Селекция продуцентов каротиноидов

Каротиноиды — обширная группа природных пигментов, которые синтезируют хемо­ и фототрофами: прокариотами, мицелиальными грибами и дрожжами, водорослями и высшими растениями. Каротиноиды, синтезируемые микроорганизмами, существуют в клетке в свободной форме, а также в виде гликозидов, в виде эфиров жирных кислот и как каротино­белковые комплексы. Ценность этих соединений в том, что это источник витамина А. До настоящего времени не созданы истинные продуценты каротиноидов, а каротиноиды микроорганизмов выделяют из микроорганизмов преимущественно путем экстракции.

Биологически наиболее активным является провитамин, А — в-каротин.

Рисунок 4. в-каротин.

Каротиноиды содержат клетки бактерий (микобактерии, микрококки), дрожжи (Rhodotorula, Sporobolomyces), дрожжей (Blakeslea trispora). Особенно богата в-каротином биомасса Bl. Trispora, содержащая до 10−15 мг в-каротина на 1 г биомассы.

Культура дрожжей Blakeslea trispora образует (+) — и () — формы (гетероталлизм).

Посевной материал для каждой культуры готовят отдельно, а основную ферментацию ведут в одном аппарате. Для выращивания используют методы: поверхностной и глубинной культуры.

Метод глубинного культивирования. Среду готовят на доступных источниках углерода (углеводы, кислоты), часто из мелассных или зерновых заторов; концентрация в среде — 7−8%. В качестве источника азота используют минеральные соли или органические вещества. Добавляют 4−5% растительного масла богатого олеиновой и линоленовой кислотами, также 0,1% в-ионона. Выращивание посевного материала около 48 ч, основная фермантация длится — 5−6 сут. при температуре 28 С, pH — 6,2−6,7. Во время ферментации среда аэрируется. Интенсивные синтез каротиноидов начинается после использования азота питательной среды. Образование каротиноидов стимулируют — жирные кислоты, в-ионон, экстракты цитрусовых, помидоров, моркови, дрожжей, а также керосин. Во время ферментации необходимо добавить в питательную среду ПАВ (0,1%) для предотвращения образования жировых конгломератов. После ферментации мицелий фильтруют и сушат в вакууме при температуре 50−55 с. каротин извлекают их сухого размельченного мицелия экстракцией эфиром или растительными маслами. Для получения кристаллического каротина биомассу в течение 1−1,5 ч обрабатывают в экстракторе четырехкратным объемом бензола. В присутствии углекислоты бензол отгоняют. Полученный концентрат каротина омыляют 10% раствором гидроокиси калия в течение 20 мин при температуре 50 с. Коагулят, содержащий каротин, фильтруют, осадок промывают спиртом. Из полученной массы каротин экстрагируют эфиром при комнатной температуре, затем фильтруют, из фильтрата в вакуум-аппарате эфир отгоняют и получают насыщенный раствор каротина. Кристаллизацию ведут вначале при комнатной температуре, затем при 5 с. Выпавшие кристаллы фильтруют, промывают спиртом и сушат в вакуумных сушилках. Кристаллы каротина должны быть однородными, фиолетово-красного цвета с металлическим отливом. Содержание каротина в препарате не должно быть нижу 90%, температура плавления кристаллов не ниже 160 с [1].

Каратиноиды выполняют в клетке роль антиоксидантов и защищают ее от явления перекисного окисления. Кроме того, каратиноиды являются фотоловушками, собирающими световую энергию.

Промышленное получение каротиноидов.

Традиционные методы получения каратиноидов сводятся к гомогенизации биомассы и экстракции каратиноидов полярными растворителями (ацетон, метанол).

Каратиноиды получают путем разделения методом тонкослойной хроматографии на силикагеле, а также химическим синтезом. Традиционными продуцентами микробного синтеза каратиноидов являются бактерии, мицелиальные грибы и дрожжи. Из фототрофных бактерий можно отметить Chloroflexus и некоторые виды Rhodopseudomonas. Эта группа бактерий интересна тем, что у них в зависимости от интенсивности освещения можно регулировать выход каратиноидов. В Японии биомассу этих бактерий используют для окрашивания желтка яиц в качестве добавки в рацион. Каратиноиды получают в значительных количествах из некоторых водорослей, например из Chlorella sp. Cреди хемотрофов продуцентами каратиноидов являются дрожжи Rhodotorula gracilis, R. rubra, R. diobovatum, а также актиномицеты — Act. chrestomycetes, Act. chysomallus, микобактерии — Mycobacterium phei, M. carotenum, мицелиальные грибы семейств — из семейств Mucoraceae, Dacrymycetaceae.

Продуцентами в­каротина традиционно являются мукоровые грибы Blakeaslea trispora и Choanephora conjuncta. При совместном культивировании смешанные культуры дают выход до 3−4 г/л среды. Для получения в­каротина на основе Blakeslea trispora используют сложные по составу среды: кукурузно­соевый крахмал, дополненный маслами, поверхностно­активными веществами и стимуляторами. Процесс микробного синтеза протекает в несколько этапов. Сначала отдельно выращивают разнополые штаммы гриба, затем их смешивают, вносят стимуляторы каротинообразования (б­пирролидон, сукцинамид и т. д.). Причем различные типы каратиноидов: б, в, г, ликопоин образуются при стимулирующем действии различных веществ. Поэтому использование B. trispora в качестве продуцента обусловлено не только активностью синтеза каратиноидов, но и возможностью регуляции самого продукта.

Регуляция синтеза каратиноидов зависит:

• 1) от источника углерода. Если вводить в среду целлобиозу, то синтез каратиноидов этим штаммом возрастает в 7 раз;
• 2) внесения в среду отходов целлюлозного производства, что повышает также выход в­глюкозидазы.

На основе мутантов дрожжей Rhodosporidium diobovatum получают каротиносодержащий препарат, включаемый как белково­каратиноидная добавка в рацион скота. В настоящее время разработан способ получения каротиносодержащего препарата на основе мутантов Mycobacterium rubrum. Препарат комплексный и содержит б, в, г­каротины, ликопин и ксантофиллы. Для производства ксантофиллов используют гриб Dacrymyces deliquesсens. Выход каратиноидов на глюкозосодержащей среде с глицерином и кукурузным экстрактом составляет 40 мг/л.

витамин продуцент каротиноид микроорганизм.