Сомаклональная изменчивость. 
Биотехнология растений

Исследуя растения, регенерированные из культивируемых клеток, ученые установили, что растения-регенеранты не всегда идентичны исходным формам. Впервые это явление было описано в 70-х гг. XX века для регенерантов сахарного тростника и табака (рис. 1.16). Позднее индуцируемая в культуре in vitro и проявляющаяся у растений-регенерантов изменчивость получила определение «сомаклональной вариабельности», а измененные растения были названы «сомаклонами» или «сомаклональными вариантами».

Сомаклональная изменчивость представляет собой широко распространенное явление, так как она обнаружена у регенерантов большинства исследованных видов растений. Описаны сомаклональные вариации по морфологическим и биохимическим признакам, физиологическим параметрам. Изменения происходят как в ядерной, так и в хлоропластной и митохондриальной ДНК, встречаются растения-регенеранты с крупными перестройками генома и с точковыми мутациями.

Рис. 1.16. Первые сомаклоны табака, полученные в Институте физиологии растений РАН Н. А. Загорской и 3. Б. Шаминой.

Растения, полученные из культивируемых in vitro тканей, нередко внешне отличаются от исходных форм (рис. 1.17). Среди наиболее часто встречающихся изменений качественных морфологических признаков можно отметить вариации окраски и формы листьев, цветков, плодов, семян или клубней, наличие воскового слоя или опушенности листьев. С высокой частотой появляются растения-альбиносы, полностью или частично лишенные хлорофилла. Такой фенотип часто является следствием крупных делеций хлоропластной ДНК, хотя может быть вызван и ядерной мутацией. К варьирующим у регенерантов количественным признакам относятся высота растений, число и размеры листьев и стеблей, количество и масса семян или плодов и др. Как правило, размах изменчивости по количественным признакам у регенерантов больше, чем у исходных растений.

Рис. 1.17. Вариации формы листа у сомаклонов табака.

Наряду с вариациями морфологических признаков у растений, регенерированных из культивируемых тканей, описаны изменения и биохимических признаков. Например, отмечены отличия регенерантов от исходных растений по набору изоформ некоторых ферментов: эстеразы, пероксидазы, амилазы, алкогольдегидрогеназы, малатдегидрогеназы и некоторых других ферментов. Частота сомаклонов с мутациями ферментов варьировала у разных растений от 1 до 13%. У сомаклонов значительно изменялся состав и количество запасных белков, жирных кислот и других соединений.

Большой интерес для изучения регуляции физиологических процессов представляют сомаклоны с вариациями физиологических признаков, такими как изменения сроков цветения и созревания семян, появление мужской стерильности, устойчивость к болезням. Среди сомаклонов риса и пшеницы отмечены вариации содержания хлорофилла в листьях. У пшеницы обнаружены регенеранты, которые различались по функциональной активности фотосинтеза и его первичных реакций.

Изменения числа и структуры хромосом, характерные для культивируемых in vitro клеток, негативно влияют на способность к регенерации растений. Показано, что растения-регенеранты образуются преимущественно из диплоидных клеток, а регенерационный потенциал цитогенетически аномальных клеток понижен вплоть до полной неспособности к морфогенезу. Поэтому частота хромосомных аномалий у регенерантов значительно ниже, чем в культуре тканей. Растения-регенеранты с хромосомными аномалиями часто имеют пониженную фертильность и не оставляют потомства. В результате при половом размножении продолжается отсев цитогенетически ненормальных растений. Вместе с тем, клетки, несущие хромосомные аномалии, которые не снижают жизнеспособность, могут участвовать в процессе морфогенеза.

Более высокая частота кариологически аномальных форм среди регенерантов характерна для полиплоидных видов. Она может достигать 70%. По-видимому, благодаря дублированию генов на гомологичных хромосомах у аллополиплоидных видов, потеря отдельных хромосом меньше сказывается на жизнеспособности растений-регенерантов. У диплоидных видов элиминация хромосом, как правило, оказывается летальной. Вероятно, поэтому у диплоидных видов доля регенерантов с вариациями числа хромосом не превышает 10%. Однако значительная часть растений, полученных из культур тканей, может иметь различные хромосомные перестройки: транслокации, делеции, инсерции.

По мере увеличения продолжительности культивирования клеток in vitro возрастает доля растений-регенерантов с хромосомными нарушениями. Например, среди растений овса, полученных из каллуса после 4 и 20 месяцев культивирования in vitro, доля регенерантов с хромосомными аберрациями составляла, соответственно, 12% и 48%.

