Экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы и декорина в нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека

Министерство образования и науки Российской Федерации Новосибирский Государственный Университет Факультет естественных наук Кафедра: Молекулярной Биологии Дипломная работа Экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы и декорина в нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека Ещенко Татьяна Юрьевна Научный руководитель К.б.н. Григорьева Эльвира Витальевна Новосибирск 2010.

Список сокращений

ПГпротеогликаны

ГАГгликозаминогликаны

GlcNглюкозамин

GalNгалактозамин

GlcUAглюкуроновая кислота

IdoUAидуроновая кислота

ХСхондроитинсульфат

ДС-дерматансульфат

ГСгепарансульфат

ДСПГдерматансульфат протеогликан

ПЦР — полимеразная цепная реакция

Введение

На сегодняшний день одной из основных проблем клеточной биологии является изучение регуляции клеточной пролиферации. На данный момент открыто множество биологических молекул, которые участвуют в процессах злокачественной трансформации. Одной из таких молекул является декорин — лейцин-богатая молекула дерматансульфат протеогликана, состоящая из белкового кора и несущая на себе одну цепь дерматансульфата. В последние годы активно ведутся исследования декорина. Показано, что декорин подавляет клеточную пролиферацию, показаны механизмы его антимитотического действия — через усиление экспрессии р21 белка, супрессии циклина и подавлении активности циклин зависимых киназ.

Добавление декорина в культуру опухолевых клеток приводило к возвращению опухолевых клеток к нормальному фенотипу, введение генно-инженерных конструкций содержащих ген декорина в экспериментально растущую опухоль приводило к значительному замедлению роста опухоли, что позволило отнести декорин к перспективным антиопухолевым агентам.

Известно, что в опухолевых клетках происходит снижение экспрессии и содержания декорина. Однако причина этого до сих пор остается неизвестной.

Нами было высказано предположение, что происходит изменение в процессе биосинтеза декорина. Известно, что ключевым ферментом биосинтеза дерматансульфат протеогликанов (в том числе и декорина) является D-глюкуронил С5-эпимераза — фермент, который осуществляет модификацию углеродной цепи хондроитинсульфата в дерматансульфат. Возможно, что происходит нарушение экспрессии либо активности этого фермента, что приводит к нарушению структуры и состава протеогликанов в опухолевых клетках.

Основной проблемой в изучении данного вопроса является то, что ген D-глюкуронил С5-эпимеразы до сих пор не клонирован и ранее работы с этим геном не проводились. Однако после окончания секвенирования генома человека методом компьютерного анализа была обнаружена последовательность ДНК, гомологичная гену D-глюкуронил С5-эпимеразы мыши. Это позволило начать нам начать работу по изучению экспрессии человеческого гомолога мышиной D-глюкуронил С5-эпимеразы и ее корреляции с экспрессией гена декорина в опухолевой ткани молочной железы человека.

Таким образом, целью данной работы являлось: установление взаимосвязи между экспрессией гена D-глюкуронил С5-эпимеразы и гена декорина в нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека.

В соответствии с целью, были поставлены следующие задачи:

1. Провести компьютерный анализ последовательности ДНК, гомологичной гену D-глюкуронил С5-эпимеразы животных и подобрать праймеры для человеческого гомолога мышиного гена D-глюкуронил С5-эпимеразы.

2. Оценить уровень экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в клинических образцах нормальной ткани молочной железы человека.

3. Провести сравнительный анализ экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека.

4. Определить уровень экспрессии гена декорина в тех же самых клинических образцах контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека.

5. Проверить наличие взаимосвязи исследованных параметров (экспрессию гена D-глюкуронил С5-эпимеразы и экспрессию гена декорина в опухоли) между собой и сопоставить с клиническими диагнозами пациентов.

Глава 1. Литературный обзор

1.1 Протеогликаны

Протеогликаны — это сложные белково-углеводные молекулы, состоящие из корового белка и присоединенных к нему одной или несколько цепей гликозаминогликанов.

1.1.1 Строение и классификация гликозаминогликанов

Молекулы гликозаминогликанов (ГАГ) представляют собой неразветвленные углеводные цепи с характерными повторяющимися дисахаридными единицами, которые включают в себя гексозамин (Dглюкозамин или D-галактозамин) и уроновую кислоту (D-глюкуроновую или L-идуроновую), присутствующую во всех ГАГ, за исключением кератансульфата, где она замещена остатками галактозы (рис.2).

В зависимости от гексозамина, входящего в состав углеводной цепи гликозаминогликана, выделяют следующие основные классы гликозаминогликанов: гиалуроновая кислота (ГК), гепарансульфаты/гепарин (ГС/Ге), хондроитинсульфаты (ХС), дерматансульфаты (ДС), кератансульфаты (КС) (рис. 2).

Если в состав ГАГ входит глюкозамин, то углеводную цепь относят к классу ГС/ Ге, если в состав входит галактозамин, то углеводную цепь ГАГ относят к классу ГС/ ДС [1].

Глюкуроновая кислота в гепарансульфатах и дерматансульфатах может быть эпимеризована в идуроновую кислоту под действием фермента D-глюкуронил С5-эпимеразы (рис. 3). Степень эпимеризации варьирует в различных тканях и зависит от структуры корового белка [2].

Хондроитинсульфат Дерматансульфат.

Рис. 3. Эпимеризация глюкуроновой кислоты в идуроновую кислоту.

Посттрансляционная модификация ГАГ заключается не только в эпимеризации остатков уроновых кислот, но и в последующем специфическом присоединении отрицательно-заряженных групп SO42- и СOO -. За исключением гиалуроновой кислоты все ГАГ в различной степени могут быть О-сульфатированы (рис. 4), а гепарин и гепарансульфат кроме того могут содержать N-сульфатированные группы в остатках глюкозамина [1].

Степень сульфатирования ГАГ намного выше, чем других макромолекул и достигает 3−4 сульфатных групп на дисахарид.

Благодаря сульфатным и карбоксильным группам ГАГ имеют очень высокую плотность отрицательного заряда, что во многом определяет их биологические свойства и регулирует их взаимодействие с другими молекулами.

1.1.2 Биосинтез протеогликанов

Биосинтез и распад гликозаминогликанов (ГАГ) осуществляются при участии высокоспецифичных ферментов — гликозилтрансфераз и гликозидаз (сульфатаз) в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР) и аппарате Гольджи.

Биосинтез ПГ начинается с синтеза тетрасахаридного связывающего участка и последующей полимеризации ГАГ цепи (рис. 5).

Основные ферменты, участвующие в синтезе тетрасахарида, указаны в Табл.1.

Табл. 1. Основные ферменты синтеза тетрасахаридного сязывающего региона.

Синтез протеогликанов начинается в ЭПР переносом ксилозы от UDP-ксилозы на остаток серина корового белка, осуществляемое ферментом О-ксилозилтрансферазой (XylT) [3]. Последующее добавление двух галактозных остатков, производимое двумя различными галактозилтрансферазами (GalT-I, GalT-II) происходит в начальных/средних отделах аппарата Гольджи. В качестве донора галактозных остатков используется UDP-галактоза. Одна галактозилтрансфераза образует в-1,3-, а другая— в -1,4-гликозидную связь[4]. Затем присоединяется глюкуроновая кислота при помощи фермента глюкуронилтрансферазы-1 (GlcAT-I), которая завершает синтез тетрасахаридного связывающего участка (Xyl-Gal-Gal-GluAU)[4].

Дальнейший синтез заключается в последовательном присоединении уроновой кислоты и гликозамина/галактозамина [5].

Табл. 2. Основные ферменты биосинтеза протеогликанов.

Элонгация тетрасахарида начинается с добавления GalNAc ферментом галактозилтрансферазой (вGalNAcT-I), затем в биосинтез включается фермент глюкуронозил-трансфераза, которая присоединяет остаток глюкуроновой кислоты.

После завершения синтеза углеводной цепи происходит ее модификация — эпимеризация глюкуроновой кислоты, проводимая ферментом Dглюкуронил С5-эпимеразой (С5-EPI) и сульфатирование/деацетилирование, проводимое ферментом N-деацетилаза/сульфатаза. Затем сульфотрансферазы проводят сульфатирование по различным положениям (см. Табл. 2) [6].

Таким образом, образуются полностью модифицированные зрелые молекулы протеогликанов, которые транспортируются к месту назначения.

1.1.3 Локализация и функции протеогликанов

Практически все клетки продуцируют протеогликаны (ПГ), которые затем могут транспортироваться в ВКМ, встраиваться в плазматические мембраны или оставаться в секреторных гранулах.

Протеогликаны внеклеточного матрикса (ВКМ) в основном содержат ДС/ХС цепи ГАГ[7], тогда как ПГ на поверхности клеток в основном представлены ГС [8].

