Гемиохромный метод. 
Методы определения концентраций общего гемоглобина в крови человека

С развитием методов анализа для определения гемоглобина в крови разработан новый колориметрический метод, не содержащий в составе реагентов цианистых соединений, которые заменены жирными кислотами с ферроцианидом калия или поверхностно-активными веществами, лучший из которых — додецилсульфат натрия (SDS, он же SLS — лаурилсульфат натрия).

Принцип гемихромного метода:

Принцип гемихромного метода основан на переводе всех форм гемоглобина в одну: гемихром. При взаимодействии гемоглобина с трансформирующим раствором, содержащим жирные кислоты с феррицианидом калия или додецилсульфатом натрия, происходит его превращение в комплексное соединение — гемихром (HbChr), имеющую красноватый цвет, интенсивность окраски которого прямо пропорциональна концентрации гемоглобина в пробе. Образование комплекса происходит согласно реакции:

SLS + HGb = [SLS+HGb].

Характеристика метода:

Гемихромный метод определения гемоглобина в крови разработан Ахрем А. А. с соавторами в 1986 г. Набор реагентов для определения гемоглобина в крови, основанный на данном методе, одобрен Комитетом по новой медицинской технике МЗ РФ и рекомендован к применению в клинико-диагностических лабораториях уже в 1998 г. Основные достоинства гемихромного метода:

• 1) Гемихром — стабильное производное гемоглобина, и все имеющиеся в крови формы гемоглобина могут быть быстро и количественно превращены в HbChr;
• 2) Спектр поглощения HbChr имеет плоский максимум вблизи л= 540 нм, поэтому достаточная точность анализа возможна при измерении оптической плотности на фотометрах даже со светофильтрами;
• 3) Растворы HbChr строго подчинены закону Ламберта-Бера при л = 540 нм в широком диапазоне концентраций;
• 4) Калибровочный раствор HbChr устойчив в течение нескольких месяцев и даже лет;
• 5) Трансформирующий реагент не ядовит и безвреден: в его составе не содержится цианистых соединений.

Сравнение гемихромного и гемиглобинцианидного методов:

При широкомасштабных испытаниях гемихромного метода было показано, что в интервале концентраций гемоглобина от 40 до 200 г/л калибровочные графики гемиглобинцианида и гемихрома представляют прямую линию, выходящую из начала координат, а близкие углы наклона прямых указывают на сопоставимость обоих методов.

Сравнительная оценка результатов определения гемоглобина в крови двумя методами показала, что результаты сопоставимы, а коэффициент корреляции методов составляет 0,99.

Таким образом, гемихромный метод определения гемоглобина в крови обладает всеми достоинствами гемиглобинцианидного метода, которые дополняются отсутствием в составе трансформирующего реагента высокотоксичных цианидов и других ядовитых веществ.

Реагенты, необходимые для определения гемоглобина:

Трансформирующие реагенты Для перевода гемоглобина в HbChr имеется несколько трансформирующих реагентов, отличающихся по составу:

• — четвертичные аммониевые соли с ПАВ (тритон Х-100, бридж — 35)
• — соли жирных кислот (С14- С20) с феррицианидом калия и ЭДТА в трисовом буфере;
• — SDS (или SLS, лаурилсульфат натрия, ПАВ).

Из перечисленных трансформирующих реагентов лучшим является SDS. Максимальная скорость превращения гемоглобина в HbChr отмечена именно при его взаимодействии с SDS, полное превращение которого происходит за 5 мин. Спектр поглощения HbChr в области 540 нм имеет большое сходство со спектром поглощения гемиглобинцианида.

Калибровочный раствор гемихрома:

В 1998 г. Пупковой В. И. с соавторами разработан, запатентован и внедрен в практику Набор реагентов для определения гемоглобина гемихромным методом, содержащий калибровочный раствор гемихрома. Набор зарегистрирован в МЗ РФ и рекомендован к применению. Калибровочный раствор гемихрома обладает достаточной стабильностью (не менее 1 года) и обеспечивает высокую точность измерения гемоглобина при л = 540 нм.

Созданный калибровочный раствор гемихрома соответствует всем требованиям, предъявляемым к калибровочным растворам: это стерильный водный раствор, разлитый в ампулы из светозащитного стекла, прозрачен.

Аттестация калибровочных растворов гемихрома проводится опосредованно относительно Государственного калибровочного раствора гемиглобинцианида с погрешностью, не превышающей ± 2%, поэтому и результаты одной пробы, полученные обоими методами, сопоставимы: их расхождение также не превышает ± 2%. При теоретическом молярном коэффициенте экстинкции гемиглобинцианида, равном 11,00, молярный коэффициент экстинкции гемихрома составляет ~ 10,14. Эту величину предстоит еще уточнить.

