Результаты и обсуждение

Исследование антиоксидантных свойств новых гетероциклических соединений

Как видно из данных, представленных в таблице 1, все исследуемые вещества в модельном эксперименте проявили антиоксидантную активность в той или иной мере. Вместе с тем, 50%-ое ингибирование образования малонового диальдегида в системе с лецитином яичного желтка наблюдалось при разных концентрациях препаратов, которые размещены в таблице в порядке убывания их активности. Максимальную активность, соответствующую величине IC₅₀? 2 мкМ проявили 8 веществ, расположенные в начале таблицы — KDA-150, DVD-2521, KDA-132, BO-20, NAA-85, DVD-8843, DVD-2808, DVD-26. Препарат сравнения — традиционно использующийся в качестве искусственного антиоксиданта ионол (2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол), показал несколько бoльшую антиоксидантную активность, чем испытуемые вещества. После определения наиболее перспективных с точки зрения антиоксидантной активности соединений и установления величины их оптимальной концентрации для простой модельной системы, представлялось целесообразным изучить поведение этих веществ в опытах in vitro, включающих более сложный объект _ природные биологические мембраны.

В качестве подобного объекта мы использовали микросомы печени крыс _ выделенные с помощью дифференциального центрифугирования мембраны эндоплазматического ретикулума, поскольку эта структура богата субстратами ПОЛ — монои полиненасыщенными жирными кислотами; в ее составе функционируют цепи переноса электронов, что создает условия для образования радикальных форм кислорода; многие ферменты микросом относятся к металлопротеинам, т. е. связаны с металлами переменной валентности, что также играет роль в активации ПОЛ. Использование микросом позволяет в определенной мере стандартизовать условия проведения опыта. Полученные результаты приведены в таблице 2. Постановка эксперимента была общепринятой [25] и заключалась в искусственном индуцировании перекисного окисления липидов мембран микросом с помощью аскорбиновой кислоты и ионов железа (соль Мора). Добавление этих компонентов в реакционную среду способствовало образованию активированных кислородных метаболитов (гидроксильных радикалов, пероксидных радикалов жирных кислот и т. д.). После инкубации в течение 20 минут в пробах спектрофотометрически определялось количество вторичного продукта ПОЛ — малонового диальдегида. По уровню его накопления судили об антиоксидантной активности добавляемых в реакционную среду исследуемых веществ. Для сравнения использовали ионол. Контролем служили образцы без активных веществ, но с добавлением растворителя (ДМСО), который сам обладает некоторым антиоксидантным эффектом.

Таблица 1 Зависимость антиоксидантной активности (АОА) синтетических гетероциклических соединений от концентрации (по показателям ингибирования образования МДА в модельной системе с лецитином) n=6

Как видно из приведенных данных, преимущественное большинство соединений, показавших в предыдущем опыте антиоксидантный эффект обнаруживало подобную активность и в более сложной системе. Однако были и исключения. В общем, подобное поведение антиоксидантов не является неожиданным. Известно, что усложнение системы, в которой проводятся испытания антиоксидантных свойств приводит иногда к снижению эффективности препарата [24]. (Именно этим фактом мы руководствовались, применяя в опыте концентрации веществ несколько более высокие, чем полученные для них величины IC₅₀.) Более того, в исключительных случаях может изменяться сама направленность эффекта — с антиоксидантной до прооксидантной. Это связано с синергическим эффектом при взаимодействии нескольких слабых факторов в живом объекте, приводящим к их резкому усилению. Например, в клетке в определенных условиях может значительно возрастать энергия слабых радикальных соединений, их превращение в активаторов ПОЛ, тогда как в норме сами по себе они являются ингибиторами ПОЛ именно из-за своих радикальных свойств и не представляют опасности из-за низкой энергетичности. Это показано, в частности, в опытах с применением витамина Е [1]. Разумеется, в каждом подобном случае причины изменения эффектов одного и того же соединения в разных условиях опыта могут быть совершенно различны, но все они, безусловно, связаны с взаимодействием того или иного соединения с какими-то структурами в изучаемой системе.