Протеогликаны в ВКМ формируют его структуру за счет взаимодействия с различными внеклеточными макромолекулами. Известно, что во внеклеточном матриксе протеогликаны взаимодействуют с ламинином, фибронектином [9], коллагеном I [10]. Известно, что декорин связывается с коллагеном I, II [11], IX [12] причем как в эмбриональных тканях, так и в тканях взрослого человека [12]. Фибромодулин, так же как и декорин, связывается с коллагеном I и II и влияет на их фибриллогенез [13], тогда как бигликан коллаген не связывает, но его большое количество было обнаружено во внеклеточном матриксе мезенхимальных эмбриональных клеток [12].

Показано, что аггрекан в суставных хондроцитах быка образует комплекс с гиалуроновой кислотой и связывающим белком [14], кроме того, подобный комплекс может образовывать и другой ПГверсикан [15]. Показано, что молекула версикана из культуры клеток ACHN взаимодействует с хемокинами [16], Lселектином [17], Р-селектином, рецептором CD 44 (рецептор CD 44 играет важную роль в процессах воспаления, аутоиммунном ответе, прогрессии опухолей). Связь образуется посредством взаимодействия ХС цепи версикана с углеводсвязывающим доменом L-, P-селектина, CD44 [18].

Протеогликаны поверхности клеток представляют собой рецепторы для различных компонентов ВКМ, регуляторных макромолекул, факторов роста и играют ключевую роль в информационной связи между клеткой и ВКМ.

На поверхности кератиноцитов обнаружен и идентифицирован эпикан — гепарансульфат протеогликан [19], после секвенирования его корового белка, было обнаружено, что он является протеогликановой формой рецептора CD44 [20]. Показано, что это альтернативно сплайсированная форма корового белка CD44, содержащая дополнительный экзон [21].

Показано, что ПГ могут связывать факторы роста и регулировать их активность.

Декорин, относящийся к классу дерматансульфат протеогликанов (ДСПГ), взаимодействует с рецептором эпидермального фактора роста и запускает сигнальный каскад реакций, который приводит к торможению деления клеток [22]. Бетагликан — ПГ, содержащий ХС и ГС, цепи взаимодействует (как и декорин) с трансформирующим фактором роста (TGFв) [23].

Гепарансульфат протеогликаны (например, синдекан) связывают различные факторы роста, включая фактор роста фибробластовbFGF, aFGF, гранулоцитомакрофаг колониестимулирующий фактор (GM-CSF), взаимодействуют с интерлейкином 3 и интерфероном г [7], усиливают рост и дифференцировку клетки, взаимодействуя с bFGF [24], показан предположительный механизм связывания рецептора bFGF с ГС [25].

Таким образом, протеогликаны являются очень активными молекулами, они выполняют жизненно важные функции в клетке.

1.2 Состав протеогликанов в трансформированных клетках

Известно, что в опухолевых клетках состав протеогликанов изменяется. Показано, что в клетках практически всех исследованных опухолевых тканей происходит увеличение содержания протеогликанов по сравнению с нормальной тканью: в опухолевых клетках карциномы желудка происходит увеличение содержания ПГ по сравнению с нормальной тканью в два раза [26], в карциноме поджелудочной железы в 4 раза [27], в карциноме прямой кишки — в 2 раза [28].

В опухолевых клетках происходит снижение сульфатирования ГАГ — в клетках карциномы желудка в 10 раз увеличивается содержание несульфатированных дисахаридных единиц, однако происходит увеличение сульфатирования ХС и ДС цепей по 6-сульфо-положению в 4 раза [26]. В клетках аденокарциномы кишечника увеличивается число несульфатированных единиц в 3 раза, в 3 раза уменьшается количество 4-сульфатированных единиц, увеличивается в 5 раз количество дисахаридных единиц, сульфатированных по 6-положению [29].

Показано, что изменяется структура ПГ в опухолевых клетках — в лейомиоме количество остатков L-идуроновой кислоты в уменьшается по сравнению с нормой с 55% до 45% [32].

Для многих опухолей показано изменение соотношения ДС и ХС. В карциноме желудка увеличивается содержание ХС по сравнению с нормой в 4 раза [26], в карциноме поджелудочной железы содержание ХС увеличивается в 22 раза [27], в клетках карциномы гортани — в 5 раз [30], в аденокарциноме кишечника — в 11 раз [29]. Для опухоли прямой кишки показано, что содержание хондроитинсульфатов увеличивается с 27% до 70% [28], в карциноме молочной железы содержание ХС увеличивается на 32,2% [31].

Наряду с увеличением хондроитинсульфатов происходит снижение содержания дерматансульфатов, характерных для непролиферирующих тканей.

Для опухоли прямой кишки показано, что содержание дерматансульфатов падает с 73% до 30% [28], в карциноме молочной железы содержание ДС падает на 18,5% [31]. Лучше всего изменения показаны для ДСПГ декорина.

1.2.1 Декорин

Декорин — сложная молекула, относящаяся классу протеогликанов, которая состоит из белкового кора и несет на себе одну цепь дерматансульфата.

Было показано, что он участвует в целом ряде механизмов, регулирующих пролиферацию клеток, декорин:

· взаимодействует с рецептором эпидермального фактора роста [33] (EGFR) и запускает сигнальный каскад, приводящий к увеличению экспрессии р21 белка, что приводит к супрессии циклина, подавлению активности циклин зависимых киназ [34] и торможению клеточного деления [35],.

· ингибирует биологическую активность фактора роста TGFb [36]. TGFb может влиять на рост опухоли, опосредовать устойчивость к лекарствам, усиливать ангиогенез в опухоли [37]. Декорин присоединяется к связывающему домену TGFb, предотвращая его связывание с рецептором, что приводит к торможению клеточного деления [38],.

· подавляет экспрессию и биосинтез эндотелиального фактора роста сосудов (VEGF), что приводит к супрессии ангиогенеза в опухолевой ткани [39],.

· вызывает функциональную инактивацию онкогенного белка ErbB2, ингибируя тем самым рост клеток и стимулируя их цитодифференцировку [38],.

· влияет на жизнеспособность клеток через Akt/протеинкиназа В-зависимый и — независимый механизмы, снижая апоптоз эндотелиальных клеток [40].

Для декорина доказана антимитотическая активностьдобавление рекомбинантного декорина в культуру опухолевых клеток ингибировало их рост in vitro [41], экспрессия декорина de novo в культуре опухолевых клеток приводила к их возвращению к нормальному фенотипу [42]. Аденовирусная доставка декорина в растущую экспериментальную опухоль приводила к значительному ингибированию роста опухоли [43].

При проведении описанных экспериментов их целью являлось введение в опухолевую ткань недостающего декорина в той или иной форме (рекомбинантного белка либо генно-инженерных конструкций).

Однако вопрос о причине снижения содержания декорина в трансформированных клетках до сих пор не поднимался.

1.3 D-глюкуронил С5-эпимераза

Известно, что ключевым ферментом биосинтеза дерматансульфат протеогликанов (и в том числе декорина) является фермент D-глюкуронил С5-эпимераза [44]. Этот фермент проводит эпимеризацию глюкуроновой кислоты в идуроновую с образованием функционально активного декорина, причем в экспериментах in vitro было показано, что этот процесс может быть обратимым [45], однако, после полной модификации ГАГ цепи обратная реакция невозможна [46].

Показана субстратная специфичность для D-глюкуронил С5-эпимеразы, выделенной из культуры клеток фибробластов — дерматан и хондроитин являются хорошими субстратами для этого фермента, тогда как их О-сульфатированные формы практически не подвергаются модификации [47]. По всей видимости, эпимеризация уроновой кислоты в идуроновую происходит до О-сульфатирования ГАГ и О-сульфатированные ГАГ не являются субстратом для D-глюкуронил С5-эпимеразы [48].

Известно, что для работы D-глюкуронил С5-эпимеразы мыши необходимы N-ацетильные группы на глюкозамине и определенное расположение N-сульфатных групп. Кроме того, существует прямая зависимость работы фермента от размера субстрата [49].

Хотя биосинтез протеогликанов изучен достаточно хорошо, и все ферменты биосинтеза клонированы, D-глюкуронил С5-эпимераза является единственным ферментом биосинтеза протеогликанов человека, которых до сих пор не клонирован.

В настоящее время клонированы и охарактеризованы гены D-глюкуронил С5-эпимеразы быка [50] и мыши [51] - единственный ген D-глюкуронил С5-эпимеразы мыши находится в 9 хромосоме. Показано, что мышиная D-глюкуронил С5-эпимераза приблизительно одинаково экспрессируется в различных тканяхсердце, мозг, легкие, печень, мышцы, почкиза исключением селезенки, в которой экспрессия D-глюкуронил С5-эпимеразы понижена [51].

Показано, что разрушение гена, кодирующего D-глюкуронил С5-эпимеразу у мыши, приводило к гибели эмбриона (гетерозиготы погибали в течение года, гомозиготы по мутантному генотипу погибали сразу после рождения), у эмбрионов были обнаружены дефекты развития почек, легких, и неправильное формирование скелета, другие жизненно важные органы выглядели нормальными, включая мозг, печень, желудочно-кишечный тракт, кожу. Оказалось, что присутствие идуроновой кислоты необходимо для нормального развития почек, легких, скелета [52]. Также показано, что наличие ГС, содержащих остатки идуроновой кислоты необходимо для нормального развития различных типов нейронов [53].

Отсутствие других публикаций по данному вопросу не позволяет сказать, есть ли какая-либо тканеили видоспецифичность в экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы у человека и одинаковы ли экспрессия/активность этого фермента в нормальных и опухолевых тканях, существует ли связь между изменением состава ПГ и изменением экспрессии/активности D-глюкуронил С5-эпимеразы.

Данная работа посвящена исследованию взаимосвязи экспрессии декорина и D-глюкуронил С5-эпимеразы в клинических образцах нормальной и опухолевой ткани молочной железы человека.

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Материалы

В работе были использованы следующие материалы и реактивы:

этиловый спирт, фенол, хлорид калия, хлорид натрия, хлороформ, изопропиловый спирт, уксусная, соляная, кислоты — отечественного производства категории ОСЧ.

Трис, SDS (додецилсульфат натрия), агароза, борная кислота — «ICN» (США).

Хлорид магния, ацетат натрия, этидий бромистый- «Merсk» (Германия).

EDTA, агароза, красители бромфеноловый синий, ксиленцианол — «Serva» (Германия).

Taq-ДНК-полимераза -«Лаборатория Медиген» (Россия, Новосибирск) Обратная трансриптаза (M-MLV RT), ДНКаза (RQ1 RNAse free) -«Promega» (США) Реагент «Trizol» — «Invitrogen» (США).

tРНК дрожжей — «Sigma», (США) нуклеозидтрифосфаты — «Sibenzyme» (Россия, Новосибирск).

2.1.1 Операционный материал

В работе использовали ткань опухоли и нормальной молочной железы человека, удаленные в ходе хирургического вмешательства. Операционный материал получали в 1 Городской клинической больнице, забор образцов проводили под контролем главного онколога г. Новосибирска д. м. н., проф. Сидорова С. В.

2.1.2 Праймеры

Для полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовались праймеры, синтезированные в компании «Лаборатория Медиген», Новосибирск.

Праймеры для человеческого гомолога гена мышиной D-глюкуронил С5-эпимеразы (GI:29 740 243), для гена декорина человека (NM001920,GI:19 743 844), гена в-актина человека, гена GAPDH (NM_2 046.2, GI:7 669 491).

2.2 Методы

2.2.1 Выделение РНК

Выделение РНК фенольным методом.

Кусочек ткани растирали в ступке, постоянно добавляя азот. В стеклянный гомогенизатор добавляли 0,8 мл водонасыщенного фенола и 0,4 мл следующего раствора: 1,5% SDS, 50 мМ NaAc (рН 4,0). Помещали туда порошок замороженной ткани и тщательно гомогенизировали. Гомогенат переносили в чистую пробирку Eppendorf на 1,5 мл и добавляли в неё же 100мкл хлороформа. Интенсивно перемешивали и инкубировали на льду 10 мин. Центрифугировали 15 мин на Eppendorf 5415D, при 12006g. Аккуратно переносили водную (верхнюю) фазу в чистую пробирку Eppendorf на 1,5 мл. К отобранной фазе добавляли равный объём смеси водонасыщенного фенола с хлороформом (1:1) (на 250мкл водной фазы 125мкл фенола и 125мкл хлороформа). Интенсивно перемешивали. Центрифугировали 15 мин на Eppendorf 5415D, при 12006g. Переносили водную (верхнюю) фазу в чистую пробирку Eppendorf на 1,5 мл, опять стараясь не захватыватить интерфазу. К отобранной фазе добавляли 1% tРНК дрожжей (10мг/мкл) (соосадитель) и перемешивали. Добавляли 2,5 объёма 96% этилового спирта. Перемешивали и инкубировали на -200С в течение 30 мин. Центрифугировали 15 мин, на Eppendorf 5415D, при 12006g. Образовавшийся осадок промывали 400мкл 70% этилового спирта. Сушили осадок 15мин на 370С. Растворяли осадок в 40мкл воды в течение 20мин при комнатной температуре.

Выделение РНК с помощью реактива TRIZOL.

Кусочек ткани 50−100 мг растирали в ступке с 1мл реактива TRIZOL. Переносили в стеклянный гомогенизатор и тщательно гомогенизировали. Переносили гомогенат в чистую пробирку Eppendorf и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Добавляли 0,2 мкл хлороформа (на 1 мл исходного реактива TRIZOL). Инкубировали в течение 3 мин при комнатной температуре. Центрифугировали образцы при 12,000 g в течение 15 мин. После центрифугирования смесь разделилась на нижнюю (красную) фенол-хлороформную фазу, интерфазу, и неокрашенную верхнюю водную фазу. РНК оставалась в верхней водной фазе. Переносили водную фазу в чистую пробирку Eppendorf и добавляли 0,5 мл изопропанола (на 1 мл исходного реактива TRIZOL). Инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре и центрифугировали 12,000 g в течение 10 мин. Образовавшийся осадок промывали 75% этиловым спиртом. Тщательно перемешивали и центрифугировали 7,5 g в течение 5 мин. Высушивали осадок, растворяли в 40 мкл воды и инкубировали при 55оС в течение 10 мин.

глюкуронил эпимераза опухолевый клетка.

2.2.2 Очистка РНК от ДНК

Переосаждение с помощью LiCl.

К 40мкл раствора выделенной РНК добавляли 20мкл раствора 8 М LiCl, перемешивали и инкубировали на льду 30 мин. Центрифугировали 15 мин, на Eppendorf 5415D, при 12006g и аккуратно удаляли супернатант.

Сразу же добавляли к осадку 200мкл предварительно охлаждённого 80% этилового спирта. Аккуратно удаляли спирт. Осадок сушили 15мин на 370С. Растворяли осадок в 40мкл воды.

Очистка с помощью ДНКазы.

Добавляли к 40 мкл выделенного раствора РНК 1 ед. акт. ДНКазы и соответствующий буфер, доводили до объема 100мкл. Инкубировали при 37оС в течение 30 мин. Добавляли 100 мкл фенола, перемешивали. Добавляли 40 мкл хлороформа центрифугировали 5 мин 7,5 тыс g. Переносили водную фазу в чистую пробирку, добавляли 100 мкл изопропанола. Инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре, центрифугировали при 12,000 g в течение 10 мин. Образовавшийся осадок промывали 200 мкл 75% этилового спирта и центрифугировали 7,5 g в течение 5 мин. Высушивали осадок, растворяли в 40мкл воды и инкубировали при 55оС в течение 10 мин.

2.2.3 Проверка чистоты выделенной РНК на содержание примеси ДНК

Проводили ПЦР реакцию с выделенной РНК и праймером для в-актина. Поскольку фермент Taq-ДНК-полимераза не работает с матрицы РНК, реакция не должна проходить.

ПЦР проводили в буфере, содержащем 10 мМ Tris-HCl, 1,5 мМ MgCl2, 50 мМ KCl, pH 8,3 на амплификаторе «Терцик» (Компания «ДНК Технологии», Россия). Обьем реакционной смеси составлял 20 мкл, с содержанием ~100 нг геномной ДНК, 2 мкл 10x ПЦР-буфера, 20 пмоль праймера, 0,2 ммоль каждого дезоксинуклеотидтрифосфата и 1 ед. акт. Taq-ДНК-полимеразы. Реакционную смесь покрывали равным объёмом минерального масла. ПЦР проводили при следующих условиях: начальная денатурация 3 мин при 95 оС, далее 27 циклов при следующих условиях: денатурация 7 мин при 95,0оС, отжиг праймеров 15 сек при 55,0оС, элонгация 3 сек при 72,0оС.

2.2.4 ОТ-ПЦР

Обратная транскрипция.

К 2 мкг выделенной РНК добавляли 10 пмоль праймеров (OligodT или случайные гексануклеотидные праймеры), инкубировали 5 минут при 70оС, охлаждали на льду в течение 1 мин, встряхивали. Далее добавляли в строгой последовательности: 5 мкл буфера для обратной транскрипции, 0,5 ммоль каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 200 ед. акт. обратной транскриптазы M-MTLV, доводили водой до 25 мкл. Инкубировали 1ч при 37оС.

Амплификация фрагмента гена методом ПЦР.

Амплификацию фрагментов генов, D-глюкуронил С5-эпимеразы, декорина, синдекана, люмикана, глипикана, аггрекана, GAPDH и в-актина проводили методом ПЦР на амплификаторе Терцик (Компания «ДНК Технологии», Россия). Объем реакционной смеси составлял 20мкл, с добавлением ~200нг кДНК, 2 мкл 10x ПЦР-буфера (10 мМ Tris-HCl, 1,5 мМ MgCl2, 50 мМ KCl, pH 8,3), 20 пмоль каждого праймера, 0,2 ммоль каждого дезоксинуклеозидтрифосфата и 1 ед.акт. Taq-ДНК-полимеразы. Реакционную смесь покрывали равным объёмом минерального масла. ПЦР проводили при следующих условиях: начальная денатурация 5 мин при 95 оС, далее 32 цикла при следующих условиях: денатурация 30 сек при 95,0оС, отжиг праймеров 30 сек при 55,0оС, элонгация 60 сек при 72,0оС, 10 мин при 72,0оС. ПЦР-продукты анализировали методом горизонтального гель-электрофореза в агарозном геле.

