расстоянии 6−22 т.п.н. перед кластером бета-глобиновых генов человека, является особым регуляторным элементом, который контролирует транскрипционный статус протяженного геномного домена на уровне упаковки этого домена в хроматин. Этот регуляторный элемент был назван областью контроля локуса (LCR).

Ключевые опыты, подтверждающие эту точку зрения, были сделаны на трансгенных мышах. В лаборатории Гросвельда было продемонстрировано, что фрагмент ДНК домена бета-глобиновых генов человека, содержащий четыре гиперчувствительных сайта (5'HSS 2−5, рис.5Б), будучи помещен перед всем кластером бета-глобиновых генов или перед одним из генов, обеспечивает высокий и не зависящий от места интеграции уровень экспрессии этих генов в эритроидных клетках трансгенных мышей [Grossveld et. al., 1987; Dillon et. al., 1993]. Практически сразу после этого было показано, что LCR домена бета-глобиновых генов человека работает аналогичным образом и в отношении других трансгенов, поставленных под его контроль [van Assendelft et. al., 1989; Talbot et. al., 1989].

В течение многих лет изучение организации и функциональной активности LCR было возможно лишь в модельных опытах на трансгенных мышах. Однако любая модельная система позволяет лишь частично воспроизвести реальную ситуацию. Существенным недостатком первых опытов по интеграции полного или частично делетированного локуса бета-глоби новых генов в геном трансгенных мышей была множественная интеграция конструкций. При микроинъекции конструкций в пронуклеус яйцеклетки, как правило, наблюдается тандемная интеграция значительного числа копий конструкции в одно и то же место генома [Henikoff, 1998]. Понятно, что в таком искусственно возникшем «ампликоне» возможно взаимное влияние регуляторных элементов, расположенных в повторяющихся блоках. Использование фаговых [Ramires-Solis et. al., 1995] и дрожжевых [Schlake et. al., 1994] систем сайт-специфической рекомбинации позволило получать трансгенных животных, геном которых содержит только одну копию генной конструкции [Tanimoto et. al., 1999]. Хотя такая модель более совершенна, однако и она не полностью отражает условия работы LCR в нормальной геномной позиции. Сейчас все более очевидно, что макроокружение и пространственная организация тех или иных геномных элементов в ядре эукариотической клетки заметно влияют на их работу [Francastel et. al., 2000]. В связи с этим чрезвычайно важен детальный анализ функциональной активности LCR и его отдельных блоков в нормальной геномной позиции.

Первый опыт такого рода поставила, в сущности, сама природа. В данном случае имеется в виду Испанская делеция и различные талассемии. Развитие техники направленных делеций (knock-out) позволило охарактеризовать результаты удаления отдельных блоков либо всего LCR из хромосомы. Понятно, что в случае с LCR человека опыты такого рода возможны лишь на культурах клеток. Результаты экспериментов по направленным делециям различных элементов LCR оказались довольно неожиданными. Как и предполагалось, делеции протяженных участков бета-глобинового LCR на человеческой хромосоме приводили к подавлению экспрессии глобиновых генов. Но в противоположность предположениям, базирующимся на изучении клеток с Испанской делецией, домен оставался чувствительным к ДНКазе и ранореплицирующимся. После удаления LCR сохранялось гиперацетилирование гистонов, характерное для активного хроматинового домена.

На основе этих экспериментов были сделаны выводы о том, что LCR не является необходимым для поддержания активной конфигурации бета-глобинового домена. Поскольку данные эксперименты были выполнены на культурах клеток, существовала вероятность того, что функция LCR является существенной на некоторых стадиях эмбрионального развития. Однако, вероятность подобного факта была исключена при изучении мышей, содержащих делеции в эндогенном бета-глобиновом LCR. Направленные делеции некоторых внутренних элементов мышиного бета-глобинового LCR практически не сказывались экспрессии бета-глобиновых генов, а делеции некоторых из 5'-гиперчувствительпых сайтов приводили к снижению уровня транскрипции не более чем на 20%. Делеция большей части мышиного LCR приводила к резкому снижению уровня транскрипции бета-глобиновых генов, как в культурах клеток, так и у трансгенных мышей. Однако, в отличие от сходной делеции у человека, транскрипция не была полностью подавлена в отсутствие LCR. Домен оставался ДНКаза-чувствительным и обнаруживал гиперацетилирование гистонов ИЗ и Н4 на всем своем протяжении. Кроме того, был сохранен правильный порядок включения бета-глобиновых генов в процессе развития. В соответствии с результатами этих исследований, делеция 5' HSS 1−4 у мышей также вызывала бета-талассемический фенотип с низким уровнем экспрессии взрослых бета-глобиновых генов в мутантной аллели гетерозиготных мышиных особей. При низком уровне экспрессии в мутантной аллели нормальный уровень экспрессии наблюдался только в 1−3% эритроидных клеток, так как аллель была инактивирована в большей части клеток. Однако хроматиновая структура локуса еще не была подвержена изменениям в результате этой мутации.

Исходя из этих данных, было сделано заключение о том, что у мыши LCR не является необходимым ни для поддержания активной конформации домена бета-глобиновых генов, ни для обеспечения правильного порядка экспрессии этих генов в ходе развития [Bender et. al., 2000].

Все модели, предложенные для объяснения действия областей контроля локуса, фактически были разработаны для того, чтобы объяснить механизмы действия «классических» бета-глобиновых областей контроля локуса доменов млекопитающих и птиц. Гросвельд предположил, что для активации экспрессии какого-либо гена в домене бета-глобиновых генов, LCR должен непосредственно взаимодействовать с промотором соответствующего гена [Dillon et. al., 1997; Wijgerd et. al., 1995]. Это взаимодействие могло быть реализовано посредством выпетливания фрагмента ДНК, разделяющего LCR и промотор данного гена [Bulger et. al., 1999]. Со статистической точки зрения, возможность подобного взаимодействия возрастает при уменьшении расстояния между LCR и промотором. Следовательно, гены, расположенные ближе к LCR должны были иметь преимущество перед генами, расположенными дальше. В этом смысле может оказаться важным то обстоятельство, что бета-глобиновые гены млекопитающих расположены в порядке их активации в процессе развития [Peterson et. al., 1993].

У трансгенных мышей, несущих единственную копию кластера бета-глобиновых генов человека, эмбриональный ген е, расположенный ближе всего к LCR, наиболее сильно экспрессируется в желточном мешке, тогда как взрослый глобиновый ген (3 на этой стадии не экспрессируется. Противоположный характер экспрессии (активная экспрессия взрослого гена Р в желточном мешке и отсутствие экспрессии гена е) наблюдался в результате экспериментально индуцированной инверсии кластера бета-глобиновых генов, при которой ген Р был перемещен на ближнюю позицию к LCR, а ген s на наиболее отдаленную позицию [Tanimoto et. al., 1999]. Другие эксперименты также подтвердили предпочтительную экспрессию гена, наиболее близко расположенного к LCR [Dillon et. al., 1997]. Вторым важным аргументом в пользу «конкурентной» модели действия LCR является то, что только один из пяти бета-глобиновых генов может экспрессироваться на одной хромосоме в данный момент времени. Действительно, если LCR, находящийся на хромосоме, взаимодействует с промотором для инициации транскрипции, то одновременная инициация транскрипции на нескольких LCR-зависимых промоторах невозможна, что и было продемонстрировано экспериментально. Прямое взаимодействие промотора и LCR было названо «flip-flop» механизмом [Gribnau et. al., 1998; Trimborn et. al., 1999].

Хотя «конкурентная» модель и объясняет, почему эмбриональный глобиновый ген е начинает экспрессироваться первым в ходе развития, она не может объяснить механизм переключения экспрессии глобиновых генов, равно как и полное отсутствие экспрессии «взрослых» глобиновых генов человека на эмбриональной стадии развития. Действительно, домен бета-глобиновых генов находится в открытой конфигурации на протяжении эритроидного развития, а экспрессия гена е, который занимает наиболее близкую позицию по отношению к LCR, ограничена эмбриональной стадией. Следовательно, должен существовать особый механизм, предотвращающий экспрессию этого гена в эритроидных клетках взрослого организма. Более того, у человека взрослые бета-глобиновые гены не экспрессируются в желточном мешке даже па низком уровне, хотя «конкурентная» модель подразумевает, что все гены должны экспрессироваться, хотя и на разных уровнях. По-видимому, это имеет место у мышей, включение генов которых происходит в относительно небольшой промежуток времени, вследствие того, что у них короткие эмбриональная и фетальная стадии.

У человека экспрессия взрослых бета-глобиновых генов вероятно, сильно подавляется на эмбриональной стадии посредством механизма, отличного от простой конкуренции промоторов за LCR. Этот механизм может функционировать на уровне разделения кластера бета-глобиновых генов человека на «эмбрионально-фетальный» и «взрослый» субдомены [Gribnau et. al., 2000], о чем будет сказано ниже.

Стоит обратить особое внимание на то, что в «конкурентной» модели работы LCR промоторы индивидуальных генов рассматриваются как часть регуляторной системы доменного уровня. Для эффективного взаимодействия с LCR или, возможно, с белковым «холокомплексом», связанным с ним, белковые комплексы, связанные с промотором, должны иметь определенный уровень пространственной комплементарное&tradeс LCR-связывающим «холокомплексом» [Amrolia et. al., 1998; Bulger et. al., 2002; Langdon et. al., 1998; Sawado et. al., 2001]. В соответствии с вышеизложенным, можно сказать, что взаимодействие между LCR и эритроидспецифичиыми промоторами бета-глобиновых генов является существенным для функционирования регуляторных систем домена бета-глобиновых генов.

