Изучение растительных объектов в культуре in vitro методом ЯМР релаксации

В садоводстве, важное значение имеет раздел, связанный с разработкой и внедрением новых экономически эффективных методов размножения ценных сортов декоративных растений. Одним из таких способов является получение корнесобственных саженцев путем микроклонального размножения [1]. Он позволяет повысить коэффициент размножения и освобождает растения от вирусных болезней. Многие сорта роз возможно успешно и активно размножать посредством микроразмножения [2]. Однако существуют сложности в изучении и размножении особо ценных генотипов растений, ввиду отсутствия эффективных методов оценки роста и развития растительных клеток в культуре in vitro [3]. Ядерный магнитный резонанс — неразрушающая и неинвазивная методика, у которой есть большое количество анатомических и физиологических приложений к растительным клеткам, органам растения и живым растениям [4,5,6,7,8]. ¹Н ЯМР долго использовался для исследования физического состояния воды в растительной ткани и для неразрушающего измерения молекулярного смещения, такого как поток и диффузия в растениях [9].

Содержание воды и гидравлическая удельная электропроводность, включающая транспорт внутри клеток, по мембранам, между клетками, и дальний транспорт ксилемы и флоэмы, сильно зависит от дефицита воды в растении. Благодаря возможности измерить эти процессы транспорта неинвазивно, в неповрежденном растении относительно его клеток и тканей, можно исследовать и многие физиологические аспекты вегетирующего растения.

Одним из основных факторов создания эффективной биотехнологической системы является подбор оптимальной питательной среды, максимально полно обеспечивающей потребности растущей клеточной культуры продуцента в растительных регуляторах роста, макрои микроэлементах минерального питания, факторов регуляции процессов клеточного деления и дифференциации, необходимых для высокого биосинтеза целевого продукта.

Современные методы исследования интенсивности роста растений можно разделить на физические и химические. Из них большинство методов являются разрушающими [10], то есть, при анализе объекта его экспериментальный образец либо подвергается участию в химической реакции (химические методы), и по количественному составу продуктов последней судят об изучаемом объекте, либо образец должен пройти серию физико-химических превращений для пригодности исследования соответствующим методом (например, методы исследования коэффициентов преломления раствора, методы электронной микроскопии, рентгеновской дифракции и т. п.).

К неразрушающим образец методам относятся, в основном, спектроскопические, такие как методы диэлектрической спектроскопии (ДС и ВДС), электронный парамагнитный резонанс (ЭПР), электронный спиновый резонанс (ЭСР), ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и некоторые другие.

Ядерный магнитный резонанс является неразрушающим материал экспресс методом, дающим информацию о различных морфологических и физиологических параметрах растительного объекта, например, о размерах вакуолей в клетках растений, проницаемости клеточной мембраны, содержании воды в клетках [12], скорости и объеме потока веществ в ксилеме и флоэме [13].

Цель работы — изучить возможность применения метода ЯМР релаксации для оценки пролиферативной активности и определения оптимальных параметров развития эксплантов растений в культуре in vitro на основе водных потоков в меристематических очагах.

Материалы, методы и объекты исследований. Объектом для исследований являлись растительные ткани образцов Rosa hybryda, культивируемые in vitro.

ЯМР в настоящее время является одним из самых популярных методов исследования микроструктуры соединений природного происхождения. Ядерная магнитная релаксация — это процесс установления термодинамического равновесия внутри спиновой системы с характерным временем T₂, и в системе спины-решетка с общим временем релаксации T₁ [14]. Спин-спиновая (поперечная) релаксация происходит в плоскости xy и сопровождается излучением фотонов, т. е. является наблюдаемой величиной. Продольная спин-решеточная релаксация не вызывает излучательных переходов в спин-системе и наблюдается косвенно [15,16]. Следует отметить, что время Т₂ непосредственно зависит от подвижности протонов и если протоны подвижны, то Т₂ длиннее. Этот параметр мы использовали для оценки интенсивности роста растительных объектов в культуре in vitro.

