Обнаружение отдельных генов и геномных последовательностей

С обнаружением отдельных генов или специфических геномных последовательностей связаны прежде всего возможности анализа микробных сообществ без выделения и идентификации отдельных его членов в чистых культурах. Методы основаны на экстракции из почвенных, осадочных или водных образцов тотальной ДНК, ее очистки и анализа с помощью градиентных гель-электрофорети- 4ecKHxTGGE/DGGE-MemaoB (подробнее см. гл. 6). Основная трудность при экстракции тотальной ДНК связана с ее отделением и очисткой от гуминовых веществ почвы, хотя методы, позволяющие проводить такую очистку, постоянно совершенствуются.

После экстракции ДНК подвергают иммобилизации на нитроцеллюлозном или нейлоновом фильтре, плавят и затем гибридизуют с известными последовательностями генов, ответственными за синтез тех или иных специфических ферментов. Так, наличие в пробе тотальной ДНК генов, гибридизуемых с геном, кодирующим нитрогеназу, говорит о присутствии в анализируемом сообществе азотфиксаторов, генов метанмонооксигеназы — о присутствии метанотрофов, а содержание генов РуБисКО — о наличии автотрофных микроорганизмов, фиксирующих углекислоту через цикл Кальвина. Генов, кодирующих ключевые реакции тех или иных процессов, расшифровано уже несколько десятков, и применение метода гибридизации дает возможность делать выводы о наличии определенных микроорганизмов в анализируемой пробе.

Мощный метод ПЦР позволяет идентифицировать неизвестные микроорганизмы, находящиеся в природной пробе, без выделения чистых культур. Разработаны «универсальные» праймеры на бактерии, археи и эукариоты, которые позволяют специфически амплифицировать последовательности этих трех разных групп микроорганизмов, разделить их с помощью TGGE/DGGE-методов, и затем, после вторичной амплификации отдельных полос, получить почти полный профиль микробного сообщества с идентификацией отдельных филогенетических линий и классификацией микроорганизмов на основе последовательностей 16S рРНК.

Для идентификации нужных микроорганизмов в сообществе используют гены-репортеры, которые легко обнаруживаются после проведения химических реакций (/ocZ-ген, кодирующий (З-галактозидазу и xylE-тен, кодирующий синтез ферментов метаболизма толуола) или заявляют о себе после экспрессии в клетке испусканием света различной длины волны (lux-гены или GFP-гены, кодирующие синтез зеленого флюоресцирующего белка). Гены-репортеры используют обычно для обнаружения тех или иных видов активности в природных образцах при определении выживаемости введенных в них микроорганизмов, для обнаружения экспрессии и изучения активности нужного гена/фермента, под контролем промотора которого экспрессируется и ген-репортер. Генетическая конструкция в таком случае выглядит и работает следующим образом. Если нужный ген экспрессируется и фермент осуществляет свою функцию (например, расщепляет тот или иной ксенобиотик), то об этом можно судить на удалении по люминесценции гена-репортера (например, в толще почвы свет от места реакции трансмиттируется в таком случае с использованием оптоволоконных световодов). По тушению люминесценции в генноинженерных штаммах E.coli судят о степени токсичности пробы воды или почвы.