Контрольные растворы гемоглобина:

Для гемихромного метода используются те же самые контрольные растворы гемоглобина, что и для гемиглобинцианидного метода.

Описание наборов реактивов и оборудования, примененных в исследовании Набор реактивов:

Гемоглобин-13-Ольвекс Набор «ГЕМОГЛОБИН-ОЛЬВЕКС» предназначен для количественного определения содержания гемоглобина в крови унифицированным гемиглобинцианидным методом в клинической лабораторной диагностике. Согласно стандартной процедуре анализа набор рассчитан на проведение 400 определений при расходе 5,0 мл рабочего реагента на один анализ.

Принцип метода:

Под действием феррицианида калия гемоглобин окисляется в метгемоглобин (гемиглобин) с железом в форме Fe3+, который в присутствии ацетонциангидрина трансформируется в окрашенный комплекс цианометгемиглобин (гемиглобинцианид), интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации гемоглобина в крови и определяется фотометрически при длине волны 540 (520−560) нм.

Состав набора:

Монореагент (концентрат):

Фосфатный буфер, рН=7,35, CМ = 10•10−3 моль/л Ферроцианид калия, CМ = 6,1•10−3 моль/л.

Brij 35 (Синтанол, с общей формулой C20H45O5), Сг/л = 5 г/л Ацетонциангидрин, СМ = 11,2•10−3 моль/л.

Калибратор:

Гемоглобин, Сг/л = 120 г/л.

Аналитические характеристики:

Линейная область определения концентрации гемоглобина в диапазоне от 40 до 200 г/л.

Отклонение от линейности не более 2%.Чувствительность определения не более 5,0 г/л.

Коэффициент вариации не более 2%.

Окраска стабильна в течение 6-ти часов в защищенном от света месте. Качество набора может проверяться на отечественных или зарубежных контрольных образцах крови, с аттестованным по данному методу показателем.

Нормальные величины содержания гемоглобина в крови:

Мужчины — 132−164 г/л;

Женщины — 115−145 г/л.

Анализируемые образцы:

Свежая капиллярная кровь.

Меры предосторожности:

Потенциальный риск применения набора? класс 2а. Все компоненты раствора в используемых концентрациях являются нетоксичными. В состав монореагента входит ядовитый ацетонциангидрид. При работе с набором следует избегать попадания этого реагента на кожу и слизистые; при попадании следует промыть пораженное место большим количеством проточной воды. Пипетирование per os категорически запрещается; при попадании внутрь следует немедленно выпить 0,5 л теплой воды и вызвать рвоту.

Гемоглобин-15-Ольвекс Набор «ГЕМОГЛОБИН-15-ОЛЬВЕКС» предназначен для количественного определения содержания гемоглобина в крови гемихромным колориметрическим методом в клинической лабораторной диагностике. Согласно стандартной процедуре анализа набор рассчитан на проведение 800 определений при расходе 5,0 мл рабочего реагента на один анализ.

Принцип метода:

Под действием реагента, содержащего SlS (натрия лаурилсульфат), гемоглобин трансформируется с образованием окрашенного соединения — гемихром. Интенсивность окраски реакционной среды пропорциональна концентрации гемоглобина в крови и определяется фотометрически при длине волны 540 (520−560) нм.

Состав набора:

Монореагент (концентрат):

Фосфатный буфер, рН=7,4, CМ = 1 моль/л Натрия лаурилсульфат (SLS), Cг/л = 129 г/л Калибратор:

Гемоглобин, Сг/л = 120 г/л.

Аналитические характеристики:

Линейная область определения концентрации гемоглобина в диапазоне от 40 до 220 г/л.

Отклонение от линейности не более 2%.

Чувствительность определения не более 5,0 г/л.

Коэффициент вариации не более 2%.

Анализируемые образцы:

Свежая капиллярная кровь.

Методы предосторожности:

Потенциальный риск применения набора — класс 1. Все компоненты раствора в используемых концентрациях являются нетоксичными при работе с набором следует не допускать попадания реагента на кожу и слизистые; при попадании следует промыть пораженной место большим количеством проточной воды; при попадании внутрь следует немедленно выпить 0,5 л теплой воды и вызвать рвоту. При плохом самочувствии следует обратиться к врачу. При работе с набором следует использовать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки.