Изучение механизмов присоединения НеТ-А элементов к концу хромосомы у Drosophila melanogaster

ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Гипотезы об эволюционной связи между теломерами ОгозоркИа melanogaster и теломерами, использующими теломеразу. Саузерн-блот анализ2. 2. 3. 1. Рестрикция, электрофорез и мобилизация ДНК на мембрану *. Выделение и очистка ДНК2. 2. 2. 1. Выделение ДЬЖ дрозофилы. Механизмы удлинения конца хромосомы. Сиквенс ПЦР-продуктов. Необычная структура теломер некоторых насекомых. ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ3. 1… Читать ещё >

Содержание

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
- 1. Л. Белки, контролирующие функции теломер у млекопитающих и дрожжей
  - 1. 2. Альтернативные пути удлинения теломер млекопитающих и дрожжей
  - 1. 3. Необычная структура теломер некоторых насекомых
  - 1. 4. Гипотезы об эволюционной связи между теломерами ОгозоркИа melanogaster и теломерами, использующими теломеразу
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
- 2. 1. Генетические методы
  - 2. 1. 1. Мутации и линии ВгозорНИа melanogaster, использованные в работе
  - 2. 1. 2. Генетические скрещивания
- 2. 2. Молекулярные методы
  - 2. 2. 1. Трансформация бактериальных клеток плазм идами
  - 2. 2. 2. Выделение и очистка ДНК
    - 2. 2. 2. 1. Выделение ДЬЖ дрозофилы
    - 2. 2. 2. 2. Выделение ДНК плазмид методом щелочного лизиса
    - 2. 2. 2. 3. Выделение фрагментов ДНК из геля и очистка ДНК от продуктов ферментативных реакций
  - 2. 2. 3. Саузерн-блот анализ
    - 2. 2. 3. 1. Рестрикция, электрофорез и мобилизация ДНК на мембрану *
    - 2. 2. 3. 2. Гибридизация ДНК на мембране с радиоактивными зондами
  - 2. 2. 4. Амплификация ДНК
  - 2. 4. 5. Сиквенс ПЦР-продуктов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
- 3. 1. Получение модельной системы для изучения механизмов транспозиции НеТ-А элементов на конец хромосомы >
  - 3. 1. 1. Определение минимального размера 5' области перед промотором гена уеНом', необходимого для его работы на конце хромосомы
  - 3. 1. 2. Присоединение НеТ-А элемента к концу хромосомы с терминальной терминальной делецией компенсирует делецию промотора гена -ие//о^
- 3. 2. Частота присоединений НеТ-А элементов к концу хромосомы с терминальной делецией в гене yellow зависит от генотипа линии
- 3. 3. Определение минимального размера ДНК НеТ-А элемента, необходимого для поддержания экспрессии ген yellow в щетинках
- 3. 4. Удлинение концов хромосом, несущих НеТ-А элементы
- 3. 5. Механизмы удлинения конца хромосомы
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ
- 4. 1. Транспозиции НеТ-А элементов на конец Х-хромосомы с терминальной делецией
- 4. 2. Удлинение конца хромосомы у Drosophila melanogaster может осуществляться разными способами
ВЫВОДЫ

Изучение механизмов присоединения НеТ-А элементов к концу хромосомы у Drosophila melanogaster (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

У большинства эукариот теломеры состоят из коротких повторов и удлиняются с помощью специального рибонуклеопротеинового комплекса — теломеразы (Greider, Blackburn, 1985; Blackburn, 1990,.

1992). Однако у некоторых насекомых в клетках отсутствует теломераза, а удлинение геломер происходит либо посредством генной конверсии или рекомбинации, либо в результате транспозиции мобильных элементов (Biessmann, Mason 1997). Так, у Drosophila melanogaster теломеры состоят из множественных копий мобильных элементов НеТ-А и TART, при этом НеТ-А элементы составляют 80−90% (Mason, Biessmann, 1995; Biessmann, Mason 1997). Эти мобильные элементы относятся к классу ретро-элементов без длинных концевых повторов типа LINE (Mason, Biessmann, 1995; Biessmann, Mason, 1997; Biessmann et al, 1997). Элементы НеТ-А и TART располагаются на теломерах всегда в одной ориентации — «голова-хвост» (Levis et al.,.

