Клеточные и молекулярные механизмы устойчивости к тяжелым металлам

Растения выработали целый ряд приспособительных механизмов, защищающих клеточный метаболизм от присутствующих в окружающей среде тяжелых металлов (рис. 9.16). Эти механизмы включают три группы основных участников детоксикации и гомеостатирования ионов тяжелых металлов. Это, прежде всего, мембранные транспортеры, осуществляющие перенос через плазматическую мембрану или мембраны органелл ионов тяжелых металлов или их комплексов с лигандами как внутрь клеток (или органелл), так и наружу. Обязательными участниками первичного этапа детоксикации тяжелых металлов являются хелаторы, к которым относятся как низкомолекулярные (органические кислоты, аминокислоты), так и высокомолекулярные соединения: пептиды — фитохелатины и небольшие белки металлотионеины. Наконец, в доставке ионов тяжелых металлов к местам назначения значительная роль принадлежит металлошаперонам. Важной стратегией выживания растений в условиях избыточного содержания тяжелых металлов в окружающей среде является создание фондов временного депонирования тяжелых металлов и длительной их детоксикации, которыми в клетке являются клеточная стенка и вакуоль.

Рис. 9.16. Механизмы устойчивости к тяжелым металлам¹

Клеточная стенка и корневые выделения (экссудаты). Связывание тяжелых металлов стенками клеток корня — первый рубеж обороны от присутствующих в почвенном растворе металлов. Цель этого механизма — снизить проникновение тяжелых металлов в протопласт. Подобный механизм функционирует, например, у толерантной к тяжелым металлам смолевки обыкновенной, которая аккумулирует их в клеточных стенках эпидермы за счет связывания с белками или силикатами. Клеточная стенка способна содержать до 40—60% от общего содержания тяжелых металлов в клетке.

Выделяемая клетками и покрывающая поверхность корня слизь ограничивает проникновение тяжелых металлов в клетки, т. е. выполняет барьерную функцию. Тяжелые металлы связываются с карбоксильными группами уроновых кислот слизи.^[1]

Иногда выделяемые в почву экссудаты корней могут содержать гистидин, цитрат и другие хелаторы тяжелых металлов. Подобный механизм используется при детоксикации такого легкого металла, как алюминий. Интересно, что в этом случае у растений, например гречихи, в корнях образуется щавелевая кислота, которая не выбрасывается наружу, а поступает в листья, где алюминий аккумулируется в виде нетоксичного оксалата алюминия.

Плазмалемма — первый живой компонент клетки, который является границей на пути поступления тяжелых металлов в протопласт. Она может играть важную роль в поддержании низкой концентрации тяжелых металлов не только за счет предотвращения или снижения интенсивности их поступления в клетку, но и за счет активного выброса их наружу. В бактериях наиболее эффективной защитой от избытка тяжелых металлов является их активный транспорт из цитоплазмы через плазмалемму. В растениях механизмы транспорта тяжелых металлов в клетку и наружу слабо изучены. Тем не менее недавно был описан находящийся в плазмалемме клеток табака переносчик никеля (NtCBP4), который представляет собой кальмодулиисвязывающий белок. Трансгенные растения, активно экспрессирующие этот ген, имели повышенную устойчивость к никелю.

Транспортеры ионов меди, локализованные на плазматической мембране, кодируются семейством генов COPTI—7. Экспрессия этих генов тканеспецифична. На гомеостаз Си сильное влияние оказывают ионы Zn, Mn, Fe через воздействие на экспрессию СОРТ-генов. Имеются убедительные свидетельства участия в переносе ионов меди в клетку транспортеров семейств ZIP (ZIP2 и ZIPA), Nramp и YSL. Другую важную группу транспортеров плазматической мембраны составляют транспортеры, осуществляющие вынос ионов меди из клетки. Такую функцию выполняют некоторые транспортеры обширного семейства мембранных АТФаз, а именно Р_хь-ATPase, иначе называемые НМЛ. Определенная информация имеется по //МА5-транспортеру. Предполагается его участие в загрузке ксилемы при транслокации ионов меди по растению. Значительно лучше изучены другие гены Р_хь-ATPase, или НМЛ-семейства, продукты которых поставляют ионы меди в отдельные фонды хлоропластов.

Хелатирование тяжелых металлов. Хелатирование металлов (образование хелатов) в цитозоле является важным механизмом детоксикации тяжелых металлов. Хелаты — вещества, образующие с металлом комплексную соль, в которой металл закреплен по всем валентностям и находится внутри молекулы, поэтому его возможности вступать в реакцию резко снижаются. Лигандами (от лат. ligare — связывать), т. е. веществами, образующими с металлом хелат, могут служить аминокислоты, органические кислоты и два класса пептидов: фитохелатины и металлотионеииы. Система внутриклеточного хелатирования ионов тяжелых металлов функционирует крайне эффективно. В клетке практически все ионы тяжелых металлов находятся в связанном состоянии. В свободном состоянии находится не более одного иона, например меди, на клетку. Наиболее обстоятельно исследованы в растениях фитохелатины (см. рис. 9.16).

