Повышение эффективности получения биопрепарата на основе оптимизации некоторых условий культивирования Pseudomonas SP114

Получение высококачественных биопрепаратов напрямую зависит от организации процесса культивирования микроорганизмов, а при его оптимизации, в первую очередь от состава культуральной среды. Процесс ферментации, в свою очередь, является основным по биотехнологическим параметрам фактором оказывающим влияние на качество и эффективность биопрепарата.

Задачами настоящего исследования является:

• — Подбор условий ферментации, обеспечивающих оптимизацию получения культуральной жидкости обладающей протеолитической активностью (высоким содержанием комплекса кислых протеаз);
• — Удешевление питательной среды для культивирования бактерий рода Pseudomonas; биопрепарат микроорганизм ферментация
• — Изучение динамики потребления основных источников углерода, азота, протеолитических ферментов при выращивании Pseudomonas sp114.

Объектом исследования является культура Pseudomonassp 114, депонированная во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под № В-5060. Культура представляет собой подвижные мелкие палочки 0,5−1,0Ч1,5−5,0 мкм расположенные по одиночке, парами, очень редко в виде цепочки по 3−4 клетки, Грамм-положительные, спор и капсул не образует, приделы роста +10°С? +35°С. Гидролизует желатин, не гидролизует крахмал. В качестве источника углерода использует глюкозу, трегалозу, кетоглюконат, мезоинозит, L-валин, L-аргинин, L-арабинозу, сахарозу, сорбит, пропионат, не использует бутират. Обладает аргининдегидролазной и лецитиназной активностью, способна к денитрификации нитрата и выступает в качестве антагониста широкого спектра фитопатогенных грибов. Исследуемая культура изображена на рисунке 1.

Рисунок 1 — Культура Pseudomonassp 114.

Культура Pseudomonassp 114 выступает как активный продуцент высокоактивного протеолитического комплекса, не является патогенной, вирулентной, относится к сапрофитам (микроорганизмам живущих в естественных, природных условиях и принимающим участие в разложении органических остатков).

На первом этапе наших исследований произведен подбор и анализ состава питательных сред для культивирования Pseudomonassp 114. в колбах объемом 250 мл на орбитальном термостатируемом шейкере таких как: LB, Кинг В, глюкозо-пептонная среда (среда Голубева), мелассно-автолизатная (МАС) питательная среда.

Отмечено, что незначительные изменения состава среды меняют не только уровни накопления гидролитических ферментов, но и соотношение протеаз и амилаз на разных стадиях развития культуры [5].

Поскольку синтез некоторых ферментов, в частности протеазы, а также многих вторичных метаболитов подвержен азотной репрессии, продукция этих соединений может быть увеличена в результате замены аммония в питательной среде на менее эффективные источники азота.

Часто в биопрепаративных формах протеаз присутствует целый комплекс ферментов с различными свойствами и одновременно комплексы ферментов с близкими физико-химическими и каталитическими свойствами (изоферменты). Изоферменты идентичны по своему каталитическому действию, но различаются биофизическими константам. Биосинтез ферментов микроорганизмами тесным образом связан с основными условиями, влияющими на рост и развитие культур, и в первую очередь с составом питательной среды. Источники азота и углерода в питательной среде оказывают влияние, как на конструктивный обмен культур, так и на синтез ферментов. Относительно влияния различных источников азотистого питания в среде на рост микроорганизмов и образование протеолитических ферментов имеются различные мнения. Одни авторы считают, что белки являются единственным благоприятным источником азота для лучшего роста микроорганизмов и синтеза ферментов, другие же утверждают, что в качестве лучшего источника азота необходимо использовать сочетание минерального и белкового субстратов и, наконец, ряд авторов полагают, что только минеральные соединения могут быть единственным источником азота [4].

Следующим этапом наших исследований являлся подбор питательной среды для культивирования Pseudomonassp 114 с целью её удешевления и как следствие снижение себестоимости конечного продукта.

Известные питательные среды LB и Кинг В, являющиеся основными для культивирования бактерий рода Pseudomonas., имеют такой недостаток как высокая стоимость, из-за дорогостоящего пептона входящего в состав основных сред. Использование на первом этапе глюкозопептонной среды (ГПС) было обусловлено универсальностью этой среды и хорошим ростом бактерий Pseudomonassp. 114. Достигнутый титр клеток Pseudomonassp. при выращивании на этой среде на качалочных колбах составлял 107 -108 КОЕ.

При промышленном производстве биопрепаратов на основе бактерий рода Pseudomonas, предназначенных для использования в микробиологическом производстве, высокая стоимость питательной среды неизбежно приведет к удорожанию целевого продукта.