2.2.5 Мультиплексная ПЦР

Мультиплексная ПЦР отличается от обычной ПЦР тем, что в реакционную смесь добавляется сразу две пары праймеров — праймеры для исследуемого гена и праймеры для гена домашнего хозяйства. Преимущество этого метода состоит в том, что амплификация проводится в одной пробирке и, следовательно, в одинаковых условиях.

Методом мультиплексной ПЦР проводили амплификацию фрагментов гена D-глюкуронил С5-эпимеразы и декорина. В качестве контрольного гена использовался ген GAPDH.

Для гена декорина течение двух циклов проводили амплификацию с праймерами для гена декорина, после чего в реакционную смесь добавлялись праймеры для гена GAPDH и далее проводили еще 18 циклов амплификации. Для гена эпимеразы, проводилось амплификация в течение 17 циклов, после чего в реакционную смесь добавлялись праймеры для GAPDH и проводилось еще 16 циклов амплификации. Амплификация проводилась при следующих условиях: денатурация 30 сек при 95,0оС, отжиг праймеров 30 сек при 55,0оС, элонгация 60 сек при 72,0оС Анализ продуктов ПЦР проводили методом горизонтального гель-электрофореза в агарозном геле.

2.2.6 Горизонтальный электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле

Анализ продуктов ПЦР проводили методом горизонтального гель-электрофореза в 0,9% агарозном геле в буфере ТАЕ (0.04 М Tris-HCl, 0,05 М EDTA, pH 8,0) с содержанием 1 мкг/мл бромистого этидия. Проводили электрофорез в течение 20 минут. Напряженность электрического поля 6−8 В/см. Для нанесения на гель раствор ДНК смешивали с 50% глицерином, содержащим 0,1% бромфеноловый синий, 0,1% ксиленцианол в соотношении 1:10. Сканирование геля проводили в УФ свете с помощью видеосистемы «DNA Analyzer» (Москва). В качестве стандарта молекулярной массы использовали ДНК плазмиды pBlueScript/SK, обработанную эндонуклеазой рестрикции MspI, маркерную ДНК 100 bp и 1kb.

Глава 3. Результаты и обсуждение

Целью нашей работы являлось изучение корреляции между изменением экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы и гена декорина в опухоли. Поэтому нашей первой задачей было изучение экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в ткани молочной железы человека, для решения которой нами был выбран метод ОТ-ПЦР.

В работе использовали три типа ткани молочной железы человека — нормальная ткань молочной железы пациентов, не страдающих опухолевыми новообразованиями, опухолевая ткань и окружающая опухоль ткань молочной железы того же пациента, обозначенная нами как контрольная ткань.

Операционный материал получали в 1 Городской клинической больнице, забор образцов проводили под контролем главного онколога г. Новосибирска, д. м. н., проф. Сидорова С. В.

3.1 Компьютерный анализ гена D-глюкуронил С5-эпимеразы

Ген D-глюкуронил С5-эпимеразы человека до сих пор не клонирован. Поэтому на первом этапе необходимо было провести компьютерный анализ вероятного гена D-глюкуронил С5-эпимеразы человека и подобрать праймеры для ОТ-ПЦР. В первую очередь мы провели сравнительный анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей D-глюкуронил С5-эпимеразы мыши, быка и человеческого гомолога мышиной D-глюкуронил С5-эпимеразы.

Табл. 3. Эволюционная консервативность белковой последовательности D-глюкуронил С5-эпимеразы.

Компьютерный анализ показал высокую гомологию нуклеотидной последовательности у мыши и быка с человеком- 81% и 84% соответственно (см. Табл. 3), еще больше оказалась гомология аминокислотной последовательности- 96% у мыши и 97% у быка.

Анализ нуклеотидных замен показал, что в основном, происходили замены в 3, 6, 9…3n положении, что, как правило, не приводит к смене аминокислоты.

По всей видимости, D-глюкуронил С5-эпимераза играет важную роль в жизни клетки, и мутации, приводящие к смене аминокислот, элиминировались в процессе эволюции отбором.

DNA: GGCTGGAGCTGCGGCACCGCAGGCCTGAGCCACCCCTTCTCTGCTGTCTCC+1: G W S C G T A G L S H P F S A V S.

DNA: TTCTCTTCCTCAGGGCTCCCGTGTCTGCTCGCCCTCCGACGCTGCTCAGGA+1: F S S S G L P C L L A L R R C S G.

DNA: ATTTGACAAGAAACTGAAGTTTTGATTCAGATATATTTTGAATTGAAACCA+1: I * Q E T E V L I Q I Y F E L K P.

DNA: GAGATGTTCTAGAGTTTAGATTCTTTCATTTGATTAAGGTATGGTCTGAAT+1: E M F * S L D S F I * L R Y G L N.

DNA: ATGCGTTGCTTGGCAGCTCGGGTCAACTATAAGACTTTGATTATTATCTGC+1: M R C L A A R V N Y K T L I I I C.

DNA: GCACTCTTCACTTTGGTCACAGTACTTTTGTGGAATAAGTGTTCCAGTGAC+1: A L F T L V T V L L W N K C S S D.

DNA: AAAGCAATCCAGTTTCCACGGCGTTCGAGTAGTGGCTTCAGAGTGGATGGG+1: K A I Q F P R R S S S G F R V D G.

DNA: TTTGAAAAAAGAGCAGCAGCATCTGAGAGTAACAACTATATGAACCACGTG+1: F E K R A A A S E S N N Y M N H V.

DNA: GCCAAACAACAGTCTGAGGAAGCATTCCCTCAGGAACAGCAGAAAGCACCC+1: A K Q Q S E E A F P Q E Q Q K A P.

DNA: CCTGTTGTTGGGGGCTTCAATAGCAATGTGGGAAGTAAGGTGTTAGGGCTC+1: P V V G G F N S N V G S K V L G L.

DNA: AAATATGAAGAAATTGACTGTCTCATAAATGATGAACACACAATTAAAGGG+1: K Y E E I D C L I N D E H T I K G.

DNA: AGACGAGAGGGGAACGAAGTCTTTCTTCCATTCACTTGGGTTGAGAAATAT+1: R R E G N E V F L P F T W V E K Y.

DNA: TTTGATGTTTATGGAAAGGTGGTTCAGTATGATGGCTATGATCGGTTTGAA+1: F D V Y G K V V Q Y D G Y D R F E.

DNA: TTCTCTCATAGCTATTCCAAAGTCTATGCACAGAGAGCCCCCTATCACCCC+1: F S H S Y S K V Y A Q R A P Y H P.

DNA: GATGGTGTGTTTATGTCTTTTGAAGGCTACAATGTGGAAGTCCGAGACAGA+1: D G V F M S F E G Y N V E V R D R.

DNA: GTCAAGTGCATAAGTGGGGTTGAAGGTGTGCCATTATCTACACAATGGGGA+1: V K C I S G V E G V P L S T Q W G.

DNA: CCTCAAGGCTATTTCTATCCAATCCAGATTGCACAGTATGGATTAAGTCAT+1: P Q G Y F Y P I Q I A Q Y G L S H.

DNA: TACAGCAAGAATCTAACTGAGAAACCTCCTCACATAGAGGTATATGAAACA+1: Y S K N L T E K P P H I E V Y E T.

DNA: GCAGAAGACAGAGACAAAAACAAGCCTAATGACTGGACTGTGCCAAAGGGC+1: A E D R D K N K P N D W T V P K G.

DNA: TGCTTTATGGCGAATGTGGCTGATAAGTCTAGATTCACCAATGTCAAACAG+1: C F M A N V A D K S R F T N V K Q.

DNA: TTTATTGCACCAGAAACCAGTGAAGGTGTATCCTTGCAACTGGGAAACACA+1: F I A P E T S E G V S L Q L G N T.

DNA: AAAGATTTTATTATTTCATTTGACCTCAAGTTCTTGACAAATGGAAGTGTG+1: K D F I I S F D L K F L T N G S V.

DNA: TCCGTGGTTCTAGAGACCACAGAAAAGAATCAGCTCTTCACTATACATTAT+1: S V V L E T T E K N Q L F T I H Y.

DNA: GTCTCAAATGCTCAGCTAATTGCTTTTAAAGAAAGAGATATATACTATGGC+1: V S N A Q L I A F K E R D I Y Y G.

Предполагаемый белковый продукт человеческого гомолога мышиной D-глюкуронил С5-эпимеразы анализировали с помощью различных компьютерных программ. Было показано, что продукт данного гена представляет собой:

· мембранный белок, который имеет трансмембранный домен (рис.10) 10−32 аминокислот (программы HMMTOP, SOSUIignal).

