Скрининг микроделеций AZF локуса y хромосомы у мужчин с нарушением сперматогенеза

СКРИНИНГ МИКРОДЕЛЕЦИЙ AZF ЛОКУСА Y ХРОМОСОМЫ У МУЖЧИН С НАРУШЕНИЕМ СПЕРМАТОГЕНЕЗА А. А. Исламова, Р. И. Хусаинова, Р. Ф. Ахметов, О. С. Шитков, Э. К. Хуснутдинова Проблема бесплодия встречается примерно у 15% супружеских пар, причем примерно половина случаев обусловлена нарушением сперматогенеза у мужчин. Генетические факторы в этиологии бесплодия занимают ведущее место в структуре нарушений репродуктивной функции, как у мужчин, так и женщин. Причиной генетически обусловленного мужского бесплодия, связанного с нарушением сперматогенеза, в10−15% случаев являются структурные нарушения Y-хромосомы.

Ранее полагали, что функция Y-хромосомы у млекопитающих ограничивается контролем за дифференцировкой пола, но в 1976 г. были представлены доказательства значения Y-хромосомы человека для сперматогенеза. Y-хромосомаодна из самых маленьких хромосом в геноме человекаимеет размер около 60Mb, 30 из которых приходится на эухроматиновые домены, а остальноена гетерохроматиновый блок в дистальном участке длинного плеча, который может сильно варьировать по размеру у разных индивидов. В целом, хромосома делится на три участка: эухроматиновое короткое плечо (Yp11), эухроматиновая проксимальная часть длинного плеча (Yq11) и гетерохроматиновый дистальный участок (Yq12). Эухроматиновые районы невариабельны в размерах 1.

Анализируя терминальную делецию Y-хромосомы у 6 стерильных мужчин с нормальным фенотипом и азооспермией, Tiepolo и Zuffardi в 1976 году предположили существование генного комплекса мужской фертильности в дистальном участке эухроматиновой части длинного плеча Y-хромосомы (Yq11). Этот локус назвали фактором азооспермии (AZF) 13. Дальнейшие цитогенетические и молекулярно-генетические исследования позволили построить детальную карту Y-хромосомы, включающую 43 делеционных интервала.

В настоящее время цитогенетическими и молекулярно-генетическими методами можно диагностировать макрои микроделеции Y-хромосомы, захватывающие локус AZF, которые удается обнаружить у 10−15% больных с азооспермией и у 5−10% с олигозооспермией тяжелой степени 3, 6, 9, 11, 16.

В 1996 г Vogt и соавторы на основании полученных данных о локализации и размере делеций предложили выделить в локусе Yq11.21-q11.23 три неперекрывающихся субрегиона, получившие названия AZFa, AZFb и AZFc 16. AZFа субрегион располагается в дистальной части Yq11, AZFb и AZFc картированы проксимальнее первого. У пациентов с микроделециями этих субрегионов выявлено нарушение сперматогенеза на различных стадиях, в зависимости от потери определенного участка AZF.

Впоследствии для каждого субрегиона были выделены кандидатные гены, ответственные за нарушение сперматогенеза: для AZFa — USP9Y (DFFRY) и DBY, для AZFb — RBMY, для AZFc-региона — DAZ. Определены нуклеотидная последовательность и размер каждого субрегиона: AZFa около 800 тыс. п. н., AZFb — 3,2 млн. п. н. и AZFc-3,5 млн. пар нуклеотидов.

В отличие от генов-кандидатов субрегионов AZFb и AZFc, гены AZFa-субрегиона представлены на хромосоме единственной копией, поэтому, даже точковые мутации могут вызвать нарушение сперматогенеза и приводить к бесплодию у мужчин. Вероятно, делеции или мутации гена DBY, кодирующего тестис-специфичную РНК-геликазу, нарушают процесс метаболизма мРНК в дифференцирующихся мужских половых клетках, приводя к усилению его апоптической активности.