Как и в первой серии опытов, соединения KDA-150, DVD-2521, KDA-132, BO-20, NAA-85, DVD-8843, DVD-2808, DVD-26 проявили антиоксидантную активность, причем, в данном случае _ в присутствии микросом. Это говорит о том, что, как минимум, эти вещества могут быть ловушками свободнорадикальных форм кислорода. Следовательно, их можно отнести к истинным антиоксидантам. Остальные вещества не обнаружили антиоксидантного эффекта на микросомах, что, вероятно, можно объяснить следующим образом.

В нашем случае вещество Л-8 (№ 12) проявило при инкубировании с микросомами отчетливый прооксидантный эффект, т. е. активировало ПОЛ (более чем на 40%), тогда как в опытах с лецитином это вещество ингибировало липопереокисление, по-видимому, за счет улавливания и инактивации свободнорадикальных форм кислорода. Принимая во внимание структуру данного соединения, можно сделать вывод, что Л-8 действительно может связывать свободнорадикальные формы кислорода. В растворе лецитина это вызывает их инактивацию, поэтому процесс ПОЛ ингибируется, причем с примерно одинаковой эффективностью при разных концентрациях вещества, т. е. лимитирующим фактором, вероятно, является концентрация радикалов в среде. Однако при наличии мембранного липидного бислоя гидрофобная и довольно громоздкая молекула Л-8 проникает вглубь мембраны, задерживаясь там вместе со связанными кислородными радикалами. При встраивании молекулы Л-8 структура мембраны становится более рыхлая, радикалы кислорода получают свободный доступ к ненасыщенным жирным кислотам мембранных фосфолипидов, т. е. к субстратам ПОЛ. Проще говоря, мы считаем, что Л-8 может не только связывать, но и транспортировать радикальные формы кислорода в липидный бислой, встраиваясь в него и механически дестабилизируя его. Однако, для доказательства этого предположения целесообразно было бы сравнить влияние Л-8 на ПОЛ в лецитиновых липосомах. В подобной постановке лецитин находился бы не просто в растворе, а в составе липидного бислоя, состоящего исключительно из молекул лецитина.

Аналогичные выводы можно сделать, анализируя поведения соединения DVD-0749. Следует отметить лишь, что его молекула по величине почти в 2 раза меньше Л-8, но также не является компактной молекулой. Вместе с тем, очень похожее визуально на DVD-0749 соединение DVD-4702 проявляет умеренно антиоксидантные свойства в обоих случаях — и в простой безмембранной системе с субстратом ПОЛ лецитином, и при наличии этого же компонента (наряду с другими) в составе мембран микросом. Очевидно, что структурные отличия являются причиной разного поведения этих соединений, однако на данном этапе исследований не представляется возможным объяснить, каким образом.

Таблица 2 Влияние новых синтетических гетероциклических соединений на индукцию аскорбат-зависимого ПОЛ в микросомах печени крыс X±Sx; n=6

Соединения DVD-3779 и ВО-35 также, как и три вышеописанных, вероятно, являясь ловушками свободнорадикальных форм кислорода, вероятно, могут переносить их в липидный мембранный бислой с разной степенью эффективности и в зависимости от типа этого бислоя.

Отдельно следует сказать о соединениях, которые были растворимы в воде — NAA-23 и NAA-177. Они показали слабую антиоксидантную активность. Причем в случае с NAA-177 она не зависела от концентрации вещества в растворе с лецитином. В системе с микросомами препараты не функционировали как антиоксиданты. Вероятно, это связано с непроницаемостью для них липидного мембранного бислоя за счет их заряженности. Возможно, эти соединения могут проявить себя в другом биологическом качестве, например, они вполне могут действовать как нуклеофилы, участвуя в разобщении процессов дыхания и окислительного фосфорилирования в митохондриях. Мы планируем проверить это предположение в следующих опытах.

Таким образом, из 18 исследуемых соединений 8 продемонстрировали выраженные антиоксидантные свойства, их IC₅₀ оказался в области 2 мкМ. При концентрации 10 мкМ эти соединения показывали антиоксидантный эффект не только в модельной системе с субстратом ПОЛ лецитином, но и в среде с микросомами — биологическими липидными бислойными мембранами. Кроме того, возможно проявление и иных биологически свойств этих соединений — способности связываться с липидами мембранного бислоя, выступая в качестве мембранных зондов; влиять на процессы переноса электронов в дыхательных цепях микросом и митохондрий; влиять на активность антиоксидантных ферментов. Однако, все эти предположения требуют отдельных исследований.