Регенеранты, не имеющие фенотипических отличий от исходных растений, тем не менее, часто также оказываются сомаклонами. В этом можно убедиться, если провести анализ ДНК, выделенной из растенийрегенерантов. Применение молекулярных методов позволило выявить в клеточных культурах многочисленные изменения повторяющихся и уникальных последовательностей (рис. 1.18). Величина генетического полиморфизма в зависимости от вида растений варьирует от 1 до 40%. Для выяснения причины полиморфизма ДНК-маркеров вариабельные фрагменты секвенируют, т. е. определяют их последовательность нуклеотидов. Например, на сомаклонах кукурузы показано, что в процессе культивирования клеток in vitro в исследуемых генах произошли крупные и мелкие делеции, инсерции и замены нуклеотидов.

Закономерности сомаклональной изменчивости. При анализе изменчивости растений, полученных из культивируемых тканей, трудно оценить истинную частоту мутаций. Значительная погрешность возникает из-за того, что не все клетки в культуре в равной степени способны к регенерации растений. Тем не менее, можно сказать, что вероятность появления различных сомаклональных вариаций неодинакова. Наиболее характерным типом сомаклональных изменений являются аномалии развития (рис. 1.19). Частота подобных изменений достигает у некоторых сомаклонов 100%. Большая вариабельность характерна для количественных признаков, а изменения качественных признаков происходят значительно реже. Более высокая встречаемость сомаклонов с вариациями количественных характеристик может быть связана с их полигенным контролем. Например, найдено уже более 20 генов, отвечающих за высоту растения. Мутация любого из генов, контролирующих количественный признак, может привести к его заметному изменению. Частота вариаций количественных признаков может достигать десятков процентов. В тех случаях, когда учитывалась не просто доля измененных растений, а мутации конкретных локусов, частота сомаклональной вариабельности была значительно ниже (менее 1%).

Рис. 1.18. Вариации ДНК-маркеров у сомаклонов кукурузы:

А — идентичность спектров амплифицированных фрагментов у индивидуальных растений инбредной линии А188; Б—Г — профили амплифицированных фрагментов индивидуальных сомаклонов (11—119) с разными праймерами;

М — маркер молекулярной массы Стрелками отмечены полиморфные фрагменты.

Рис. 1.19. Аномалии развития у сомаклонов кукурузы:

А — кустистая форма с укороченными междоузлиями; Б — нормальное (справа) и деформированное растения, полученные из одного каллуса;

В — развитие на метелке женских цветков Генетические изменения возникают в клетках in vitro уже в первые дни культивирования. Эти мутации проявляются и у регенерантов растений. Многочисленные примеры показывают, что растения, полученные из тканей после одного-двух месяцев культивирования, уже отличаются от исходных форм. По мере увеличения продолжительности культивирования тканей in vitro доля аномальных растений-регенерантов, как правило, возрастает. Увеличивается также число признаков, отличающих сомаклоны от исходных растений (табл. 1.3) Если среди растений, регенерированных после кратковременного культивирования, высока доля модификационных и эпигенетических изменений, то сомаклоны, полученные после более длительного культивирования клеток, чаще несут истинные мутации.

Таблица 1.3

Влияние продолжительности культивирования тканей кукурузы in vitro на уровень генетической изменчивости растений-регенерантов.

Характер наследования сомаклональных вариаций. Очень важным является вопрос о наследуемости сомаклональных вариаций. Показано, что природа сомаклональной изменчивости многообразна.

У растений-регенерантов выявлены:

• 1) модификации, нормализующиеся в процессе онтогенеза;
• 2) изменения экспрессии генов (как наследуемые, так и ненаследуемые);
• 3) истинные мутации, связанные с изменением первичной структуры ДНК.

Модификациями называются изменения, не затрагивающие геном. Модификационные отклонения от исходного фенотипа у регенерантов могут быть вызваны условиями культивирования клеток in vitro на средах с большим содержанием регуляторов роста. Побеги или зародыши, сформировавшиеся в таких условиях, нередко имеют аномалии развития, особенно на ранних этапах онтогенеза. Если такие регенеранты цветут и завязывают семена, то потомство их не отличается от исходных растений. Это объясняется тем, что причиной изменения были не мутации, а различные нарушения метаболизма, связанные с культивированием тканей in vitro.

Сомаклональные вариации, обусловленные изменением активности того или иного гена, называемые эпигенетическими, могут передаваться потомству. Такие сомаклональные вариации наследуются в первом поколении, но затем с каждым следующим поколением проявление измененного признака слабеет вплоть до полного исчезновения. Это явление, названное «затуханием признака», объясняют постепенным восстановлением уровня метилирования регуляторных элементов генов до состояния исходного растения.