Гены RBMY и DAZ, являющиеся «кандидатными» генами для субрегионов AZFb и AZFc, представлены на Y-хромосоме в нескольких копиях, кодируют белки с РНК-связывающей активностью, которые участвуют в метаболизме новосинтезированных РНК-транскриптов. Вероятно, гены семейства RBMY играют важную роль на стадиях пролиферации сперматогониев и при прохождении сперматоцитов через стадии профазы I мейоза, а их отсутствие или нарушение функции может привести к блоку сперматогенеза на стадии сперматоцитов и, как следствие, к азооспермии. Продукты, кодируемые генами DAZ, участвуют в метаболизме мРНК тестис-специфичных генов, регулируя их экспрессию в дифференцирующихся половых клетках после мейоза на этапах сплайсинга, транспорта, хранения и селективной трансляции мРНК вплоть до образования зрелых сперматозоидов. Делеции генов DAZ могут приводить к различной степени нарушения сперматогенеза — от снижения числа сперматозоидов вплоть до СКС (синдром клеток Сертоли) — либо блокированию сперматогенеза на уровне сперматид (делений созревания) 4. Вследствие многокопийности генов RBMY и DAZ поиск мутационных нарушений в них значительно затруднен. Ряд генов локуса AZF имеет гомологи, расположенные как на X-хромосоме, так и на аутосомах. Механизмы их межгенного взаимодействия, возможности функциональной компенсации еще не известны и требуют дальнейшего изучения.

У пациентов с делециями локуса AZF, помимо снижения количества сперматозоидов, отмечено ухудшение их подвижности и морфологических характеристик — олигоастенотератозооспермия. Специфичных форм нарушений морфологии сперматозоидов у пациентов с делециями локуса AZF не описано. Помимо генов DAZ субрегион AZFc содержит копии гена CDY I (хромодомен хромосомы Y), функция которого связана с модификацией хроматина в дифференцирующихся мужских половых клетках. Поэтому нельзя исключить, что потеря или дефекты функции генов CDY I могут быть в определенной степени ответственны за нарушение сперматогенеза.

Строгой зависимости степени и стадии нарушения сперматогенеза от локализации и размера делеции локуса AZF не получено, однако был выявлен ряд общих гено-фенотипических корреляций. В настоящее время установлено, что более крупные делеции, захватывающие два или три субрегиона, а также AZFa-микроделеции ассоциированы с более тяжелым нарушением сперматогенеза (синдром клеток Сертоли). Наиболее частые делеции субрегионов AZFc и AZFb+с приводят к снижению сперматогенной активности или блокированию сперматогенеза до СКС 2,7.

Определение зависимости степени нарушения сперматогенеза от размера и локализации делеций имеет прогностическое значение в плане получения сперматозоидов, пригодных для проведения ИКСИ (Introcitoplasmic Sperm Injection).Так, наличие делеций, захватывающих субрегионы AZFa и/или AZFb, указывает на невозможность получения зрелых половых клеток, а у пациентов с делециями AZFc примерно в 50−70% случаев удается получить зрелые сперматозоиды 7.

Материалы и методы С февраля 2005 года лабораторией молекулярной генетики человека ИБГ УНЦ РАН совместно с Центром планирования семьи и репродукции с медико-генетическим консультированием при Республиканском перинатальном центре было обследовано 45 пациентов с первичным бесплодием. Возраст инфертильных мужчин варьировал от 24 до 48 лет (в среднем 334.8 года).

Обследование включало следующие исследования: клиническое, андрологическое (общее и специальное), спермиологическое и молекулярно-генетическое (анализ микроделеций Y-хромосомы). На основании результатов спермиологического исследования все мужчины с нарушением сперматогенеза были разделены на 3 группы. В первую группу отобрали 32 пациента с азооспермией, во вторую — 13 мужчин с олигозооспермией тяжелой степени (менее 5 млн/мл эякулята), в третью — 4 пациента с астенотератозооспермией (количество сперматозоидов превышало 5 млн/мл эякулята). Контрольная группа состояла из 50 здоровых (фертильных) мужчин, имеющих потомство. Спермиологический анализ эякулята выполняли по стандартной методике, рекомендованной ВОЗ (WHO, 1992; 1999) 15. ДНК была выделена из лимфоцитов периферической крови последовательным методом фенольно-хлороформной экстракции по Mathew 11.

