Методика выделения ДНК

Насекомое (имаго яблонной плодожорки) помещают в микроцентрифужную пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 см³. С помощью дозатора добавляют 600 мм³ 2%-ного СТАВ буфера и немедленно тефлоновым или стекляным пестиком растирают смесь до получения однородной массы. Затем смесь перемешивают в течение 30 с на аппарате для встряхивания типа «Вортекс».

Приготовленные смеси (в случае нескольких образцов) помещают в термостат, инкубируют при 65^оС 60 мин, после чего повторно перемешивают 30 с на аппарате для встряхивания.

В каждую микроцентрифужную пробирку добавляют равный объем хлороформа, перемешивают на аппарате для встряхивания 30 с до образования суспензии.

Полученные суспензии центрифугируют 10 мин на настольной микроцентрифуге типа Эппендорф при частоте вращения 13,5 тыс.об. мин —¹ при комнатной температуре.

Супернатант отбирают в чистые пробирки, не захватывая слой хлороформа, и добавляют 1/10 объема, предварительно нагретого 10% СТАВ. Повторяют п. 4.3, п. 4.4.

Супернатант отбирают в чистые пробирки и добавляют 1,25 объема СТАВ буфера для осаждения и оставляют на 1−3 ч при 25−37 ^оС.

Смесь центрифугируют согласно п. 4.4.

Супернатант отбрасывают и добавляют к осадку 200 мм³ раствора 1 М NaCl в TE, перемешивают до полного растворения осадка (при необходимости инкубируют 5 -15 мин при 65^оС.).

ДНК осаждают 0,6 объема холодного изопропанола и смесь центрифугируют согласно п. 4.4.

Осадок 2 раза промывают 500 мм³ 70%-ного этилового спирта, каждый раз перемешивая осадки на аппарате для встряхивания 15−20 с и центрифугируя их на микроцентрифуге 10 мин при частоте вращения 12 000 об/мин^-1. Тщательно (до последней капли) удаляют надосадочную жидкость.

Осадок подсушивают и растворяют в 200 мм³ бидистилированной воды, получают раствор ДНК.

Растворы ДНК непосредственно используют для проведения ПЦР или хранят при температуре минус 20^оС сроком до одного года в морозильной камере.