Чтобы характеризовать подвижность сегментов макромолекул и функциональных групп, в работе использовалось время спин-спиновой релаксации Т₂, которое возрастает с уменьшением времени корреляции движений ¹₁H в изучаемом образце. На основе измерений амплитуды ССИ определялось количество протонов водорода в образце, так как эти величины связаны линейно. Для определения времени ядерной магнитной релаксации Т₂ и амплитуды сигнала ЯМР исследуемых образцов использовались импульсные последовательности Карра — Перселла — Мейбума — Гилла (КПМГ) [17,18], спада свободной индукции (ССИ) и спинового эха Хана. Время спин-решеточной релаксации (Т₁) определялось путем снятия кривой восстановления продольной намагниченности (импульсная последовательность 90⁰ — - 90⁰).

Все измерения проводились на ЯМР-анализаторе «Spin Track», зарегистрированном в Государственном реестре средств измерений Российской Федерации под номером 32 677 — 06 [19], поддерживающем все возможные приложения ЯМР низкого разрешения. Процедура подготовки образца в большинстве приложений сводится лишь к помещению анализируемого вещества в пробирку и установке ее в датчик прибора. Основные параметры ЯМР-анализатора «Spin Track» приведены в таблице 1.

Таблица 1 — Основные характеристики ЯМР-анализатора «Spin Track».

Теоретические расчеты, моделирование и аппроксимация экспериментальных данных проводились с использованием современного программного обеспечения Origin 6.1 и MATHCAD 2001 Professional. Построение графиков и обработка данных осуществлялась при помощи пакета программ Microcal Origin 6.1.

Для экспериментов по исследованию интенсивности роста и динамики формирования меристематических очагов в культуре растительных тканей были взяты культуры Rosa hybrida сортов `Парцелайн' и `Ле руж э ле нуар'. Все образцы культивировались на среде по прописи MS [20] с различной концентрацией 6-бензиламинупирина в пробирках Видаля. Данные с образцов собирались в различные периоды культивирования (через 2, 3 и 4 недели). Измерения магнитно-релаксационных параметров проводились на ЯМР релаксометре «Spin Track» с частотой резонанса 19 МГц [17]. Времена спин-спиновой релаксации Т₂ измерялись при помощи импульсной последовательности Карра-Парселла-Мейбума-Гилла. Времена спин-решеточной релаксации Т₁ были получены в эксперименте с импульсной последовательностью 90—90. Результаты проведенных экспериментов по ЯМР-релаксации во временной области для Rosa hybrida сорта `Парцелайн' представлен в таблице 2.

Таблица 2 — Экспериментальные данные ЯМР-релаксации образцов Rosa hybrida сорта `Парцелайн' в зависимости от продолжительности культивирования.

Анализируя данные, можно сделать вывод, что наличие в питательной среде фитогормонов влияет на формирование меристематических очагов у анализируемых образцов. Это объясняется тем, что уменьшение времени спин-спиновой релаксации Т₂ говорит о снижении подвижности протонов в исследуемых образцах, что в свою очередь может свидетельствовать о формировании меристематических очагов в растительной ткани, которое сопровождается увеличением числа клеток и протонной плотности. Так, на питательной среде без содержания фитогормонов время спин-спиновой релаксации Т₂ через 2 недели культивирования составило 6100 мкс, через 3 недели — 6437 мкс, через 4 недели 9083 мкс. Увеличение времени Т₂ в процессе культивирования свидетельствует об отсутствии формирования меристематических очагов у анализируемых образцов.

На средах с добавлением 6-БАП в концентрации 0,5 мг/л, 2 мг/л, 5 мг/л и 7 мг/л время спин-спиновой релаксации с течением времени уменьшается, что свидетельствует процессе формирования меристематических очагов.

На рисунке 1 показана зависимость формирования меристематических очагов культуры Rosa hybrida сорта `Парцелайн' от концентрации 6-БАП в питательной среде. растение садоводство биотехнологический Рисунок 1 — Зависимость формирования меристематических очагов Rosa hybrida сорта `Парцелайн' от концентрации 6-БАП в питательной среде У образцов Rosa hybrida сорта `Парцелайн' наиболее интенсивное формирование меристематических очагов наблюдали на среде с добавлением 6-БАП в концентрациях 0,5 мг/л и 2 мг/л. Дальнейшее увеличение концентрации 6-БАП снижает интенсивность формирования меристематических очагов. Результаты проведенных экспериментов по ЯМР-релаксации во временной области для Rosa hybrida сорта `Ле руж э ле нуар' представлены в таблице 3.