Полимеразную цепную реакцию приводили на программируемом термоциклере «Терцик «производства фирмы «ДНК-технология «(Россия).

Для обнаружения делеций применяли мультиплексную амплификацию согласно руководству, предложенному Simoni и соавт. 12 с использованием диагностического набора «AZF» («Центр Молекулярной Генетики Лаборатория ДНК-диагностики ГУ МГНЦ РАМН»).

В ходе анализа выполняли детектирование делеций в трех субрегионах AZF. Набор праймеров, использованных в данной работе, позволял исследовать 9 STS-маркеров, специфичных для AZF-локуса для субрегиона AZFa sY 86, sY 84, sY 615.

субрегиона AZFb: sY 127, sY 134.

для субрегиона AZFc: sY 254 (DAZ), sY 255 (DAZ).

Кроме того, в качестве «внутреннего» контроля на присутствие в геномной ДНК фрагментов короткого плеча Yхромосомы использовали два маркера SRY и ZFY — что позволяло выявить наличие даных локусов и определить сответствие фенотипического пола генотипическому. В качестве «внешнего положительного» контроля использовали ДНК фертильного мужчины. Результаты амплификации оценивали методом электрофореза в 7%-ном полиакриламидном геле с последующим окрашиванием в растворе бромистого этидия.

Результаты и обсуждение.

Среди 45 обследованных мужчин с бесплодием делеции локуса AZF были обнаружены у 4 (в 8,9% случаев). Микроделеции были выявлены в двух случаях у пациентов с азооспермией, что составляет 6,25% случаев для данной группы. В группе больных с олигозооспермией тяжелой степени микроделеции были обнаружены у двух больных, частота встречаемости оказалась равной 22,2%. В контрольной группе фертильных мужчин микроделеции Y — хромосомы не были определены. Во всех случаях выявлены микроделеции AZFc-локуса, что доказано дублирующими независимыми исследованиями (рис. 1).

Частота микроделеций Y-хромосомы среди мужчин с бесплодием значительно варьирует в исследованиях разных авторов (от 1% до 35%) 9, 10, 12, 14. Столь широкий разброс частот делеций обусловлен влиянием ряда факторов, среди которых наибольшее значение имеют критерии отбора пациентов для проведения микроделеционного анализа и количество исследуемых локусов STS 6, 8, 10, 12. По литературным данным, у мужчин с бесплодием частота микроделеций в AZF-локусе Y хросомы составляет в среднем 7,5% в различных популяциях мира. У пациентов с идиопатической азооспермией микроделеции обнаружены в 18% случаев, с тяжелой олигозооспермией неясного генеза — в 14,3% случаев 9. Результаты, полученные в ходе нашего исследования, не противоречат этим данным, хотя оказались несколько выше среднемирового уровня.

бесплодие генотипирование делеция хромосома Рис. 1- Генотипирование делеций в Y хромосоме (1 дорожка — делеция sY255 и sY254, 2−10 дорожки — норма, 11 — маркер молекулярного веса л/PstI)

Специфичного лечения нарушения сперматогенеза у мужчин с делециями локуса AZF в настоящее время не разработано. Обнаружение у пациента делеции позволяет избежать необоснованного гормонального или хирургического лечения. Но в то же время, у мужчин с микроделециями субрегиона AZFc Y-хромосомы не стоит отказываться от проведения сперматогенезстимулирующей терапии и лечения сопутствующей патологии репродуктивной системы, так как велика вероятность получения от них сперматозоидов, которые могли бы быть успешно использованы при ИКСИ 7.