· сигнальный пептид расположен на N-конце белковой молекулы (программа Signal P V1.1).

· не заякорен через гликозилфосфатидилинозитол (GPI) (программа DGPI).

· наиболее вероятная локализация предполагаемого белка — в мембранах аппарата Гольджи (программа PSORT II).

Таким образом, предполагаемый продукт исследуемого гена по основным характеристикам аналогичен D-глюкуронил С5-эпимеразе быка и мыши, нуклеотидные последовательности всех трех генов также проявляют высокую степень гомологии.

Сравнив нуклеотидную последовательность (рис. 11) D-глюкуронил С5-эпимеразы мыши, быка и человеческого гомолога, были выявлены наиболее консервативные участки у всех трех генов и подобраны праймеры к этим участкам.

Homo sapiens CACACAATTAAAGGGAGACGAGAGGGGAAсGAAGTCTTTCTTCCATTCA 400.

Bos taurus CACACAATTAAAGGGAGACGAGAGGGGAATGAAGTCTTTCTTCCATTCA 347.

Mus musculus CACACсATTAAAGGGAGACGAGAGGGGAATGAAGTTTTсCTTCCATTCA 600.

*********************************************.

Homo sapiens AGTGAtTGGCTAGTaAGGAACCAGGATGAGAAAGGTGGCTGGCCAATTA 1321.

Bos Taurus AGTGACTGGCTgGTGAGGAACCAGGATGAGAAAGGTGGCTGGCCgATTA 1247.

Mus musculus AGTGACTGGCTAGTGAGGAACCAGGATGAGAAAGGTGGCTGGCCAATTA 1560.

***** ***** ** ***************************** ****.

Рис. 11. Гомология нуклеотидной последовательности гена D-глюкуронил С5-эпимеразы Прописные буквы — нуклеотидные замены Подчеркивание — подобранные праймеры (эпимераза 329/1240).

Праймеры были подобраны таким образом, чтобы последовательности находились в экзонах известных генов D-глюкуронил С5-эпимеразы мыши и быка.

Таким образом, мы провели компьютерный анализ гена D-глюкуронил С5-эпимеразы человека и подобрали праймеры (эпимераза 329/1240) к наиболее консервативным участкам гена. Далее необходимо было посмотреть экспрессию D-глюкуронил С5-эпимеразы в ткани молочной железы человека.

3.2 Анализ экспрессии D-глюкуронил С5-эпимеразы в ткани молочной железы человека

Для изучения экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы был выбран метод ОТ-ПЦР. Для работы этим методом, в первую очередь необходимо выделить РНК, провести обратную транскрипцию, и с полученной кДНК провести полимеразную цепную реацию с праймерами (эпимераза 329/1240) для D-глюкуронил С5-эпимеразы.

РНК выделяли несколькими методами, однако остановились на методе выделения РНК с помощью реактива «Trizol». Очистку РНК от возможных примесей ДНК проводили с помощью ДНКазы.

Для обратной транскрипции мы пробовали использовать два вида праймеров — oligo (dT) и случайные гексануклеотидные праймеры. Поскольку обратная транскрипция лучше проходила на праймерах oligo (dT), они были выбраны для дальнейших экспериментов.

По результатам проведенных экспериментов, для дальнейших исследований мы выбрали метод выделения РНК с помощью реактива «Trizol», очистку РНК от примесей ДНК с помощью ДНКазы, обратную транскрипцию проводили с использованием oligo (dT) праймеров.

3.2.1. Нормальная ткань молочной железы человека.

Экспрессию гена D-глюкуронил С5-эпимеразы смотрели в клинических образцах нормальной ткани молочной железы человека здоровых пациентов, не страдающих злокачественными новообразованиями.

Для этого полученную после обратной транскрипции кДНК использовали для амплификация гена D-глюкуронил С5-эпимеразы методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами эпимераза 329/1240 (см. Мат. и Мет.) (рис. 14).

Электрофорез показал, что нам удалось получить фрагмент ДНК ожидаемого размера — 911п.н.

Для того чтобы проверить нуклеотидную последовательность амплифицированного фрагмента, мы выделили ДНК из геля и провели секвенирование. Результаты секвенирования показали, что полученная последовательность идентична ожидаемой (рис. 15).

Таким образом, нам удалось впервые показать экспрессию гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в нормальной ткани молочной железы человека.

Тканеспецифичность экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы.

Для того чтобы посмотреть тканеспецифичность D-глюкуронил С5-эпимеразы, мы использовали коммерческую кДНК из различных нормальных тканей человека — тимус, почки, легкое, кишечник, и полученную нами кДНК щитовидной железы и молочной железы человека (рис.16).

Электрофорез продуктов ПЦР показал, что уровень экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в тканях человека неодинаков.

Самый высокий уровень оказался в молочной железе человека (Рис. 15.), в легком D-глюкуронил С5-эпимераза экспрессируется на среднем уровне. В щитовидной железе, тимусе, почке и толстой кишке экспрессия гена эпимеразы оказалась на приблизительно одинаковом низком уровне.

Таким образом, мы показали, что экспрессия гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в различных тканях человека поддерживается на разном уровне.

Сравнительный анализ экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человкека.

Экспрессиию гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевой ткани смотрели методом ОТ-ПЦР, сравнивая ее с экспрессией гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в контрольной ткани (максимально удаленная от опухоли ткань молочной железы того же пациента). Мы выделяли РНК из контрольной и опухолевой ткани, проводили обратную транскрипцию и полученную кДНК использовали в полимеразной цепной реакции.

В результате мы увидели, что в опухолевой ткани по сравнению с контрольной происходило изменение экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы (рис.17). На электрофорезе исчезала полоса ДНК ожидаемого размера (911 п.н.) и появлялись полосы меньшего размера.

Однако является ли это случайным изменением или есть некая закономерность можно сказать только после исследования большего количества пациентов.

Качественная полимеразная цепная реакция.

Нами были исследованы клинические образцы опухолевой и контрольной ткани от 30 пациенток методом качественной ПЦР. Для этого мы выделяли РНК одновременно из контрольной и опухолевой ткани одного и того же пациента, проводили обратную транскрипцию. С полученной кДНК вели полимеразную реакцию, используя праймеры для D-глюкуронил С5-эпимеразы (эпимераза 329/1240) и для гена домашнего хозяйства (GAPDH либо в-актин), причем реакция с использованием каждой пары праймеров шла в отдельной пробирке (рис. 18,19).

На основании полученных результатов, однозначного изменения экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека не показано.

Согласно предварительной качественной оценке, у 10 пациенток из 30 экспрессия гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухоли по сравнению с контролем увеличивалась, у 8 пациентов экспрессия гена D-глюкуронил С5-эпимеразы по сравнению с контролем уменьшалась, у 11 пациенток не удалось детектировать D-глюкуронил С5-эпимеразу ни в контроле, ни в опухоли (Рис. 18, 19).

На основании этого пациентов можно предварительно разделить на группы с уменьшением экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы, увеличением экспрессии гена эпимеразы, и пациентов, у которых не удалось детектировать экспрессию гена эпимеразы (рис. 20).

Таким образом, мы не увидели в опухоли какой-либо однозначной тенденции изменения экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы по сравнению с контролем — увеличение или уменьшение экспрессии данного гена. Для того чтобы более точно показать изменения в экспрессии гена эпимеразы необходимо было использовать метод мультиплексной ПЦР.

Мультиплексная полимеразная цепная реакция.

Нами были исследованы клинические образцы контрольной и опухолевой ткани от 20 пациентов. Уровень экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы оценивался методом мультиплексной ПЦР. Суть этого метода заключается в том, что в одну пробирку одновременно добавляли праймеры для гена D-глюкуронил С5-эпимеразы (эпимераза 329/1240) и гена GAPDH, чтобы оценить уровень экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы по отношению к экспрессии гена GAPDH (рис.21).

Полуколичественный анализ мультиплексной ПЦР проводили с помощью программы TotalLab, которая обсчитывает интенсивность амплифицированных полос ДНК — D-глюкуронил С5-эпимеразы и гена домашнего хозяйства (Аэпим и АGAPDH соответственно). Далее определяем их отношение в контроле (Аэпим. контр/АGAPDH контр) и опухоли (Аэпим.опух/АGAPDH опух). Отношение этих параметров, обозначенное Аизм. позволяет нам приблизительно оценить во сколько раз экспрессия гена эпимеразы в опухоли больше/меньше экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в контроле.

Данные, полученные нами для каждого пациента представлены на рис. 22.

Аизм. соответствующее 1 говорит о том, что экспрессия гена в опухоли не изменяется по сравнению с контролем, >1 — экспрессия гена в опухоли больше по сравнению с контролем, <1 — экспрессия гена в опухоли меньше по сравнению с контролем.