1993). Существующие литературные данные предполагают, что удлинение теломер дрозофилы происходит в результате транспозиции мобильных элементов (Biessmann et al., 1992а, 19 926). На основе этой гипотезы был сделан вывод, что регуляция длины теломер определяется уровнем экспрессии НеТ-А и TART мобильных элементов (Mason, Biessmann, 1995). Однако известные экспериментальные исследования по определению частоты присоединений мобильных элементов к концу хромосомы, не позволяют сделать окончательных выводов как о механизме присоединения мобильных элементов к концу хромосомы, так и об их частоте. Одной из причин является отсутствие генетических систем для анализа частоты присоединения мобильных элементов к концу хромосомы.

Основной задачей данного исследования было создание удобных генетических моделей для изучения частоты и механизмов присоединения НеТ-А элемента к концу хромосомы. Полученные результаты позволили существенно изменить общепринятую концепцию механизмов контроля длины теЛомер у Drosophila melanogaster.

выводы.

1. Впервые показано, что промотор гена yellow сохраняет свою активность, находясь на расстоянии 70 п.н. от конца хромосомы.

2. Впервые продемонстрировано, что промотор НеТ-А элемента, присоединенного З'-концом к 5'-транскрибируемой нетранслируемой области гена yellow, компенсирует делецию промотора гена yellow. Для поддержания нормальной экспрессии гена достаточно 400 п.н. от З'-конца НеТ-А элемента.

3. Доказано, что присоединения НеТ-А элементов к концу хромосомы с терминальной делецией являются настоящими транспозициями, о чем свидетельствует консервативный З'-конец присоединившегося НеТ-А элемента и наличие последовательности поли-А в месте присоединения. Частота транспозиций очень низка и сильно зависит от генотипа линии.

4. Впервые показано, что у Drosophila melanogaster удлинение конца хромосомы, несущего НеТ-А элемент, может происходить разными способами: в результате транспозиции, генной конверсии или рекомбинации.