Полученные результаты еще раз подтверждают необходимость генетического обследования, включая цитогенетическое исследование и микроделеционный анализ локусов AZF у пациентов с необструктивной азооспермией и тяжелой олигозооспермией неясного генеза, с целью установления причины бесплодия и оптимальной тактики лечения.

Учитывая высокую частоту микроделеций в AZF локусе Y хромосомы у больных с нарушением сперматогенеза из Республики Башкортостан, молекулярно-генетический скрининг локусов AZF должен быть проведен всем пациентам с бесплодием неясного генеза, которым рекомендовано экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) или ИКСИ.

1. В. Л. Быков Сперматогенез у мужчин в конце XX века (обзор литературы).// Проблемы репродукции.- 2000. № 1.

2. Гоголевский П. А., Гоголевская И. К. Y-хромосома и мужское бесплодие (обзор литературы) //Пробл. репродукции 1999.-№ 5, Т.5. с.26−34.

3. П. А. Гоголевский, А. С. Калугина, Д. А. Бондарев и др. AZFмикроделеции и мужское бесплодие // Андрология и генитальная хирургия. — 2001. № 4. — с.73−77.

1. В. М. Здановский, П. А. Гоголевский, И. К. Гоголевская Тестирование микроделеций на Y — микроделеций у пациентов с различными нарушениями сперматогенеза.// Проблемы репродукции.- 2000. — Т.6, № 6. с.56−59.

2. Ю. А. Логинова, И. И. Нагорная, С. А. Шлыкова Цитогенетическое исследование и микроделеционный анализ локусов AZF. //Проблемы репродукции. — 2000. — № 5.

3. В. Б. Черных, Л. Ф. Курило, В. А. Поляков Y-хромосома, AZF-делеции и идиопатическое бесплодие у мужчин (обзор литературы). //Проблемы репродукции.- 2001. — Т.7. № 5. с.47−58.

4. В. Б. Черных, Л. Ф. Курило, Л. В Шилейко и др. Анализ микроделеций в локусе AZF у мужчин с бесплодием: совместный опыт исследований. //Мед. Генетика.- 2003. № 8. с.367−379.

5. Calogero A.E., Garofalo M.R., D. Agata R. Factors imfluencing the variable incidence of Ychromosome microdeletions in infertile patients // Hum Reprod.- 1999. — Vol. 14, № 2. — P. 275.

6. Foresta C., Moro E., Ferlin A. Y chromosome microdeletions and alterations of spermatogenesis // Endocr. Rev. 2001. — Vol. 22, № 2. — P. 226−239.

7. Krausz C., McElreavey K. Y chromosome and male infertility // Frontiers in Biosunce — 1999. Vol.2 — P. 943−949.

8. Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in molecular biology / Ed. Walker J.M.N.Y.; Haman Press. — 1984. — P. 31−34.

9. Simoni M…, Bakker E., Eurling M. et al. Laboratory guidelines for molecular diagnosis of Ychromosomal microdeletion // Int. J. Androl. — 1999. — Vol. 22. P. 292−299.

10. Tiepolo L., Zuffardi O. Localisation of factors controlling spermatogenesis in the non fluorescent portion of the human Ychromosome long arm // Hum. Genet. — 1976. Vol.34. — P.119−124.

11. Van der Ven K., Montag M., Peschka B. et al. Combined cytogenetic and Y-chromosome microdeletion screening in males undergoing intracytoplazmic sperm injection. Mol Hum Reprod 1997; 3: 699−704.

12. WHO (1999). Руководство ВОЗ по лабораторному иследованию эякулята человека и взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью. Четвертое издание. Cambridge University Press, 1999. Пер. с англ. Р. А. Нерсесяна. Научн. ред. перевода проф. Курило Л.Ф.-М.- 2001.-143с.

13. Vogt P.H., Edelmann A., Kirsch S. et al. Human Ychromosome azoospermia factor (AZF) mapped to different subregions in Yq11 // Hum. Mol. Genet. — 1996. — Vol.- 5, № 7. — P.933−943.