Мы увидели, что у различных пациентов происходят неоднозначные изменения (рис. 22). Они идут как в сторону увеличения экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы, так и в сторону уменьшения, вплоть до полного исчезновения эпимеразы в опухоли. Мы провели условное деление пациентов на группы, критерием деления было увеличение или уменьшение экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы более чем на 50%.

Согласно предварительным оценкам у 7 пациентов из 20 в опухоли происходило увеличение экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы по сравнению с контролем, у 5 — уменьшение экспрессии гена эпимеразы, причем у 3 пациентов из 5 происходило уменьшение экспрессии гена эпимеразы вплоть до полного исчезновения, у 8 пациентов из 20 экспрессия гена эпимеразы в опухоли значительно не изменялась по сравнению с контрольной тканью (рис. 23).

Таким образом, результат мультиплексной ПЦР согласуется с предварительными данными, полученными в ходе качественной ПЦР — уровень экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухоли изменяется по сравнению с контрольной тканью молочной железы человека и изменения эти неоднозначны.

Необходимо учитывать, что нормировку экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы мы вели на контрольную ткань, полученную у того же пациента. Неизвестно, во всех ли случаях она действительно нормальная, нет ли там предопухолевых (мастопатийных, воспалительных) изменений. Более того, было замечено, что уровень экспрессии гена эпимеразы различался даже в контрольной ткани. Поэтому возник вопрос о сравнении уровня экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в контрольной ткани и нормальной ткани (от пациентов, не страдающих злокачественными новообразованиями).

Сравнение экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в контрольной и нормальной ткани молочной железы человека.

Нами были проанализированы клинические образцы нормальной ткани 6 пациенток методом мультиплексной ПЦР и проведено сравнение уровня экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы с аналогичными данными, полученными для контрольной ткани (рис. 24).

Мы увидели, что ген D-глюкуронил С5-эпимеразы человека в образцах нормальной ткани экспрессируется на более высоком уровне — Аэпим/АGAPDH? 3.5.

Среди больных раком молочной железы лишь у одного пациента из 20 наблюдался высокий уровень экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы, сравнимый с экспрессией гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в нормальной, неизмененной ткани молочной железы человека. У 10 пациентов из 20 уровень экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы был в 2−3 раза ниже нормального уровня экспрессии этого гена, у 5 уровень экспрессии гена эпимеразы был меньше в 10−15 раз. У 4 пациентов из 20 D-глюкуронил С5-эпимераза не детектировалась даже в контрольной ткани. Не исключено, что такие различия могут быть связаны со степенью злокачественности процессов, прогнозом заболевания или с другими клиническими параметрами. Этот вопрос требует дальнейшего изучения и обследования большего количества пациентов.

Таким образом, можно сказать, что даже в клинических образцах контрольной ткани, уровень экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в основном ниже уровня экспрессии данного гена в ткани молочной железы от здорового пациента. Поэтому возник вопрос, каким будет изменение экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухоли, если нормировать ее не на контрольную ткань, а на нормальную, не учитывая возможный индивидуальный разброс (рис. 25).

Видно, что если производить нормировку на нормальную ткань, то соотношение изменения экспрессии гена эпимеразы меняется в сторону уменьшения (рис. 26).

При сравнении уровня экспрессии гена D-глкуронил С5-эпимеразы в опухоли и нормальной ткани молочной железы человека было показано, что уровень экспрессии гена D-глкуронил С5-эпимеразы в опухоли снижается у 95% исследованных пациентов.

Такое резкое снижение уровня экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухоли по сравнению с контролем позволяет предположить, что D-глюкуронил С5-эпимераза может служить в качестве потенциального маркера для диагностики злокачественных новообразований молочной железы человека.

Однако нельзя исключать, что данные результаты получены именно для этой пары праймеры, тогда как альтернативные пары праймеров могли показать другой результат.

3.3 Определение экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы при помощи набора различных праймеров

Чтобы подтвердить полученные данные, нами были подобраны праймеры к различным вероятным экзонам гена D-глюкуронил С5-эпимеразы человека.

Дополнительно были подобраны пары праймеров.

· Эпимераза 170/745 — I-II экзон.

· Эпимераза 329/1240 — I-III экзон.

· Эпимераза 575/1240 — II-III экзон.

· Эпимераза 329/745 — I-III экзон.

· Эпимераза 809/1830 — III экзон.

3.3.1 Нормальная ткань молочной железы человека

Было проведено сравнение уровня экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в нормальной ткани молочной железы человека с использованием различных пар праймеров.

Все использованные праймеры работали и давали полосу амплифицированной ДНК ожидаемого размера и сопоставимой интенсивности. Это говорит о том, что в нормальной ткани молочной железы человека с данного гена считывается полноразмерный транскрипт мРНК.

3.3.2 Опухолевая ткань молочной железы человека

Мы определяли экспрессию гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухолевой ткани молочной железы с помощью этого же набора праймеров.

В отличие от экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в нормальной ткани, у обследованных пациентов в опухоли наблюдались видимые различия в экспрессии данного гена в зависимости от использованных праймеров. Так, при использовании праймеров лежащих в пределах одного (третьего) экзона, видно, что экспрессия гена эпимеразы поддерживается на одном уровне. Если в ходе ПЦР использовались праймеры эпимераза 329/1240 или эпимераза 329/745, то происходило полное исчезновение фрагмента амплифицированной ДНК (рис. 29, дор. 6,7 и 10,11 соответственно). При использовании праймеров эпимераза 575/1240 в опухоли происходило снижение экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы и определялся укороченный фрагмент ДНК (рис. 29, дор. 8,9). Возможно, опухолевая ткань содержит мРНК D-глюкуронил С5-эпимеразы, укороченной за счет альтернативного сплайсинга или делеции.

Для проверки данного предположения мы исследовали кДНК 17 пациентов с использованием праймеров эпимераза 809/1830 (эпимераза809) и эпимераза 575/1240 (эпимераза575).

На гистограммах видно (рис. 31. Б, Г.), что разные пары праймеров (эпимераза 575/1240 и эпимераза 809/1830) показали различный уровень экспрессии гена эпимеразы в опухоли молочной железы человека.

Например, у пациентов № 100, № 104 экспрессия809 гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухоли увеличивалась, а экспрессия575 гена эпимеразы в опухоли уменьшалась. Нами были посчитаны Аизм для эпимеразы 809/1830 и эпимеразы 575/1240 для каждого пациента (рис. 32).

Из графика (рис. 32) видно, что при использовании различных пар праймеров (эпимераза 809/1830 и эпимераза 575/1240) изменения уровня экспрессии гена эпимеразы в опухоли противоположны для каждого конкретного пациента.

Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что в молекуле мРНК D-глюкуронил С5-эпимеразы происходит исчезновение сайтов посадки для определенных праймеров, причем у различных пациентов это могут быть разные области молекулы мРНК эпимеразы. Например, у пациентов № 89 и № 99 наблюдалось отсутствие в опухоли по сравнению с контролем молочной железы экспрессии809 гена эпимеразы при значительном увеличении экспрессии575. У пациентов № 91, № 85, наоборот отсутствовала экспрессия575 гена эпимеразы при увеличении экспрессии809 гена эпимеразы в опухоли по сравнению с контролем.

Чтобы оценить частоту таких изменений, было распределение пациентов по уровню экспрессии809 и уровню экспрессии575 гена D-глюкуронил С5-эпимеразы.

Согласно приведенным данным, у большинства обследованных пациентов наблюдались различия в уровне экспрессии гена эпимеразы, определенным с помощью праймеров эпимераза575/1240 (экспрессия575) и праймеров эпимераза 809/1830 (экспрессия809) в опухоли по сравнению с контролем. В опухоли молочной железы некоторых пациентов происходило снижение экспрессии809 гена эпимеразы при увеличении экспрессии575 (№ 89, № 99, № 103, № 95), либо наоборот, происходило снижение экспрессии575 при увеличении экспрессии809 гена эпимеразы в опухоли по сравнению с контролем (№ 83, № 84, № 85, № 87, № 91, № 100, № 104, № 92, № 82, № 102).

Таким образом, полученные данные могут говорить о том, что в опухоли молочной железы исследованных пациентов происходят некие изменения в мРНК D-глюкуронил С5-эпимеразы — у 16 пациентов из 17, природа которых требует дальнейших исследований.

3.4 Сравнительный анализ экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы и гена декорина в контрольной и опухолевой ткани молочной железы человека

Нашей следующей задачей было посмотреть, коррелирует ли изменение экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы в опухоли молочной железы человека с экспрессией гена декорина (который является вероятным субстратом для фермента D-глюкуронил С5-эпимеразы). Экспрессию гена декорина в тех же самых образцах молочной железы человека определяли методом мультиплексной ПЦР (рис. 34).