Вторая группа моделей, объясняющая механизм действия LCR постулирует, что LCR является местом сборки некоего активаторного комплекса, сигнал от которого потом распространяется в сторону промоторов. В этой связи важным представляется то, что для всех областей контроля локуса характерна высокая концентрация сайтов связывания транскрипционных факторов [Goodwin et. al., 2001; Hardison et. al., 1997].

Связавшись с LCR, транскрипционные факторы могут привлекать комплексы ремоделирования хроматина и ацетилирования гистонов. Действительно, было показано, что эритроидный Krueppel-like фактор (EKLF), который может связываться с G-T последовательностью в HSS 3 LCR и САССС-последовательностью в промоторе.

Р-глобинового гена [Tewari et. al., 1998; Wijgerde et. al., 1996], формирует комплексы с факторами ремоделирования хроматина SWI/SNF [Armstrong et. al., 1998]. Кроме того, было показано, что GATA-1, EKLF и NF-E2 взаимодействуют с гистонацетилтрансферазами [Zhang et. al., 1998]. Можно предположить, что гистонацетилтрансферазы и комплексы ремоделирования хроматина, имеющие сродство к LCR, в конечном итоге активируют соседние хроматиновые участки [Bresnick et. al., 1997; Elefant et. al., 2000; Forsberg et. al., 1999]. Однако это предположение не может объяснить активации удаленных промоторов, т. е. прогрессивного распространения активирующего сигнала. Поэтому было выдвинуто предположение о том, что транскрипция инициируется в LCR. Продолжаясь в направлении глобиновых генов, она обеспечивает активацию домена [Ashe et. al., 1997; Jonson et. al., 2003]. Известно, что элонгирующая PHK-полимераза, продвигаясь вдоль организованной в хроматин молекулы ДНК, перемещает вместе с собой сложный комплекс ферментов, обеспечивающий возможность так называемой «транскрипции через нуклеосомы». К числу этих ферментов относятся гистонацетилазы и факторы ремоделирования хроматина [Cho et. al., 1998; Wilson et. al., 1996; Wittschieben et. al., 1999]. Таким образом, низкоуровневая транскрипция может быть необходима для активации хроматинового домена [Travers, 1999]. В случае доменов бета-глобиновых генов эта гипотеза подтверждается рядом экспериментальных данных, свидетельствующих о том, что как сам LCR, так и межгенные области домена бета-глобиновых генов транскрибируются в эритроидных клетках [Kong et. al., 1997; Plant et. al., 2001]. Интересно, что полнодоменные транскрипты были обнаружены и в домене альфа-глобиновых генов кур [Broders et. al., 1990].

Строго говоря, упомянутая выше гипотеза Траверса может рассматриваться как развитие «сканирующей модели» работы LCR [Herendeen et. al., 1992; Tuan et. al., 1992]. Эта модель предполагает, что LCR служит местом сборки активаторного комплекса, сигнал от которого неким образом распространяется в сторону промоторов глобиновых генов. Траверс предложил конкретный механизм распространения активирующего сигнала. Подобно «flip-flop» модели сканирующая модель может объяснить важность порядка расположения в домене генов, работа которых находится под контролем LCR. Предпочтительно транскрибируется первый ген, с которым сталкивается на своем пути от LCR РНК-полимераза II. Но и эта модель не объясняет, каким образом осуществляется переключение работы глобиновых генов в ходе развития. Для инактивации эмбриональных генов в клетках взрослого организма должен существовать дополнительный механизм. Следовательно, «сканирующая» модель не полностью соответствует экспериментальным данным, по крайней мере, не в случае домена бета-глобиновых генов. Однако активация хроматиновых доменов посредством LCR в эктопических сайтах может происходить с помощью вышеописанного механизма. Смысл заключается в том, что функцией LCR является доставка транскрипционных факторов к нужному сайту. Это становится возможным вследствие высокой концентрации сайтов связывания для большого количества факторов (в пределах LCR). Важное значение высокой концентрации участков узнавания транскрипционных факторов в области LCR подтверждается двумя группами экспериментальных данных. Во-первых, было показано, что функция частично поврежденного LCR в эктопической прецентромерной позиции может быть компенсирована посредством суперэкспрессии таких транскрипционных факторов как EKLF или Spl [Grosveld, 1999; McMorrow et. al., 2000]. Во-вторых, конструкции, содержащие единственный участок гиперчувствительности (HSS 2), примыкающий к репортерному гену, обеспечивает позиционно-независимую экспрессию этого гена в эктопических сайтах, но только в случае множественной интеграции, то есть когда имеет место высокая локальная концентрация сайтов связывания транскрипционных факторов. Косвенно эта гипотеза подтверждается и тем фактом, что не было обнаружено ни одного особого транскрипционного фактора, связывающегося исключительно с LCR. Таким образом, нет оснований предполагать, что механизм работы этого регуляторного элемента должен принципиально отличаться от механизма работы обычного энхансера или тканеспецифичного энхансерно-промоторного блока.