Показать весь текст

Список литературы

Ashburner М. 1989. Drosophila: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.
Bianchi A., Smith S" Chong L., Elias P., deLange T. 1997. TRF is a dimer and bends telomeric DNA. EMBO J. V. 16. P. 1785−1794.
Biessmann H., Mason J. M. 1988. Progressive loss of DNA sequences from terminal chromosome deficiencies in Drosophila melanogaster. EMBO J. V. 7. P. 1081−1086.
Biessmann H., Carter S. В., J. M. Mason J. M. 1990a. Chromosome ends in Drosophila without telomeric DNA sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USAV. 87. P. 1758−1761.
Biessmann H., Mason J. M., Ferry K., d’Hulst M., Valgeirsdottir K., Traverse K. L., Pardue M. L. 19 906. Addition of telomere-associated HeT-A DNA sequences «heals» broken chromosome ends in Drosophila. Cell V. 61. P. 663−673.
Biessmann H., Champion L. E., O’Hare K., Ikenaga K., Kasravi В., Mason J. M. 1992a. Frequent transpositions of Drosophila melanogaster Het-A transposable elements to receding chromosome ends. EMBO J. V. 11. P. 4459−4469.
Biessmann H., K. Valgeirsdottir A., Lofsky C., Chin В., Ginther R. W., Levis M. L., Pardue. 19 926. Het-A, a transposable element specificallyinvolved in healing broken chromosome ends in Drosophila melanogaster. Mol. Cell. Biol. V. 12. P. 3910−3918.
Biessmann H., Kasravi В., Bui Т., Fujiwara G., Champion L.E., Mason J.M. 1994. Comparison of two active HeT-A retroposons of Drosophila melanogaster. Chromosoma. V. 103. P. 90−98.9. BiessmanH. 1995.
Biessmann H., Walter M. F., Mason J. M. 1997. Drosophila telomere elongation. Ciba Found Symp. V. 211. P. 53−67.
Biessmann H., Mason J. M. 1997. Telomere maintenance without telomerase. Chromosoma. V. 106. P. 63−69.
Biessmann H., Kobeski F., Walter M. F., Kasravi A., Roth C. W. 1998. DNA organization and length polymorphism at the 2L telomeric region of Anopheles gambiae. Insect Mol. Biol. V. 7. P. 83−93.
Bilaud Т., Koering C.E., Binet-Brasselet E., Ancelin K., Pollicee A., Gasser S.M., Gilson E. 1996. The telobox, a Myb-related telomeric DNA binding motif found in proteins from yeast, plants and human. Nucleic Acids Res. V. 24. P. 1294−1303.
Blackburn E.H. 1991. Structure and function of telomeres. Nature. V. 350. P. 569−573.
Blackburn E.H. 1992. Telomerases. Ann. Rev. Biochem. V. 61. P. 113 129.
Blasco M. A., Lee H. W., Hande M. P., Samper E., Lansdorp P. M., DePinho R. A., Greider C. W. 1997. Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA. Cell. V. 91. P. 25−34.
Blasco M. A., Gasser S. M., Lingner J. 1999. Telomeres and telomerase. Genes Dev. V. 13. P. 2353−2359.
Bosco G. Haber J. E. 1998. Chromosome break-induced DNA replication leads to nonreciprocal translocations and telomere capture. Genetics. V. 150. P. 1037−1047.
Boulton S.J., Jackson S.P. 1998. Components of the Ku-dependent nonhomologous end-joining pathway are involved in telomeric length maintenance and telomere silencing. EMBO J. V. 17. P. l819−1828.
Bryan Т. M., Marusic L., Bacchetti S., Namba M., Reddel R. R. 1995. Telomere elongation in immortal human cells without detectable telomerase activity. EMBO J. V. 14. P. 4240−4248.
Bryan Т. M., Englezou A., Gupta J., Bacchetti S., Reddel R. R. 1997. The telomere lengthening in telomerase-negative immortal human cells does not involve the telomerase RNA subunit. Hum. Mol. Gen. V. 6. P. 921−926.
Bryan T.M., Sperger J.M., Chapman K.B., Cech T.R. 1998. Telomerase reverse transcriptase genes identified in Tetrahymena thermophila and Oxytrichia trifallax. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 95. P. 8479−8484.
Colin M., Edstrom J. E. 1992. Telomere-associated repeats in Chironomus form discrete subfamilies generated by gene conversion. J. Mol. Evol. V. 35. P. 114−122.
Collins K., Ghandi L. 1998. The reverse transcriptase component of the Tetrahymena telomerase ribonucleoprotein complex. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 95. P. 8485- 8490.
Danilevskaya O., Lofsky A., Kurenova E.V., Pardue M.L. 1993. The Y chromosome of Drosophila melanogaster contains a distinctive subclass of ЯеГ-^-related repeats. Genetics. V. 134. P. 531−543.
Danilevskaya O., Slot F., Pavlova M., Pardue M. L. 1994. Structure of the Drosophila HeT-A transposons: a retrotransposons-like element forming telomeres. Chromosoma. V. 103. P. 215−224.
Danilevskaya O. N., I Arkhipova. R., Traverse K. L., Pardue M. L. 1997. Promoting in tandem: the promoter for telomere transposon Het-A and implications for the evolution of retroviral LTRs. Cell. V. 88. P. 647 655.
Danilevskaya O. N., Lowenhaupt K., Pardue M. L. 1998a. Conserved subfamilies of the Drosophila HeT-A telomere-specific retrotransposon. Genetics. V. 148. P. 233−242.