Уровень экспрессии гена декорина оценивали по отношению к экспрессии гена GAPDH. Изменение экспрессии гена декорина в опухоли определяли как Аизм. декор. (так же, как это делалось для гена D-глюкуронил С5-эпимеразы), где 1 соответствовала одинаковому уровню экспрессии гена декорина в опухоли и контроле, число >1 говорило об увеличении экспрессии гена декорина в опухоли по сравнению с контролем, число <1 говорило об уменьшении экспрессии гена декорина в опухоли по сравнению с контрольной тканью молочной железы человека (рис.35).

Согласно представленным данным экспрессия гена декорина в опухоли молочной железы исследованных пациентов изменяется неоднозначно: у 6 пациентов из 23 происходило увеличение экспрессии гена, у 9 пациентов из 23 — уменьшение, у 8 пациентов экспрессия значительно не изменялась по сравнению с контрольной тканью молочной железы (рис.35).

Мы условно разделили всех пациентов на группы, где критерием было увеличение либо уменьшение экспрессии гена декорина более чем на 50%. (рис. 36).

Таким образом, изменение экспрессии гена декорина в опухоли было так же неоднозначно как и изменение экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы. Однако возникает вопрос, существует ли какая-либо корреляция между этими параметрами.

Мы провели сравнение изменения уровня экспрессии гена декорина с изменением экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы (показанным при помощи двух пар праймеров — эпимераза 809/1830 (рис. 37.Б.) и эпимераза 575/1240 (рис. 37.А.)) в опухоли по сравнению с контрольной тканью молочной железы у одних и тех же пациентов.

Чтобы определить согласованность изменений экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы и гена декорина, происходящих в опухолевой ткани молочной железы человека, коэффициент корреляции этих параметров был определен по формуле:

Где у определяли по формуле ,.

N — количество обследованных пациентов, (табл. № 4),.

В — среднее значение признака.

Табл.№ 4. Коэффициент корреляции экспрессии гена Dглюкуронил С5-эпимеразы с экспрессией гена декорина в опухоли молочной железы человека.

В данном случае мы видим, что изменение экспрессии гена декорина в опухоли по сравнению с контрольной тканью молочной железы человека коррелируют с изменением экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы, определенным при помощи праймеров эпимераза 575−1240, и не коррелируют с экспрессией гена эпимеразы, определенным при помощи праймеров 809/1830.

Таким образом, на основании полученных данных можно сделать вывод, что уровень экспрессии генов декорина и D-глюкуронил С5-эпимеразы, (определенный при помощи праймеров эпимераза 575/1240) в опухолевой ткани молочной железы человека коррелирует с уровнем достоверности 95%.

Причина такой корреляции неизвестна, и является предметом наших дальнейших исследований.

Заключение

Таким образом, в ходе данной работы впервые была определена экспрессия гена D-глюкуронил С5-эпимеразы человека в клинических образцах молочной железы и показана ее тканеспецифичность. Проведен сравнительный анализ экспрессии этого гена в нормальной ткани молочной железы (от пациентов, не страдающих злокачественными новообразованиями), контрольной ткани (ткань молочной железы, максимально удаленная от опухоли) и опухоли молочной железы человека.

Показано, что снижение экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы человека достоверно определяется уже в ткани молочной железы, окружающей опухоль, что ставит ген D-глюкуронил С5-эпимеразы в разряд перспективных маркеров для доклинической диагностики рака молочной железы.

В опухоли, помимо снижения экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы дополнительно определяются некие изменения в мРНК эпимеразы, которые заключаются в исчезновении районов посадки определенных праймеров.

Полученные данные свидетельствуют о том, что в опухоли молочной железы человека экспрессия гена D-глюкуронил С5-эпимеразы или блокируется полностью, или возникают изменения в структуре мРНК D-глюкуронил С5-эпимеразы, что показано для многих генов, супрессирующих опухолевый рост.

Нарушение мРНК в области второго экзона D-глюкуронил С5-эпимеразы коррелирует с изменением экспрессии гена декорина в опухоли, который является антимитотической молекулой и потенциальным субстратом для фермента D-глюкуронил С5-эпимеразы. Изучение механизмов возможного влияния экспрессии/активности D-глюкуронил С5-эпимеразы на содержание декорина в клетках и уровень митотической активности клеток является нашей дальнейшей задачей.

Выводы

1. Показано, что ген D-глюкуронил С5-эпимеразы экспрессируется в нормальной ткани молочной железы человека.

2. Экспрессия гена D-глюкуронил С5-эпимеразы носит тканеспецифичный характер, экспрессия показана для всех исследованных тканей человека — молочная железа, щитовидная железа, почка, тимус, легкое, толстая кишка (максимальный уровень в молочной железе, минимальный — в толстом кишечнике).

3. Ткань молочной железы, окружающая опухоль характеризуется резким снижением уровня экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы по сравнению с нормальной тканью молочной железы человека.

4. В опухоли, помимо снижения экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы, происходят структурные изменения в мРНК эпимеразы (делеции либо альтернативный сплайсинг различных областей молекулы) — у 16 пациентов из 17.

5. Изменение экспрессии гена декорина коррелирует с уровнем экспрессии гена D-глюкуронил С5-эпимеразы человека, определенный при помощи праймеров эпимераза 575/1240 (уровень достоверности 95%).

Список литературы

1. Kjellen, L., Lindahl, U. Proteolycans: structure and interactions // Annu. Rev. Biochem. — 2009. — V. 60. — P. 443−475.

2. Seidler, D.G., Breuer, E., Grande-Allen, K.J. et al. Core protein dependence of epimerization of glucuronosyl residues in galactosaminoglycans // J.Biol. Chem. — 2008. — V.277. — P.42 409−42 416.

3. Wilson, I.B. The never-ending story of peptide O-xylosyltransferase // Cell. Mol. Life Sci. — 2009. — V. 61. — P. 794−809.

4. Prydz, K., Dalen, K.T. Synthesis and sorting of proteoglycans // Journal of Cell Science. — 2006 — V. 113. — P. 193−205.

5. Silbert, J.E., Sugumaran, G. Biosynthesis of chondroitin/dermatan sulfate // IUBMB Life. — 2008. — V. 54. — P. 177−186.

6. Fransson, L.A., Belting, M., Jonsson, M., et al. Biosynthesis of decorin and glypican // Matrix Biol. — 2006. — V. — 19. P. 367−376.

7. Hardingham, T.E., Fosang, A.J. Proteoglycans: many forms and many functions // The FASEB Journal. — 2009. — V. 6. — P.861−870.

8. Tumova, S., Woods, A., Couchman, J.R. Heparan sulfate proteoglycans on the cell surface: versatile coordinators of cellular functions // Int. J. Biochem. Cell Biol. — 2006. — V. 32. — P. 269−288.

9. Schamhart, D.H., Kurth, K.H. Role of proteoglycans in cell adhesion of prostate cancer cells: from review to experiment // Urol. Res. — 2008. — V. 25. — P. 89−96.

10. Schonherr, E., Witsch-Prehm, P., Harrach, B, et al. Interaction of biglycan with type I collagen // J. Biol. Chem. — 2008. — V. 270. — P. 2776−2783.

11. Bianco, P., Fisher, L.W., Young, M.F., et al. Expression and localization of the two small proteoglycans biglycan and decorin in developing human skeletal and non-skeletal tissues // J. Histochem. Cytochem. — 2005. — V. 38. — P. 1549−1563.

12. Fleischmajer, R., Fisher, L.W., MacDonald, E.D., et al. Decorin interacts with fibrillar collagen of embryonic and adult human skin // J. Struct. Biol. — 2009. — V.1. P. 82−90.

13. Oldberg, A., Antonsson, P., Lindblom, K., et al. A collagen-binding 59-kd protein (fibromodulin) is structurally related to the small interstitial proteoglycans PG-S1 and PG-S2 (decorin) // EMBO J. — 2009. — V. 8. — P.2601−2604.

14. Embry, J.J., Knudson, W. G1 domain of aggrecan cointernalizes with hyaluronan via a CD44-mediated mechanism in bovine articular chondrocytes // Arthritis Rheum. — 2008. — V. 12. — P. 3431−3441.

15. Matsumoto, K., Shionyu, M., Go, M., et al. Distinct interaction of versican/PG-M with hyaluronan and link protein // J. Biol. Chem. — 2008. — V. 42. — P. 41 205−41 212.

16. Hirose, J., Kawashima, H., Yoshie, O. et al. Versican interacts with chemokines and modulates cellular responses // J. Biol. Chem. — 2007. — V. 276. — P. 5228−5234.

17. Kawashima, H., Li Y.F., Watanabe, N., Hirose, J., et al. Identification and characterization of ligands for L-selectin in the kidney. I. Versican, a large chondroitin sulfate proteoglycan, is a ligand for L-selectin // Int. Immunol. — 2007. — V. 3. — P. 393−405.

18. Kawashima, H., Hirose, M., Hirose, J. et al. Binding of a large chondroitin sulfate/dermatan sulfate proteoglycan, versican, to L-selectin, P-selectin, and CD44 // J. Biol. Chem. — 2006. — V. 275. — P. 35 448−35 456.