Как уже было сказано ранее, бета-глобиновый локус млекопитающих может быть разделен на субдомены, регулируемые в процессе развития. На основе чувствительности к ДНКазе I в бета-глобиновом локусе человека можно выделить минимум три субдомена: LCR-субдомен, эмбрионально-фетальный и взрослый субдомены. LCR-субдомен находится в чувствительной к ДНКазе I хроматиновой конфигурации на протяжении всех эритроидных стадий развития, в то время как эмбрионально-фетальный и взрослый субдомены обнаруживают повышенную чувствительность к ДНКазе I только на эмбриональной, фетальной и взрослой стадиях соответственно. Примечательно то, что повышенная чувствительность к ДНКазе этих субдоменов коррелирует с появлением межгенных транскриптов, которые могут быть необходимы для активации субдоменов в соответствии с гипотезой Траверса. Лучшим подтверждением этого предположения является то, что делеция, которая включает сайт начала транскрипции межгенного транскрипта взрослого субдомена, приводит к исчезновению межгенной транскрипции и повышенной чувствительности к ДНКазе всего субдомена, равно как и к прекращению транскрипции находящихся внутри этого субдомена глобиновых генов [Gribnau et. al., 2000]. Таким образом, есть веские основания полагать, что «межгенная» транскрипция действительно нужна для «открывания» хроматинового домена [Engel et. al., 2000]. В соответствии с обсуждаемой моделью, транскрипция и открытая конформация LCR необходимы на всех стадиях развития для взаимодействия между LCR и эмбрионально-фетальным или взрослым субдоменами в течение определенной стадии, когда этот субдомен транскрибируется.

В дополнение к хроматиновым субдоменам, выделенным на основе чувствительности к ДНКазе, в бета-глобиновых локусах можно обнаружить различия в уровнях ацетилирования гистонов [Forsberg et. al., 2000; Forsberg et. al., 2001]. При этом области гиперацетилирования фактически колокализуются с областями предпочтительной чувствительности к ДНКазе I. При Испанской делеции уровень ацетилирования гистонов в домене бета-глобиновых генов резко снижается. Напротив, повышается уровень метилирования гистонов по ряду специфических позиций (например, К9 в гистоне НЗ), что приводит к переходу домена в более компактную конфигурацию.

III. ОСНОВНЫЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ ГЕНОМНЫХ ДОМЕНОВ.

выводы.

1. Разработан новый способ картирования геномных доменов открытого типа, основанный на характеристике распределения тканеспецифических участков гиперчувствительности к ДНКазе I.

2. Показано, что домен альфа-глобиновых генов кур находится на границе двух изохор, между которыми располагается нестабильная последовательность ДНК.

3. Продемонстрировано, что одной из важных характеристик нестабильных последовательностей ДНК в эукариотическом геноме является присутствие в их составе фазированных дипуклеотидов TG/CA, приводящих к скручиванию двойной спирали ДНК.

4. Обнаружен новый ген, который расположен в 5'-концевой области домена альфа-глобиновых генов и транскрибируется в направлении, противоположном направлению транскрипции глобиновых генов.

5. Продемонстрировано, что в эритроидных клетках весь кластер альфа-глобиновых генов и протяженная 5'-концевая область транскрибируются в составе полнодоменного транскрипта в направлении транскрипции глобиновых генов. Показано, что полнодоменная транскрипционная единица начинается в области расположения LCR-подобного позитивного эритроидспецифичпого регуляторного элемента.

6. Продемонстрировано, что в регуляции экспрессии домена альфа-глобиновых генов кур участвуют две группы негативных регуляторных элементов, расположенных в 5'-концевой области домена.

7. Продемонстрировано, что будучи помещенной перед промотором aD-reHa, метилированная последовательность ДНК CpG-островка из домена альфа-глобиновых генов кур, существенно подавляет активность этого промотора даже в том случае, когда сам промотор не метилирован.

8. Разработан новый метод изучения пространственной организации геномных доменов, основанный на гибридизации прилежащей к ядерному матриксу ДНК с олигонуклеотидными матрицами. С использованием этого метода изучена пространственная организация домена альфа-глобиновых генов кур.