Danilevskaya O. N., Traverse K. L., Hogan N. C., DeBaryshe P. G., Pardue M. L. 1999. The two Drosophila telomeric transposable elements have very different patterns of transcription. Mol. Cel. Biol. V. 19. P. 873−881.
Dionne L., Wellinger R.J. 1998. Processing of telomeric DNA ends requires the passage of a replication fork. Nucleic. Acids Res. V. 26. P. 5365−5371.
Drake J. W. 1993. Rates of spontaneous mutation among RNA viruses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V 90. P. 4171−4175.
Erlich H. A. 1989. PCR technology. Stockton Press, New York, N. Y.
Fanti L., Giovinazzo G., Berloco M., Pimpinelli S. 1998. The heterochromatin protein 1 prevents telomere fusions in Drosophila. Mol. Cell. V. 2. P. 527−538.
Garvik В., Carson M., Hartwell L. 1995. Single stranded DNA arising at telomeres in cdcl3 mutants may constitute a specific signal for the RAD9 checkpoint. Mol. Cell Biol. V. 15. P. 6128−6138.
Geyer P. К., Spana С., Corces V. G. 1986. On the molecular mechanism of gy/wy-induced mutations at the yellow locus of Drosophila melanogaster. EMBO J.V. 5. P. 2657−2662.
Geyer P.K., Corces V. G. 1987. Separate regulatory elements are responsible for the complex pattern of tissue-specific and developmental transcription of the yellow locus in Drosophila melanogaster. Genes and Dev. V. 1. P. 996−1004.
Greenberg R.A., AllsoppR.C., Chin L., Morin G.B., DePinho R.A. 1998. Expression of mouse telomerase reverse transcriptase during development, differentiation, and proliferation. Oncogene. V. 19. P. 1723−1730.
Greider C.W., Blackburn E.H. 1985. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell. V. 43. P. 405 413.
Greider C.W., Blackburn E.H. 1987. The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity. Cell. V. 51. P. 887−898.
Greider C.W., Blackburn E.H. 1989. A telomeric sequence in the RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis. Nature. V. 337. P. 331−337.
Greider C. W. 1996. Telomere length regulation. Ann. Rev. Biochem. V. 65. P. 337−365.
Greider С. W. 1998. Telomerase activity, cell proliferation, and cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 95. P. 90−92.
Greider C.W. 1999. Telomeres do D-loop-T-loop. Cell. V. 97. P. 419 422.
Griffith J.D., Comeau L., Rosenfield S., Stansel R.M., Bianchi A., Moss H., deLange T. 1999. Mammalian telomeres end in a large duplex loop. Cell. V. 97. P. 503−514.
Haber J.E. 1999. DNA repair. Gatekeepers of recombination. Nature. V. 398. P.665−667.
Kamnert I., Nielsen L., Edstrom J-E. 1998. A conceitedly evolving region in Chironomus, unique within the telomere. J Mol. Evol. V. 46. P. 562−570.
Krauskopf A., Blackburn E.H. 1996. Control of telomere growth by inretactions of RAP1 with the most distal telomeric repeats. Nature. V. 383. P. 354−357.
Kirk K.E., Harmon B. P., Reichardt I.K., Sedat J.W., Blackburn E.H. 1997. Blok in anaphase chromosome separation caused by a telomerase template mutation. Science. V. 275. P. 1478−1481.
Lendvay T.S., Morris D.K., Sah J., Balasubramnian В., Lundblad V. 1996. Senescence mutants of Saccharomyces cerevisiae with a defect in telomere replication identify three additional EST genes. Genetics. V. 144. P. 1399- 1412.
Levis R. W. 1989. Viable deletions of a telomere from a Drosophila chromosome. Cell. V. 58. P. 791−801.
Levis R. W., Ganesan R., Houtchens K., Tolar L. A., Sheen F.-M. 1993. Transposons in place of telomere repeats at a Drosophila telomere. Cell. V. 75. P. 1083−1093.
Li В., Lustig A. J. 1996. A novel mechanism for telomere size control in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. V. 10. P. 1310−1326.
Lin J.-J., Zakian V.A. 1996. The Saccharomyces CDC13 protein is a single-strand TG1−3 telomeric DNA-binding protein in vitro that affects telomere behavior in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 93. 1 376 013 756.
Lindsley D. L., Zimm G. G. 1992. The Genome of Drosophila melanogaster. Academic Press, New York.
Linger J., Cech T.R. 1996. Purification of telomerase from Euplotes aediculatus: requirement of a primer 3' overhang. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 93. P. 10 712−10 717.
Linger J., Hughes T.R., Shevchenko A., Mann M., Lundblad V., Cech T.R. 1997. Reverse transcriptase motif in the catalytic subunit of telomerase. Science. V. 2276. P. 561−567.
Lopez С. C., Neilsen L., Edstrom J.-E. 1996. Terminal long tandem repeats in chromosomes from Chironomus pallidivittatus. Mol. Cel. Biol. V. 16. P. 285−3290.
Luan D.D., Korman M.H., Jakubczak J.L., Eickbush Т.Н. 1993. Reverse transcription of R2Bm RNA is primed by a nick at the chromosomal target site: a mechanism for non-LTR retrotransposition. Cell. V. 72. P. 592−605.