В тех случаях, когда сомаклональные вариации обусловлены мутациями, они наследуются как менделевские признаки, чаще рецессивные, чем доминантные. Описаны случаи, когда сомаклоны отличались от исходных растений сразу по нескольким признакам. При этом каждый признак наследовался независимо. Количественные признаки также могут стабильно наследоваться в соответствии с генетическими правилами, разработанными для классического мутагенеза.

Как правило, изменения происходят в одном из аллелей, т. е. регенерированные растения гетерозиготны, и при их самоопылении наблюдается сегрегация. Однако описаны случаи, когда расщепление по измененному признаку в потомстве сомаклона отсутствовало, все потомки имели мутантный фенотип. Отсутствие расщепления в потомстве от самоопыления сомаклонов указывает на возможность возникновения у регенерантов мутаций в гомозиготной форме. Подобные гомозиготные сомаклональные варианты описаны у риса, кукурузы и пшеницы. Для риса стабильное наследование гомозиготных мутаций прослежено на протяжении шести поколений. Одним из возможных объяснений этого необычного явления может быть митотическая или мейотическая рекомбинация.

Причины и механизмы сомаклоналъной изменчивости. Основными причинами появления генетических вариаций являются реализация гетерогенности, существующей в соматических тканях исходных растений, и влияние условий культивирования.

В многоклеточном экспланте, взятом от исходного растения, клетки могут находиться на разном уровне дифференцировки, различаться по уровню плоидности, накапливать соматические мутации. Неоднородный эксплант при культивировании in vitro формирует гетерогенную популяцию, из которой, в свою очередь, могут быть получены растения, отличающиеся от исходных.

Вместе с тем, показано, что большая часть генетических вариаций возникает именно под влиянием условий in vitro. Гетерогенными становятся культуры, полученные из одиночных клеток или протопластов, доля измененных клеток возрастает с увеличением продолжительности культивирования. Значит, причины и механизмы изменчивости нужно искать в процессах, происходящих в клетках при введении в культуру и культивировании in vitro.

Клетка, существующая в организме или в культуре in vitro, подвергается действию регулирующих факторов: гормональных, трофических, физических, воспринимает сигналы от соседних клеток. Клетка, введенная в культуру in vitro, лишается регулирующих сигналов со стороны целого организма и подвергается действию компонентов питательной среды и условий культивирования (рис. 1.20). В этом состоянии, которое можно назвать стрессовым, в клетках меняется спектр работающих генов, что регистрируется экспериментально по уменьшению активности вторичного метаболизма, амплификации и деамплификации части ДНК, изменению характера метилирования. В условиях дисбаланса регулирующих сигналов эти, в норме обратимые, процессы могут стать причиной мутаций или эпигенетических изменений.

Рис. 1.20. Источники сомаклональной изменчивости.

В течение многих лет предметом активной дискуссии является вопрос об индукции генетической изменчивости компонентами питательной среды, главным образом, регуляторами роста. Есть данные, что.

2,4-Д, ИУК и НУК повышали частоту клеток с хромосомными аномалиями. Повышение уровня изменчивости под действием цитокининов не описано, наоборот, в ряде работ показано стабилизирующее влияние цитокининов при их применении вместе с 2,4-Д или НУК. Специальные тесты не подтверждают мутагенного действия компонентов питательной среды. Вместе с тем, не исключено влияние регуляторов роста на преимущественное размножение клеток определенного типа или на уровень метилирования отдельных последовательностей ДНК.

Вопрос о механизмах появления мутаций в культивируемых in vitro клетках обсуждается в литературе уже более двадцати лет. Довольно убедительной выглядит гипотеза, связывающая генерацию изменений с поздно реплицирующимися гетерохроматиновыми участками генома. Повышенная частота хромосомных аберраций в гетерохроматиновых районах описана для культур тканей многих видов растений. В качестве причины наблюдаемых изменений структуры хромосом в настоящее время рассматривают характерное свойство гетерохроматина, а именно его позднюю репликацию в митотическом цикле. Поздняя репликация гетерохроматина задерживает расхождение хромосом в анафазе, в результате образуются мосты и разрывы, которые, в свою очередь, в случае гомологичных хромосом могут привести к дупликациям и делециям, а в случае негомологичных хромосом — к реципрокным транслокациям.