Фитохелатины (ФХ) — это низкомолекулярные пептидные лиганды, синтезируются в ответ на обработку растения тяжелыми металлами, активно связывают металлы и имеют структуру: (у-Глу-Цис)_я-Гли, где п = = 2—11. Фитохелатины синтезируются не на матрице, а с помощью фермента фитохелатинсинтазы (ФХ-синтазы), использующей глутатион в качестве субстрата. Фитохелатины обнаружены во всех исследованных до сих пор растениях. Они быстро синтезируются в ответ на действие тяжелых металлов и вовлекаются в процесс их детоксикации.

В настоящее время имеются убедительные доказательства того, что фитохелатины защищают растения от кадмия. В частности, получено несколько мутантов арабидопсиса с разной чувствительностью к кадмию. Чувствительность арабидопсиса к этому металлу зависела от способности клеток аккумулировать фитохелатины. Так, растения сарептской горчицы быстро отвечали на аккумуляцию кадмия синтезом фитохелатинов. При этом количество синтезированных фитохелатинов было достаточным для связывания всего поступившего в клетки кадмия. Клетки бобов с повышенной чувствительностью к кадмию оказались неспособными к синтезу фитохелатинов. Связанный с фитохелатином кадмий транспортируется в вакуоль. В этом транспорте через тонопласт, очевидно, участвуют Сс1/Н⁺-антипортер и АТФ-зависимый АВС-транспортер, находящийся на тонопласте.

Фитохелатины являются древней и эволюционно консервативной защитной системой. Так, идентифицированные у арабидопсиса гены ФХ-синтазы обнаружены в клетках дрожжей. В опытах было показано, что эти гены арабидопсиса, включенные в клетки дрожжей, повышают устойчивость последних к действию тяжелых металлов.

Не все тяжелые металлы одинаково эффективно индуцируют синтез фитохелатинов, и не во всех случаях имеются доказательства их защитного действия.

Фитохелатины в комплексе с тяжелыми металлами транспортируются в вакуоль с затратой АТФ, так же как и конъюгаты глутатиона. Благодаря кислой среде в вакуоли тяжелые металлы высвобождаются из фитохелатинов и запасаются здесь в виде сульфидов.

Металлотионеины (МТ) — это низкомолекулярные полипептиды (молекулярная масса около 10 кДа), богатые цистеином, имеющие около четырех аминокислотных остатков, обогащенных БН-группами, и активно связывающие металлы. Название этих соединений указывает на присутствие серы в их молекулах (от греч. Жеюп — сера). Металлотионеины были исследованы у животных и грибов. Способность растительных металлотиоиеииов связывать тяжелые металлы и тем самым их обезвреживать еще предстоит доказать. Тионеины, находящиеся в клеточных стенках растений, токсичны для грибов и бактерий.

В отличие от фитохелатинов, металлотионеины кодируются генами и синтезируются на рибосомах обычным матричным способом. Обнаружено два класса генов, которые кодируют у арабидопсиса четыре типа металлотионеинов. Проростки арабидопсиса отвечали на присутствие меди интенсивной аккумуляцией мРНК одного из типов металлотионеинов, но слабо реагировали на кадмий и цинк. Кроме того, установлена способность генов металлотионеинов арабидопсиса повышать устойчивость дрожжевых клеток к меди. У десяти экотипов арабидопсиса обнаружена корреляция между интенсивностью синтеза МТ2 и чувствительностью к меди.

Потенциально органические кислоты и аминокислоты (лимонная, яблочная, гистидин) тоже являются лигандами для связывания тяжелых металлов и могут участвовать в повышении устойчивости растений.

Металлошаиероны — небольшие белковые молекулы, структурно соответствующие ионам металлов и осуществляющие доставку ионов тяжелых металлов к местам назначения, где они включаются в состав ферментных или структурных белков. Так, например, известны различные молекулы медных шаперонов, доставляющие ионы меди к медьсодержащим белкам (пластоцианин, Си/7п-супероксиддисмутаза, некоторые лакказы и др.).

Компартментация тяжелых металлов в вакуолях. Выброс ионов через плазмалемму наружу или их транспорт в вакуоль — это два пути уменьшения избыточных токсичных концентраций металлов в цитозоле. Выше мы уже упоминали, что аккумуляция комплекса «кадмий — фитохелатин» в вакуоли происходит с помощью /ШС-переносчика. Появляются данные, что в вакуоли могут аккумулироваться и другие тяжелые металлы, приносимые в нее с помощью других транспортных систем тонопласта. Было показано, что вакуоль является местом аккумуляции также Мо и 7п. Подобная компартментация Хп важна для выживания, например, растений ячменя. Более того, из растений арабидопсиса был изолирован ген (7/17″), гомологичный гену переносчика цинка в клетках животных (7пГ). Перенос этого гена в растение и его активная экспрессия приводили к значительному увеличению устойчивости к цинку и аккумуляции этого металла в корнях при высокой концентрации его в среде. Таким образом, переносчик цинка мог участвовать в аккумуляции этого металла в вакуоли и тем самым в устойчивости растений.