Таблица 3 — Экспериментальные данные ЯМР-релаксации образцов Rosa hybrida сорта `Ле руж э ле нуар' в зависимости от продолжительности культивирования.

Данные показывают, что наличие в питательной среде фитогормонов влияет на формирование меристематических очагов у анализируемых образцов. Так, на питательной среде без содержания фитогормонов время спин-спиновой релаксации Т₂ через 2 недели культивирования составило 111 мкс, а через 4 недели — 123 мкс. Увеличение времени Т₂ свидетельствует об отсутствии формирования меристематических очагов у анализируемых образцов.

На средах с добавлением 6-БАП в концентрации 0,5 мг/л, 2 мг/л, 5 мг/л и 7 мг/л время спин-спиновой релаксации с течением времени уменьшается, что свидетельствует о процессе формирования меристематических очагов.

На рисунке 2 показана зависимость формирования меристематических очагов культуры Rosa hybrida сорта `Ле руж э ле нуар' от концентрации 6_БАП в питательной среде.

Рисунок 2 — Зависимость формирования меристематических очагов культуры Rosa hybrida сорта `Ле руж э ле нуар' от концентрации 6-БАП в питательной среде Таким образом<sub>,</sub> у образцов Rosa hybrida сорта `Ле руж э ле нуар' уменьшение времени спин-спиновой релаксации Т_2, а, следовательно, и наиболее интенсивное формирование меристематических очагов наблюдается на питательной среде с добавлением фитогормона в концентрации 0,5 мг/л.

На следующих рисунках приведены графики спада поперечной намагниченности у образца Rosa hybrida сорта `Ле руж э ле нуар', культивируемого на среде с добавлением 0,5 мг/л 6-БАП через 2 (рис. 3) и 4 недели (рис. 4) культивирования.

Рисунок 3 — Спад поперечной намагниченности у образца Rosa hybrida сорта `Ле руж э ле нуар', культивируемого на среде с добавлением 0,5 мг/л 6-БАП через 2 недели культивирования Рисунок 4 — Спад поперечной намагниченности у образца Rosa hybrida сорта `Ле руж э ле нуар', культивируемого на среде с добавлением 0,5 мг/л 6-БАП через 4 недели культивирования На следующих рисунках приведены графики спада поперечной намагниченности у образца Rosa hybrida сорта `Парцелайн', культивируемого на среде с добавлением 0,5 мг/л 6-БАП через 2 (рис. 5) и 4 недели (рис. 6) культивирования.

Рисунок 5 — Спад поперечной намагниченности у образца Rosa hybrida сорта `Парцелайн', культивируемого на среде с добавлением 0,5 мг/л 6_БАП через 2 недели культивирования Рисунок 6 — Спад поперечной намагниченности у образца Rosa hybrida сорта `Парцелайн', культивируемого на среде с добавлением 0,5 мг/л 6-БАП через 4 недели культивирования Применение магнитнорезонансной релаксации в изучении пролиферативной активности клеток растений позволит своевременно оценить и при необходимости изменить условия культивирования эксплантов на различных этапах онтогенеза, а также существенно увеличить эффективность подбора компонентов питательных сред и как следствие ускорить процесс размножения растений.