Поставленная техническая задача удешевления стоимости питательной среды и увеличения выхода биомассы решается использованием мелассно-автолизатной (МАС) питательной средыв который в качестве углеродного субстрата входит кормовая меласса, являющаяся отходом свеклосахарного производства и содержащая до 45% сахарозы при низкой стоимости, что наглядно продемонстрировано в таблице 1. В дальнейшем, эта среда использовалась как основа производственной среды для получения культуры Pseudomonassp.

Таблице 1 — Сравнительная оценка стоимости компонентов исследуемых сред.

Культивирование маточной культуры на орбитальной качалке проводилось в следующем режиме:

Аэрация? 200 об/мин, температура культивирования? 30 °C, время культивирования? 24 часа до достижения титра клеток? 106 КОЕ.

Затем в питательную среду (МАС) засевали 40 мл маточной культуры бактерий Pseudomonassp 114. Ферментацию осуществляли в течение 48 часов при 30 °C при постоянной аэрации. Титр клеток в культуральной жидкости в конце ферментации составлял 108КОЕ.

Подготовленная таким образом культура Pseudomonassp. являлась маточной для засева ферментер Ока-01−05К «Каскад» предназначенного для реализации способа культивирования микроорганизмов, основанного на циклическом перемещении фиксированного объема культивационной среды через каскад ферментеров, в каждом из которых находятся микроорганизмы или клетки, имеющие заданную и периодически восстанавливаемую стадию роста.

Ферментер обеспечивает ускоренное проведение поисковых научно-исследовательских и технологических работ, направленных на интенсификацию, в первую очередь непрерывных методов культивирования микроорганизмов, использование которых позволит значительно снизить стоимость получаемых продуктов.

Установка Ока-01−05К «Каскад» представленная на рисунке 2, является устройством лабораторного типа, обеспечивающим проведение исследовательских работ в области биотехнологии, культивационной гидродинамики, стерилизации ферментационного оборудования, жидких и газовых сред и интерактивного управления многостадийными процессами.

Комплекс представляет собой модульное биотехнологическое оборудование, позволяющее производить в периодическом и непрерывном режиме широкий спектр биотехнологических продуктов, причем переход с выпуска одного продукта к другому осуществляется по программе под управлением компьютера.

Модульное построение биотехнологических агрегатов и систем управления, а также их принцип действия, обеспечивают полную автоматизацию и интерактивный контроль многостадийных процессов.

Установка имеет набор методик и компьютерных программ, обеспечивающих режимы периодического и «каскадного» (отъемно-доливного, непрерывного) культивирования микроорганизмов.

Рисунок 2 — Ферментер Ока-01−05К «Каскад» .

Для культуры Pseudomonas sp.114 на мелассно-автолизатной среде как оптимальными были подобраны следующие условия выращивания: температура культивирования 30−32°С; аэрация 1,0−1,5 л/л/мин, скорость вращения мешалки 150−200 об/мин; рН среды 6,8−7,2; подтитровка- 5% КОН, пеногаситель — адеканоль; время культивирования — 48−72 часа. Достигнутый титр клеток составлял 108кл/мл.

Дальнейшие работы по подбору режима культивирования микроорганизмов Pseudomonassp. 114 проводили на ферментационном оборудовании ОКА-100 с объемом 100 л представленной на рисунке 3, предназначенном для реализации процессов культивирования микроорганизмов, биосинтеза, биокатализа и биотрансформации биологически активных веществ по энергосберегающей технологии с использовании в качестве продуцентов бактерий, дрожжей, мицелиальных грибов, микроводорослей и тканей.

Рисунок 3 — Ферментер ОКА-100.

После отработки режимов культивирования на установке ОКА-100 по показателям аэрации, температурного режима, объема протока культуральной жидкости были установлены оптимальные величины этих показателей.

Для культуры Pseudomonassp. 114 на мелассно-автолизатной среде в ферментере ОКА-100 оптимальными условиями выращивания являлись: температура культивирования 30−32°С, аэрация 1,0−1,5 л/л/мин, скорость мешалки 150−200 об/мин, рН 6,8−7,2, подтитровка 5% КОН, пеногашение с помощью адеканоля, время культивирования — 8−72 часа. Достигнутый титр клеток составлял 108 КОЕ. Динамика роста культурыPseudomonassp. 114 при выращивании на в ферментёре ОКА МФ-100 на МАС представлена на рисунке 4.

Рисунок 4 — Динамика роста культурыPseudomonassp. 114 при выращивании на ферментёре ОКА МФ-100 на МАС.

При выращивании культуры Pseudomonassp. 114 в ферментерах двух типов ОКА МФ-05 и ОКА МФ-100, отмечено, что результаты подбора режимов культивирования показали хорошую повторяемость, независимо от объема применяемого ферментера, что позволяет говорить о возможности дальнейшего масштабирования ферментационных процессов на установках большего объема (от 1000 л и более), что важно при получении этого компонента биопрепарата в промышленных условиях.

