Анализ биохимических показателей

Экстракция белков из тканей

У лабораторных животных (крыс) для последующего биохимического анализа были взяты образцы нервной ткани — гиппокампа и коры больших полушарий. Учитывая дисперсность пула кальпаинов в клетке, связанную со спецификой их регуляции, определяли показатели как в цитозольной фракции клеток, так и во фракции мембрано-связанных белков, полученных по методу (Enns, Belcastro, 2006). Цитоплазматическую фракцию получали из ткани, гомогенизированной в 20 мМ Трис-HCl-буфере (рН 7.5) с добавлением 80 мМ КСl, 5 мМ Na-соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) и 20 мМ дитиотреитола (DTT) (соотношение 1:10, вес/объем) с последующим центрифугированием (20 000 g, 20 мин). Фракцию мембраносвязанных белков — повторным центрифугированием (20 000 g, 20 мин) получившегося осадка, предварительно ресуспендированного в равном объеме того же буфера с добавлением 0.33% тритона X-100. Буфер для гомогенизации включал смесь ингибиторов протеиназ: лейпептина (0.5 мкг/мл), пепстатина (1 мкг/мл), апротинина (1 мкг/мл) и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF).

Буфер для гомогенизации, (объём 500 мл).

• *20 мМ Трис, навеска 1,2114 г
• *80 мМ хлорида натрия, навеска 2,98 г
• *5 мМ ЭДТА, навеска равна 0,9306 г
• *20 мМ ДТТ, навеска равна 1,54 г
• *растворить в дистиллированной воде, довести рН до 7,5 5 конц. HCl
• *довести водой до 500 мл в колбе

Буфер для гомогенизации с тритоном Х-100 (объём 100 мл).

• *0,33% тритон Х-100, навеска 0,33 г.
• *довести до 100 мл буфером для гомогенизации.

Ингибитор PMSF (объем 10 мл).

• *100 мМ PMSF, навеска 174 мг
• *растворить в 10 мл изопропанола
• *разлить по аликвотам 0,5 мл, заморозить при -20 ^оС