Определение содержания малонового диальдегида

Определение вторичного продукта ПОЛ — малонового диальдегида, проводили по качественной реакции с тиобарбитуровой кислотой.

Принцип метода:

В липидных системах в результате процессов перекисного окисления липидов образуется малоновый диальдегид (МДА), взаимодействие которого с 2-тиобарбитуровой кислотой приводит к образованию хромогена с максимумом поглощения в красной области видимого спектра при длине волны 532 нм (Ko, Godin, 1990).

Реактивы:

• 1. 0,9%-ный раствор NaCl (физиологический раствор);
• 2. 30%-ный раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ);
• 3. 0,1 М раствор динатриевой соли этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) (С10Н14N2Na2O8 * 2H2O, Mr = 372,24г/моль).
• 4. 1%-ный раствор 2-тиобарбитуровой кислоты (ТБК);
• 5. 0,05 н раствор NаОН;

Оборудование: спектрофотометр СФ-46.

Ход определения:

К 0,2 мл плазмы добавляют 0,8 мл физиологического раствора и 0,5 мл раствора ТХУ, перемешивают и ставят в ледяную баню на 2 часа. Затем центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин. (1700g). Аналогичным образом готовят контрольную пробу, в которой эритроциты заменяют равным объемом дистиллированной Н2О. 1 мл супернатанта переносят в другую пробирку, добавляют 0,075 мл ЭДТА и 0,25 мл раствора ТБК, приготовленного на 0,05 н растворе NаОН. Содержимое перемешивают и ставят пробирки в кипящую водяную баню на 15 мин. Затем пробирки охлаждают до комнатной температуры.

Для определения концентрации МДА в ткани печени, почек и мозга использовали 3 мл гомогената и 1,5 мл раствора ТХУ, соответственно объём остальных реактивов увеличивали в 3 раза.

Измеряют поглощение опытной пробы против контрольной на спектрофотометре при 532 нм 600 нм в кюветах с толщиной слоя 1,0 см. Расчёт содержания МДА производят с учётом коэффициента молярной экстинкции образовавшегося хромогена, равного 1,56*105 М-1см-1 (Стальная И.Д., 1977):

С (моль / г ткани) = D532 — D600 · F / К · m.

C (моль / л плазмы) = D532 — D600 · F / К, где С — содержание МДА;

D532 — оптическая плотность опытной пробы при длине волны 532 нм;

D600 — оптическая плотность опытной пробы при длине волны 600 нм;

F — фактор разведения, равный 9,94;

К — коэффициент молярной экстинкции образовавшегося хромогена, равный 1,56· 105 М-1см-1;

m — масса образца, г.

Определение содержания белка

Для определения содержания белка использовали микробиуретовый метод (Кочетков, 1971).

Реактивы:

• 1. Стандартный раствор белка (сывороточного альбумина);
• 2. Биуретовый реактив (реактив Бенедикта) — 17,3 г цитрата натрия и 10 г карбоната натрия растворяют при подогревании в небольшом количестве воды, в раствор добавляют 1,73 г сульфата меди, растворённого в 10 мл воды, и доводят водой до 100 мл.
• 3. 6%-ный раствор NaOH.

Оборудование: спектрофотометр СФ-26.

Ход определения:

К 2 мл физиологического раствора, содержащего 10 мкл гомогената, добавляют 2 мл 6%-ного NaOH и 0,2 мл реактива Бенедикта. Раствор хорошо перемешивают и через 15 мин фотометрируют при 330 нм на спектрофотометре. Предварительно строят график по стандартному раствору белка, по которому, построив линию Тренда, и определяют концентрацию белка в растворе.

Статистическая обработка результатов

Результаты обрабатывались статистически с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.0 по t-критерию достоверности Стьюдента при уровне значимости p < 0.05.