При культивировании Pseudomonassp. 114 на среде с мелассой в качестве источника углерода отмечено, что 4% по редуцирующим веществам (Рв) давало эффект прироста биомассы в течение 72 часов и не приводило к переходу культуры в стационарную фазу роста.

Установлены их оптимальные значения, посевная доза — 106кл/мл и насыщение среды кислородом — 70−90%.

Таким образом, выращивание маточных культур для дальнейшей разработки биопрепарата производили в колбах объемом 250 мл на глюкозопептонной среде на ротационном шейкере при оптимальных температурах и аэрации для каждого вида.

Режим культивирования маточной культуры Pseudomonassp. 114 на орбитальной качалке:

• — обороты качалки — 200 об/мин
• — температура культивирования — 30С
• — время культивирования — 24 часа
• — до достижения титра клеток — 106кл/мл.

Засевная биомасса культуры составляет 1% от рабочего объема ферментера.

Режим выращивания культуры Pseudomonassp. 114 в ферментере:

• — температура культивирования — 30−32С;
• — аэрация 1,0−1,5 л/л/мин;
• — обороты мешалки 150−200 об/мин;
• — рН 6,8−7,2;
• — подтитровка 5% КОН;
• — пеногашение-адеканоль;
• — время культивирования — 48−72 часа;

Достигнутый титр клеток составляет 109кл/мл.

Действие препарата основано как на дальнейшем развитии культуры на объекте применения, так и на непосредственном действии КЖ с ферментами на побочные продукты перерабатывающих предприятий основными из которых являются отходы животноводства.

После получения в ферментере биомассы клеток с заданным титром производится асептическая расфасовка культуральной жидкости с клетками в подготовленные асептические емкости. До применения биопрепарата хранение производят при температуре? + 5.

• 1. Роуз. Э. Химическая микробиология.? Изд. «Мир», М.1971, С.259−265. УДК 576.8
• 2. Перт. С. Дж Основы культивирования микроорганизмов и клеток.? Изд. «Мир», М. 1978, С.144−165, 249−258. УДК 576.8.093.3+578.085.23.
• 3. Методы практической биохимии. Под ред. Б. Уильямса и К. Уилсона. -Изд. «Мир», М. 1978, С. 18−30. УДК 541.1+577.1
• 4. Хусид С. Б. Биохимические аспекты консервирования витаминного растительного сырья минеральными и биологическими консервантами/С.Б. Хусид, А. И. Петенко. И.С. Жолобова// Научный журнал КубГАУ, № 96(02), 2014 г.
• 5. Кощаев А. Г. Кормовая добавка на основе ассоциативной микрофлоры: технология получения и использование / А. Г. Кощаев, А. И. Петенко // Биотехнология. — 2007. — № 2. — С. 57−62.
• 6. Кощаев А. Г. Кормовые добавки на основе живых культур микроорганизмов / Кощаев, А. Г., Петенко, А.И. // Птицеводство. — 2006. — № 11. — С. 43−45.
• 8. Матреничева В. В. Химико-ферментативная обработка пищевых волокон растительного сырья/Матреничева В.В., Иванова А. А., Волкова О. Б // Пищевая промышленность, 2004. № 8. С 7−12.
• 9. Пат. 2 437 864, Российская Федерация, МПКC05F3/00, A01C3/00, C05F11/08.Способ микробиологической переработки птичьего помета/ В. И. Дмитриев, И. В. Мартынова. Л. И. Кочкина. Опубл. 27.12.2011. Бюл. № 7.
• 10. Промышленная микробиология: Учеб. пособие для вузов по спец. «Микробиология» и «Биология» /3. А. Аркадьева, А. М. Безбородов, И. Н. Блохина и др.; Под ред. Н. С. Егорова. — М. Высш. шк. 1989. 688 с. ISBN 5−06−1 482−7, ББК 28.4 П 81, УДК 663.18
• 11. Андреева А. П. Микробиологическая трансформация анабазина микроорганизмами рода Pseudomonassp. Вестник Новосибирского государственного университета. Биология, клиническая медицина. 2010. Т. 8. № 4. С. 150−154.
• 12. SiddiquiI.A., HaasD., HeebS. ExtracellularproteaseofPseudomonasfluorescensснаоabiocontrollfactorwithactivityagainsttheroot-knotnematodeMeloidogyneincognita // Appl. Envitor. Microbiol. 2005. Vol. 71, № 9. P. 5646−5649.
• 13. Spiruchostatins a and b, novel gene expression-enhancingsubstances produced by Pseudomonas sp. Masuoka Y., Nagai A., Shinya K., Furihata K., Nagai K., Suzuki K.I., Hayakawa Y., Seto H. Tetrahedron Letters. 2001. Т. 42. № 1. С. 41−44