19. Haggerty, J.G., Bretton, R.H., Milstone, L.M. Identification and caracterisation of a cell surface proteoglycan on keratinocytes // J. Invest. Dermatol. — 2009. — V. 4. — P. 374−380.

20. Kugelman, L.C., Ganguly, S., Haggerty, J.G. et al. The core protein of epican, a heparin sulfate proteoglycan or keratniocytes, is an alternative form of CD44 // J. Invest. Dermatol. — 2009. — V. 6. — P. 886−891.

21. Brown, T.A., Bouchard, T., St John, T., et al. Human keratinocytes express a new CD44 core protein (CD44) as a heparin-sulfate intrinsic membrane proteoglycan with additional exon // J. Cell. Biol. — 2009. — V. 1. P. 207−221.

22. Santra, M., Reed, C.C., Iozzo, R.V. Decorin binds to a narrow region of the epidermal growth factor (EGF) receptor, partially overlapping but distinct from the EGF-binding epitope // J. Biol. Chem. — 2008. — V. 38. — P. 35 671−35 681.

23. Eickelberg, O., Centrella, M., Reiss, M., et al. Betaglycan inhibits TGF-beta signaling by preventing type I-type II receptor complex formation. Glycosaminoglycan modifications alter betaglycan function // J. Biol. Chem. — 2008. — V. 277. — P. 823−829.

24. Ostrovsky, O., Berman, B., Gallagher, J. et al. Differential effects of heparin saccharides on the formation of specific fibroblast growth factor (FGF) and FGF receptor complexes // J. Biol. Chem. — 2008. — V. 4. — P. 2444−2453.

25. Wu, Z.L., Zhang, L., Yabe, T., et al. The inVvement of HS in FGF1/HS/FGFR1 signaling complex // J. Biol. Chem. — 2008. — V.19. — P.17 121−17 129.

26. Theocharis, A., Vynios, D.H., Papageorgakopoulou, N. et al. Altered content composition and structure of glycosaminoglycans and proteoglycans in gastric carcinoma // Int. J. Biochem. Cell Biol. — 2008. — V. 35. — P.376−390.

27. Theocharis, A.D., Tsara, M.E., Papageorgacopoulou, N. et al. Pancreatic carcinoma is characterized by elevated content of hyaluronan and chondroitin sulfate with altered disaccharide composition // Biochim. Biophys. Acta. — 2006. — V. 2. — P. 201−206.

28. Tsara, M.E., Theocharis, A.D., Theocharis, D.A. Compositional and structural alterations of proteoglycans in human rectum carcinoma with special reference to versican and decorin // Anticancer Res. — 2008. — V. 22. — P. 2893−2898.

29. Achilleas, D., Theocharis, A.D. Human colon adenocarcinoma is associated with specific post-translational modifications of versican and decorin // Biochim. Biophys. Acta. — 2008. — V.1588. — P.165−172.

30. Papadas, T.A., Stylianou, M., Mastronikolis, N.S. et al. Alterations in the content and composition of glycosaminoglycans in human laryngeal carcinoma // Acta Otolaryngol. — 2008. — V. 122. — P. 330−337.

31. Vijayagopal, P., Figueroa, J.E., Levine, E.A., et al. Altered compositionand increased endothelial cell proliferative activity of proteoglycans isolated from breast carcinoma// J. Surg. Oncol. — 2007. — V. 4. — P. 250−254.

32. Alessandra, G.A., Berto, A., Lucia, O., et al. A comparative analysis of structure and spatial distribution of decorin in human leiomyoma and normal myometrium // Biochim. Biophys. Acta. — 2008. — V. — 1619. P. 98−112.

33. Santra, M., Reed, C.C., Iozzo, R.V. Decorin binds to a narrow region of the epidermal growth factor (EGF) receptor, partially overlapping but distinct from the EGF-binding epitope // J. Biol. Chem. — 2008. — V. 38. — P.35 671−3581.

34. De Luca, A., Santra, M., Baldi, A., et al. Decorin-induced growth suppression is associated with up-regulation of p21, an inhibitor of cyclin-dependent kinases // J. Biol. Chem. — 2008. — V. 271. — P. 18 961−18 965.

35. Csordas, G., Santra, M., Reed, C.C. et al. Sustained down-regulation of the epidermal growth factor receptor by decorin. A mechanism for controlling tumor growth in vivo // J. Biol. Chem. — 2006. — V. 42. — P. 32 879−32 887.

36. Stander, M., Naumann, U., Wick, W., et al. Transforming growth factor-beta and p-21: multiple molecular targets of decorin-mediated suppression of neoplastic growth // Cell Tissue Res., — 2007. — V. 296. — P. 221−227.

37. Clouthier, D.E., Comerford, S.A., Hammer, R.E. Hepatic fibrosis, glomerulosclerosis, and a lipodystrophy-like syndrome in PEPK-TGF-beta 1 transgenic mice // J. Clin. Invest. — 2007 — V. 100. — P. 2697−26 713.

38. Santra M., Eichstetter, I., Iozzo, R.V. An anti-oncogenic role for decorin. Down-regulation of ErbB2 leads to growth suppression and cytodifferentiation of mammary carcinoma cells // J. Biol. Chem. — 2006. — V. 45. — P. 35 153−35 161.

39. Grant, D.S., Yenisey, C., Rose, R.W. et al. Decorin suppresses tumorcell-mediated angiogenesis // Oncogene. — 2008. — V. 31. — P. 4765−4777.

40. Schonherr, E., Levkau, B., Schaefer, L. et al. Decorin affects endothelial cells by Akt-dependent andindependent pathways // Ann. N. Y. Acad. Sci. — 2008. — V. 973. — P.149−152.

41. Nash, M.A., Loercher, A.E., Freedman, R.S. In vitro growth inhibition of ovarian cancer cells by decorin: synergism of action between decorin and carboplatin // Cancer Res. — 2007. — V. 59. — P. 6192−6199.

42. Santra, M., Skorski, T., Calabretta, B., et al. De novo decorin gene expression suppresses the malignant phenotype in human colon cancer cells // Proc. Natl. Acad. Sci. — 2008. — V. 92. — P. 7016−7020.

43. Reed, C.C., Gauldie, J., Iozzo, R.V. Suppression of tumorigenicity by adenovirus-mediated gene transfer of decorin // Oncogene. — 2008. — V. 23. — P. 3688−95.

44. Tiedemann, K., Larsson, T., Heinegard, D., et al. The glucuronyl C5-epimerase activity is the limiting factor in the dermatan sulfate biosynthesis // Arch. Biochem. Biophys. — 2007. — V. 391. — P. 65−71.

45. Hagner-Mc Whirter, A., Li, J. Irreversible Glucuronyl C5-epimerization in the Biosynthesis of Heparan Sulfate // J. Biol. Chem. — 2009. — V. 279. — P. 14 631−14 638.

46. Hagner-McWhirter, A., Li, J.P., Oscarson, S., et al. Irreversible glucuronyl C5-epimerization in the biosynthesis of heparan sulfate // J. Biol. Chem. — 2009. — V. 279. — P. 14 631−14 638.

47. Malmstrom, A. Biosynthesis of dermatan sulfate. Substrate specifity of the C-5 uronosyl epimerse // J. Biol. Chem. — 2008. — V. 10. — P. 161−165.

48. Hagner-McWhirter, A., Hannesson, H.H., Campbell P. et al. Biosynthesis of heparin/heparan sulfate: kinetic studies of the glucuronyl C5-epimerase with N-sulfated derivatives of the Escherichia coli K5 capsular polysaccharide as substrates // Glycobiology. — 2006. — V. 10. — P. 159−171.

49. Jaccobson, I., Lindal, U., Jensen, J. W. et al. Biosynthesis of heparin. Substrate specifity of the C-5 uronosyl epimerse // J. Biol. Chem. — 2006. — V. 259. — P. 1056−1063.

50. Li, J., Hagner-McWhirter, A., Kjellen, L., et al. Biosynthesis of heparin/heparan sulfate. cDNA cloning and expression of D-glucuronyl C5-epimerase from bovine lung // J. Biol. Chem. — 2008. — V. 44. — P. 28 158−28 163.

51. Li, J.P., Gong, F., El Darwish, K., et al. Characterization of the D-glucuronyl C5-epimerase inVved in the biosynthesis of heparin and heparan sulfate // J. Biol. Chem. — 2007. — V. 23. — P. 20 069−20 077.

52. Li, J., Gong, F., Hagner-McWhirter, A., et al. Targeted Disruption of a Murine Glucuronyl C5-epimerase Gene Results in Heparan Sulfate Lacking L-Iduronic Acid and in Neonatal Lethality // J. Biol. Chem. — 2008. — V. 278. — P. 28 363−28 366.

53. Bulow, H.E., Hobert, O. Differential sulfations and epimerization define heparan sulfate specificity in nervous system development // Neuron. — 2009. — V. 41. — P.723−736.

Приложение 1

База данных по диагнозам пациентов

ПИР — протоковый инфильтрующий рак ИПР — инфильтрующий протоковый рак.