Суспензионные культуры растений

Суспензионные культуры — это отдельные клетки или группы клеток, выращиваемые во взвешенном состоянии в жидкой среде (рис. 3.9, см. цв. вклейку). Они представляют собой относительно гомогенную популяцию клеток, которую легко подвергнуть воздействию химических веществ.

Суспензию клеток получают путем перенесения в жидкую среду каллусной ткани, предварительно выросшей на твердой агаризованной питательной среде. Поэтому первичная каллусная ткань, используемая в качестве посевного материала, должна быть рыхлой и легко распадаться на отдельные клетки. Для отделения крупных агрегатов клеточную массу перед пересевом фильтруют или отстаивают, а затем помещают в жидкую среду с автоматическим перемешиванием.

В лабораторных условиях клетки суспензии выращивают в колбах на качалке. Скорость вращения 100−120 об/мин. В таких условиях обеспечивается аэрация тканей и нарастающая масса клеточных агрегатов распадается на отдельные фрагменты.

Необходимо отметить, что растительные клетки растут и размножаются значительно медленнее, чем клетки животных или микроорганизмов: время их удвоения составляет от одних до трех суток. Поэтому даже при суспензионном культивировании стационарная фаза роста клеток, при которой культура достигает максимума сухой биомассы, наблюдается обычно через две-три недели. Истощение питательной среды и накопление продуктов жизнедеятельности клеток определяют необходимость обновления культуральной среды или пересева культуры на свежую питательную среду.

Суспензионную культуру можно получать и непосредственно из первичного экспланта (лист, стебель, корень и т. д.). Для этого применяют ферменты, например пектиназу. Вначале на поверхности экспланта образуется каллусная ткань, а затем уже от нее отделяются клетки и клеточные агрегаты, в результате чего получается клеточная суспензия.

Для получения 100 мл клеточной суспензии требуется 2−3 г свежей каллусной ткани.

Обязательным условием культивирования клеточных суспензий является постоянное перемешивание или встряхивание среды. Если клеточная суспензия находится в неподвижном состоянии, то деление суспензионных клеток приводит к образованию каллусной ткани.

Деление суспензионных клеток поддерживается наличием в среде ауксинов и цитокининов, т. е. тех гормонов, которые необходимы для индукции и роста каллусных клеток. Суспензионные культуры представлены типичными каллусными клетками, обладающими всеми свойствами, характерными для клеток такого рода.

Таким образом, как уже было отмечено выше, суспензии лучше образуются из рыхлого каллуса, получаемого на питательных средах с 2,4-Д. Исключение из питательной среды ионов кальция облегчает суспензирование. Еще более облегчает этот процесс добавление в питательную среду фермента пектиназы, которая разрушает пектат кальция, склеивающий отдельные клетки.

При промышленном культивировании суспензионных культур применяют закрытые или открытые системы с периодическим или проточным режимом выращивания клеток.

В закрытой системе клеточная суспензия лишена притока свежей питательной среды до конца выращивания (периодическая культура), а в случае непрерывного режима выращивания в открытой системе питательную среду частично меняют на свежую.

Как при периодическом, так и при проточном режиме выращивания в открытой системе клетки остаются в питательной среде и не удаляются даже при ее замене. Однако в открытых системах культивирования при замене питательной среды вместе со средой отбирается и часть суспензионных клеток.

Для работы с клеточными суспензиями необходимо знать их характеристики: жизнеспособность, плотность клеток в суспензионной культуре, степень агрегированности, скорость роста.

Жизнеспособность клеток определяют по их окрашиванию красителем (метиленовая синь, или синька Эванса). Живые клетки не окрашиваются красителем вследствие непроницаемости для него клеточных мембран. В мертвые клетки краска легко проникает, и они окрашиваются в синий цвет.

Одним из основных показателей, характеризующих состояние клеточной суспензии, является плотность клеточной популяции. Число клеток определяют в счетных камерах Фукса — Розенталя или Горяева под микроскопом после мацерации (разделения клеток) культуры. В качестве мацерирующего вещества применяют 10−20%-ю хромовую кислоту, которая гидролизует срединные пластинки, соединяющие клетки.

Хорошо растущая суспензия имеет, как и каллусная культура, S-образную кривую роста. Обычно длительность пассажа составляет 14−16 дней. При этом плотность возрастает от 5 х Ю⁴ до 5 X Ю⁶ кл/мл. Суспензия для субкультивирования берется в конце экспоненциальной фазы. Увеличение числа клеток, их сырой и сухой массы — основные критерии роста суспензионных культур.

Качество суспензии зависит от степени агрегированности ее клеток (рис. 3.9). По степени агрегированности выделяют:

• — мелкоагрегированную суспензионную культуру; состоит из одиночных клеток (40%) и мелких агрегатов (60%, агрегаты не должны содержать более 10−12 клеток);
• — среднеагрегированную суспензионную культуру; состоит из одиночных клеток (40%), мелких агрегатов (40%) и крупных агрегатов (20%, агрегаты содержат более 12 клеток);
• — крупноагрегированную суспензионную культуру; состоит из мелких (40%) и крупных (60%) агрегатов. Чтобы избавиться от крупных агрегатов, суспензии фильтруют (фракционируют) через марлевые, нейлоновые или металлические фильтры. Одновременно это позволяет освободиться от остатков экспланта или плотных кусочков каллусной ткани.

Основными признаками хорошей суспензионной культуры служат ее высокая степень дезагрегации (5−10 клеток в группе), морфологическая однородность клеток (небольшие размеры, сферическая или овальная форма, плотная цитоплазма) и отсутствие дифференциации (в частности, трахеидоподобных элементов).