Lundblad V., Blackburn E.H. 1993. An alternative pathway for yeast telomere maintenance rescues est Г senescence. Cell. V. 73. P. 347−360.
Lundblad V., Szostak J.W. 1989. A mutant with a defect in telomere elongation leads to senescence in yeast. Cell. V. 57. P. 633−643.
Martin M., Y Meng. В., Chia W. 1989. Regulatory elements involved in the tissue-specific expression of the yellow gene of Drosophila. Mol. Gen. Genet. V. 218. P. 118−126.
Mason J. M., Biessmann H. 1995. The unusual telomeres of Drosophila. Trends Genet.V. 11. P. 58−62.
McEachern M. J., Blackburn E. H. 1995. Runway telomere elongation caused by telomerase RNA gene mutations. Nature. V. 376. P. 403−409.
McEachern M. J., Blackburn E. H. 1996. Cap-prevented recombination between terminal telomeric repeat arrays (telomere CPR) maintains telomeres in Kluyveromyces lactis lacking telomerase. Genes Dev. V. 10. P. 1822−1834.
Mikhailovsky S., Belenkaya Т., Georgiev P. 1999. Broken chromosome ends can be elongated by conversion in Drosophila melanogaster. Chromosoma. V. 108. P. 114−120.
Nakamura T.M., Morin G.B., Chapman K.B., Weinrich S.L., Andrews W.H., Linger J., Harley C.B., Cech T.R. 1997. Telomerase catalytic subunit homologues from fission yeast and human. Science.V. 277. P. 955−959.
Nugent C.I., Hughes T.R., Lue N.F., Lundblad V. 1996. Cdcl3p: a single-strand telomeric DNA-binding protein with a dual role in yeast telomere maintenance. Science. V. 274. P. 2249−252.
Nugent C.I., Lundblad V. 1998. The telomerase reverse transcriptase: components and regulation. Genes Dev. V. 12. P. 1073−1085.
Nugent C.L., Bosco G., Ross L.O., Evans S.K., Salinger A.P., Moore J.K., Haber J.E., Lundblad V. 1998. Telomere maintenance is dependent on activities required for end repair of double-strand breaks. Curr. Biol. V. 8. P. 657−660.
Pardue M. L., Danilevskaya O. N., Lowenhaupt K., Slot F., Traverse K.L. 1996a. Drosophila telomeres: new views on chromosome evolution. Trends Genet. V. 12. P. 48−52.
Pardue M. L., Danilevskaya О. N., Lowenhaupt K., Wong J., Erby K. 19 966. The gag coding region of the Drosophila telomeric retrotransposon, HeT-A, has an internal frame shift and a length polymorphic region. J. Mol. Evol. V. 43. P. 572−583.
Pardue M. L., Danilevskaya O. N., Traverse K. L., Lowenhaupt K. 1997. Evolutionary links between telomeres and transposable elements. Genetica. V. 100. P. 73−84.
Pardue M. L., DeBaryshe P. G. 1999. Telomeres and telomerase: more than the end of the line. Chromosoma. V. 108. P. 73−82.
Price C.M. 1999. Telomeres and telomerase: broad effects on cell growth. Curr Opin Genet Dev. Curr. Opin. Genet. Dev. V. 9. P. 218−224.
Pluta A. F., Zakian V. A. 1989. Recombination occurs during telomere formation in yeast. Nature. V. 337. P. 429−433.
Roth C. W., Kobeski F., Walter M. F., Biessmann H. 1997. Chromosome end elongation by recombination in the Mosquito Anopheles gambiae. Mol. Cel. Biol. V. 17. P. 5176−5183.
Sandel L.L., Zakian V.A. 1993. Loss of a yeasr telomerase: arrest, recovery, and chromosome loss. Cell. V. 75. P. 72 229−739.
Sheen F. M., Levis R. W. 1994. Transposition of the LINE-like retrotransposon TART to Drosophila chromosome termini. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 91. P. 12 510−12 514.
Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a Laboratory Manual. Ed2 Cold Spring Harbor Laboratory Cold Spring Harbor NY.
Shippen-Lentz D., Blackburn E.H. 1990. Science. V. 247. P. 546−552.
Van Steensel В., deLange T. 1997. Control of telomere length by the human telomere protein TRF1. Nature. V. 385. P. 740−743.
Stoppler H., Hartmann D. P., Sherman L., Schlegel R. 1997. The human papilloma virus type 16 E6 and E7 oncoproteins dissociate cellular telomerase activity from the maintenance of telomere length. J. Biol. Chem. V. 272. P. 13 332−13 337.
Strahl C., Blackburn E. H. 1996. Effects of reverse transcriptase inhibitors on telomere length and telomerase activity in two immortalized human cell lines. Mol. Cell. Biol. V. 16. P. 53−65.
Traverse K. L., Pardue M. L. 1988. A spontaneously opened ring chromosome of Drosophila melanogaster has acquired He-T DNA sequences at both new telomeres. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 85. P. 8116−8120.
Wang S. S., Zakian V. A. 1990. Telomere-telomere recombination provides an express pathway for telomere acquisition. Nature. V. 345. P. 456−458.
Yu G.L., Bradley J.D., Attardi L.D., Blackburn E.H. 1990. In vivo alteration of telomere sequences and senescence caused by mutated Tetrahymena telomerase RNAs. Nature. V. 344. P. 126−132.

Заполнить форму текущей работой