Наличие гетерохроматина и связанные с ним особенности репликации хорошо объясняют возникновение хромосомных аберраций, но, скорее всего не могут рассматриваться в качестве основного механизма генных мутаций. В отношении этого вида изменчивости предпочтение отдается гипотезе о роли процессов метилирования и деметилирования генома в целом и его отдельных участков, а также дифференциальной репликации отдельных последовательностей.

Метилирование оснований ДНК в промоторной области может подавлять экспрессию генов, на фенотипическом уровне это будет выглядеть как потеря функционального белка, и может быть истолковано как мутация. Повышение степени метилирования может также вызвать усиление конденсации хроматина, увеличение доли поздно реплицирующегося гетерохроматина. При этом возрастает вероятность хромосомных аберраций, обусловленных расхождением в митозе хромосом до полного окончания репликации. Гипометилирование ДНК, напротив, способствует активации генов. Гипометилированные состояния, затрагивающие обе цепи ДНК, стабильно воспроизводятся при репликации, тем самым, обеспечивая свою наследуемость в ряду поколений.

Метилированный цитозин часто спонтанно дезаминируется и превращается в тимин, в результате возникает неправильное спаривание оснований двух цепей ДНК (Т-G), которое в 92% случаев репарируется путем обратной замены тимина на цитозин. В нерепарированных участках при последующей репликации в строящейся цепи ДНК напротив тимина встает уже не гуанин, а аденин, т. е. происходит мутация (рис. 1.21). Таким образом, метилирование и деметилирование могут не только влиять на экспрессию генов, но и приводить к изменениям последовательности оснований в ДНК, индуцируя истинные точковые мутации.

Рис. 1.21. Механизм генных мутаций, индуцированных изменением характера метилирования. ^тС — метилированный цитозин.

Некоторые авторы связывают происхождение сомаклональной изменчивости с активацией окислительных процессов в культуре in vitro. Известно, что свободные радикалы кислорода образуются в клетках растений in vivo и in vitro как продукты нормального окислительного метаболизма. Будучи высоко реакционноспособными, эти свободные радикалы могут прямо взаимодействовать с молекулами ДНК, вызывая их структурные нарушения. В сложных биологических системах радикалы кислорода могут вызывать повреждения ДНК и непрямым путем, инициируя процесс перекисного окисления липидов в мембранных структурах клетки. Показано, что один из промежуточных продуктов перекисного окисления липидов малоновый диальдегид является мощным мутагеном. Стрессовые состояния, к которым можно отнести и введение в культуру изолированных из растений эксплантов, как правило, сопровождаются увеличением количества свободных радикалов.

Таким образом, в настоящее время в качестве основных причин генетической изменчивости клеток при культивировании in vitro рассматриваются наличие поздно реплицирующегося гетерохроматина, изменения характера метилирования в процессе дифференцировки и дедифференцировки и активацию свободных радикалов.

Изменчивость агрономических признаков у растений, регенерированных из культивируемых тканей. Среди огромного разнообразия признаков, подвергающихся сомаклональной изменчивости, немало таких, которые могут найти практическое применение. Одни из первых обнаруженных сомаклонов — растения-регенеранты сахарного тростника характеризовались повышенным уровнем сахара, а также устойчивостью к вирусу Фиджи, желтой пятнистости и ложной мучнистой росе. В значительной степени интерес к сомаклональной изменчивости, существующий и по сей день, обусловлен именно желанием использовать это явление при создании новых сортов растений.

В дальнейшем у многих видов растений были найдены сомаклоны, характеризующиеся вариабельностью тех или иных агрономических признаков (табл. 1.4.).

Таблица 1.4

Сомаклоны с улучшенными агрономическими признаками.

Сомаклональная вариабельность не является направленной, поэтому наряду с полезными изменениями агрономических признаков возникают вариации, снижающие жизнеспособность и фертильность регенерантов (табл. 1.5). Лишь небольшая доля сомаклонов после проверки оказывается полезной для практического применения. Нередко позитивные варианты вообще не удается обнаружить.

Таблица 1.5

Преимущества и недостатки использования сомаклонов в селекции.

Иногда культивирование in vitro приводит к потере сортовых характеристик. Например, более высокий уровень белка в зернах пшеницы сопровождался снижением урожая. Низкая продуктивность регенерантов и их потомства и наличие нежелательных изменений наиболее характерны для растений, полученных после длительного культивирования тканей in vitro.

Таким образом, многими авторами на различных видах растений показано, что культивирование тканей in vitro повышает изменчивость по агрономическим признакам. Однако варианты с улучшенными показателями встречаются среди сомаклонов сравнительно редко. Поэтому целесообразно отбор желаемых вариантов проводить также в культуре in vitro.