• 1. Поздняков, И. А. Особенности микроклонального размножения шиповника и декоративных сортов рода Rosa L.: автореф. дис. канд. с-х. наук / И. А. Поздняков. — М., 2007. — 25 с.
• 2. Arnold, N.P. A study of the effect of growth regulators and time of plantlet harvest on the in vitro multiplication rate of hardy and hybrid tea roses / N.P. Arnold, M.R. Binns, N.N. Barthakur, D.C. Cloutier // Journal of Horticultural Science 67. — 1992. — N. 6. — P. 727−735.
• 3. Сергеев, Р. В. Выращивание декоративных цветочных растений в культуре in vitro с использованием субстратов из органических отходов / Е. М. Романов, Д. И. Мухортов, А. Д. Средин, Р. В. Сергеев, А. И. Шургин // Вестник МарГТУ. № 3(13)., 2011. — С. 72−81.
• 4. Walter, L. Studies of plant systems by in vivo NMR spectroscopy / L. Walter, R. Callies, R. Altenburger // In: de Certaines JD, Boveґe WMMJ, Podo F, eds. Magnetic resonance spectroscopy in biology and medicine. Oxford: Pergamon Press. — 1992. — P. 573−610.
• 5. Ratcliffe, R.G. In vivo NMR studies of higher plants and algae / R.G. Ratcliffe // Advances in Botanical Research. — 1994. — Vol. 20. — P. 42−123.
• 6. Shachar-Hill, Y. Nuclear magnetic resonance in plant biology / Y. Shachar-Hill, P.E. Pfeffer // Rockville: American Society of Plant Physiologists. — 1996.
• 7. Chudek, J.A. Magnetic resonance imaging of plants / Y. Shachar-Hill, P.E. Pfeffer // Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. — 1997. — Vol. 31. — P. 43−62.
• 8. Ishida, N. The NMR microscope, a unique and promising tool for plant science / N. Ishida, M. Koizumi, H. Kano // Annals of Botany. — 2000. — Vol. — 86. — P. 259−278.
• 9. MacFall, J.J. Magnetic resonance imaging of plants / MacFall J. J, As. H. Van // The American Society of Plant Physiologists.-.1996. — P. 33−76.
• 10. Современные физические методы исследования полимеров / Под. ред. Г. Л. Слонимского. — М.: Химия, 1982.
• 11. Рот, Г. К. Радиоспектроскопия полимеров / Г. К. Рот, Ф. Келлер, Х. Шнайдер — М.: Мир, 1987.
• 12. Scheenen, T.W.J. Quantification of water transport in plants with NMR imaging / T.W.J. Scheenen, D. van Dusschoten, P.A. de Jager, H. Van As // J. Exp. Bot. 2000. — 51(351). — P. 1751−1759.
• 13. Windt, C.W. MRI of long-distance water transport: a comparison of the phloem and xylem flow characteristics and dynamics in poplar, castor bean, tomato and tobacco / C.W. Windt, E. Gerkema, J. Oosterkamp, H. Van As // Plant Cell Envir. — 2006. — 29(9). — P. 1715−1729.
• 14. Чижик, В. И. Ядерная магнитная релаксация. / В. И. Чижик //- Ленинград., изд-во Ленинградского университета, 1991.
• 15. Фаррар, Т. Импульсная и фурье-спектроскопия ЯМР / Т. мФаррар, Э. Беккер. — М: Мир, 1973.
• 16. Эмсли, Дж. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса высокого разрешения / Дж. Эмсли, Дж. Финей, Л. Сатклифф. — М.: Мир, 1968.
• 17. http://www.nmr-design.com/ru/
• 18. Грунин, Ю. Б Импульсный метод ЯМР для определения термодинамических характеристик адсорбционных процессов в биополимерах / Ю. Б. Грунин, Л. Ю. Грунин, Е. А. Никольская // Журн. физ. химии. — 2007. — Т.81, № 7. — С. 1165−1170.
• 19. Carr, H.Y. Purcell E.M. Physical Review В 94 (35), p. 630 — 638, 1954.
• 20. Meiboom, S., Gill D. The Review of Scientific Instruments B 29 (45).
• 21. Грунин, Л. Ю. Протонная магнитная релаксационная спектроскопия природных полимеров: дис. … канд. хим. наук: 02.00.04: защищена 21.12.98: утв. 14.05.99 / Грунин Леонид Юрьевич. — Йошкар-Ола, 1998.
• 22. Murashige, T. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures / T. Murashige, F. Skoog // Physiologia Plantarum. — 1962. — Vol. 15. — P. 473 — 497.