Недавно был охарактеризован транспортер тонопласта СОР1Ъ, работающий на вынос ионов меди из вакуоли. Полагают, что СОРТ5 может детерминировать эффективность переноса ионов меди, временно депонированных в вакуолях клеток коры корня, и их межорганного транспорта по растению на стадии загрузки ксилемы корня.

Белки теплового шока (БТШ) были подробно рассмотрены ранее (см. подпараграф 9.2.2). Они не только выполняют функцию молекулярных шаперонов, но могут участвовать и в защите макромолекул и репарации поврежденных при стрессе белков. Как вы знаете, синтез белков теплового шока вызывается, прежде всего, высокой температурой, но отдельные их компоненты могут синтезироваться и в ответ на действие других стрессоров, в частности тяжелых металлов. Речь идет о группе низкомолекулярных белков (молекулярная масса 16—20 кДа) и высокомолекулярного белка БТШ-70. Так, в культуре клеток томата БТШ-70 синтезируется не только при тепловом шоке, но и под действием кадмия. Этот белок локализован в ядре, цитоплазме и плазмалемме. Было высказано предположение, что БТШ-70 участвует в защите плазмалеммы от повреждения кадмием, так как кратковременная тепловая обработка клеток перед действием кадмия повышала устойчивость мембран к этому металлу.

Транскрипционный фактор SPL7 как центральный регулятор гомеостаза меди. В условиях дефицита меди в среде центральным регулятором гомеостаза меди выступает транскрипционный фактор SPL1 (от англ. squamosa promoter bindingprotein-likel), участвующий в регуляции экспрессии генов группы транспортеров Си, Zn, Fe и Cu-шаперона CCS. Помимо прямой регуляции экспрессии ряда генов, SPL1 также активирует транскрипцию консервативных микроРНК-тш7?397, -miR398, -miRA08 итш7?857, участвующих в регуляции гомеостаза меди. Эти микроРНК способны регулировать экспрессию генов медьсодержащих супероксиддисмутаз Cu/Zn-СОД, пластоцианина и некоторых лакказ^[2]. Лучше всего изучены функции miR398. В условиях дефицита меди miR398 активируется и подавляет экспрессию как генов медьсодержащих Cu/Zn-СОД разной клеточной локализации, так и гена CCS 1, кодирующего шаперон CSD1 и CSD2, что необходимо в целях сохранения меди для более существенных белков фотосинтеза и дыхания — пластоцианина и цитохромоксидазы С. Установлено, что во время окислительного стресса экспрессия т/7?398, наоборот, снижается. Это связано с тем, что в этих условиях происходит опасное увеличение концентрации активных форм кислорода и для их срочной детоксикации требуется повышенная активность супероксиддисмутаз CSD1 и CSD2.

Таким образом, целый ряд механизмов повышения толерантности растений к тяжелым металлам направлен на удаление избыточного содержания металла из цитоплазмы и тем самым на предотвращение его возможных токсических эффектов. Для развития устойчивости к данному конкретному металлу используется не один, а несколько различных механизмов. Какого-либо одного механизма, обеспечивающего толерантность растения к нескольким разным тяжелым металлам, не существует. Механизмы восприятия растением сигнала от действия тяжелого металла и трансдукции (передачи) этого сигнала к генам в настоящее время практически не исследованы.

Контрольные вопросы

• 1. Чем отличаются растения — аккумуляторы ионов от растений-индикаторов?
• 2. Как влияют тяжелые металлы на макромолекулы?
• 3. Какое влияние оказывают тяжелые металлы па фотосинтез?
• 4. Как изменяется водный статус растения иод действием тяжелых металлов?
• 5. Как они влияют на рост?
• 6. Как изменяется поглощение веществ под действием тяжелых металлов?
• 7. Какие механизмы помогают клеткам уменьшать концентрацию тяжелых металлов?
• 8. Какую роль играет клеточная стенка в защите от тяжелых металлов?
• 9. Как нлазмалемма защищает клетку от этих металлов?
• 10. Что такое фитохелатины? Какова их роль?

• [1] См.: Серегин И. В., Кожевникова А. Д. Физиологическая роль никеля и его токсическоедействие на высшие растения // Физиология растений. 2006. Т. 53. С. 285—308.
• [2] Cm.: Sunkar R., Chinnusamy V., ZhuJ., ZhuJ. K. Small RNAs as big players in plant abioticstress responses and nutrient deprivation // Trends Plant. Sci. 2007. V. 12. P. 301—309.