Восстановление дефектного гена delF508 муковисцидоза при стимуляции генного биосинтеза нанокристаллами галлуазита и ДНК

Восстановление дефектного гена delF508 муковисцидоза при стимуляции генного биосинтеза нанокристаллами галлуазита и ДНК

Представлены экспериментальные данные по восстановлению дефектного гена delF508 муковисцидоза (MB) (кистозный фиброз поджелудочной железы) — наиболее распространенного, тяжелого моногенного заболевания, наследуемое по аутосомно-рецессивному типу. Частота заболевания в разных популяциях, нациях и этнических группах существенно варьирует, составляя в среднем 1: 2−2,5 тыс. новорожденных у представителей белой расы. Наше внимание привлекает возможность генотерапии этого заболевания, в частности, методы генноинженерного лечения MB с помощью возобновления функции дефектного гена F508del путем химического его исправления, разблокирования, дополнение его недостоющей частью, с поэтапным восстановлением и активацией наноконструкцией галлуазита и ДНК. В качестве экспериментальной модели для воспроизведения муковисцидоза были взяты лабораторные мыши линии nu/nu. Экспериментально мы пересадили ткани от больного человека муковисцидозом атимусным иммунодефицитным мышам nu/nu. Восстановление дефектного гена проводили введением внутривенно в хвостовую вену модельным мышам гибриды кристаллов галлуазита и нативной ДНК животного донора в течении 3 недель с интервалом 2 дня. Основными компонентами в нашем исследование были донорская ДНК и нанокристаллы галлуазита — выступающие как матрица для введения внутрь клетки ДНК. Выделение ДНК проводили в несколько стадий: лизис клеток (лизирующий раствор содержит ЭДТА и протеиназу К), солюбилизацию ДНК на специальной мембране, отмывание пробы от остатков клеточных структур, элюирование ДНК из мембраны. Для введения в вектор гена F508del ДНК, полученного в результате рестрикционного фрагментирования генома, вектор обрабатывали той же эндонуклеазой, что и донорную ДНК, затем продукты смешивают друг с другом, обрабатываем полинуклеотидлигазой и трансформируем реципиентные клетки. Далее мы насыщали поверхность кристаллов галлуазита выделенными генами (нативная ДНК). Для этого мы к раствору кристаллов (1 мкг, 500 мкл, 200 мг/л) добавляли раствор ДНК до концентрации 5 мкМ и обрабатывали ультразвуком в течении 30 мин, инкубируем при 370 С в термостате 40 мин, затем раствор центрифугировали при 14 000 g. при комнатной температуре до обесцвечивания супернатанта, отбирали супернатант. Остужали до комнатной температуры и приготовив разведение с раствором натрия хлорида 1: 10 вводили внутривенно в хвостовую вену животного. ДНК в кристаллах метили флюорисцентным белком TurboGFP. При введении и наблюдении за кристаллами галлуазита нами было показано, что ДНК или достаточно протяженные олигонуклеотиды образуют в присутствии ионов магния находящиеся в большом количестве в кристаллах галлуазита образуют вольно прочные комплексы с лецитиновыми липосомами, которые путем инкапсуляции перемещают внутри генома находящиеся рядом нуклеотиды до восстановления структуры.

Введение

мышам линии nu/nu кристаллов производилось втечении 3 недель беременным самкам модельных животных и 4 недели вводились взрослым животным. В ходе лабораторного эксперимента нам удалось заменить дефектный ген и предотвратить развитие муковисцидоза у эмбрионов мышей. Восстановление дефектного гена delF508 происходило в течении 3 недель после начала введения кристаллов нанокристаллов галлуазита. Поры имеющиеся на поверхности кристаллов удерживают субстраты необходимые для формирования цитоскелета клеток, синтеза аминокислот, ферментов, восстановления первичной структуры белков, пептидной связи, нуклеотидной последовательности, транспорта белков, стабилизация пространственной структуры белков. При взаимодествии кристаллов галлуазита на недостроенные гены или нуклеотиды с дефектной структурой происходит так называемая перестройка геновВ процессе элонгации при переносе гидролизе сложноэфирных связей, перенос из Р — центра в, А — центр и образование пептидной связи осуществляется при помощи фермента транспептидазы, а в дефектных генах эту роль выполняют двумерные гены галлуазита, которые проникают в 50S рибосомальную субъединицу. Таким образм, в клетке с дефектными генами завершается цикл элонгации, и белок — синтезирующаяся система готова к образованию следующей пептидной связи. Наше внимание привлекает возможность генотерапии этого заболевания, в частности, методы генноинженерного лечения MB не требующее применения донорских стволовых клеток, вируса ВИЧ человека, ретровирусов, применения химиотерапии для ослабления иммунной системы, хирургического вмешательства и др. Успешное создание модели MB на лабораторных мышах позволило получить положительные результаты о полном восстановлении мутированного дефектного гена delF508 с использованием кристаллов галлуазита. Создание препарата с наночастицами кристаллов галлуазита позволит в будущем широко использовать его как класс лекарств, нормализующих работу генов, как средство для целевого воздействия на геном, как генный регулятор человеческого организма, как универсальная антимутагенная прививка и корректирующая ДНК вакцина.