Соматотропный гормон (СТГ, гормон роста, соматотропин)

Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина»

Кафедра органической и биологической химии Курсовая работа по дисциплине «Молекулярные механизмы гормональной регуляции»

Тема: Соматотропный гормон (СТГ, гормон роста, соматотропин) Выполнил студент 4-го курса

1-й группы ВБФ Чудаков Д.Б.

Научный руководитель К.б.н., доцент Джафаров М.Х.

Москва 2012

1. История вопроса

2. Структура и синтез гормона роста

3. Секреция гормона роста

4. Гормон роста в крови

5. Молекулярный механизм действия и биологические эффекты гормона роста

5.1 Рецептор гормона роста и сопряжённые с ним белки

5.2 Сигнальные пути, активируемые гормоном роста

5.3 Соматомедины, их секреция, рецепторы и биологические эффекты

5.4 Суммарные биологические эффекты гормона роста

6. Эндокринные патологии, связанные с гормоном роста и их лечение

6.1 Болезни, связанные с недостаточностью гормона роста

6.2 Болезни, связанные с избытком гормона роста Заключение Список литературы

Эндокринная система организма совместно с нервной и иммунной системой контролируют ход различных физиологических процессов в организме. Важнейшим процессом в онтогенезе организма является процесс его роста и развития, в том числе и в постнатальный период. Этот процесс регулируется многими гормонами, одним из главных (если не самым главным) в этом процессе является гормон роста, иначе именуемый соматотропином.

Молекулярные механизмы действия гормона — ключ к пониманию природы его биологических эффектов, к управлению ими и часто к устранению основных патологий, связанных с данным гормоном. Поэтому знание данного вопроса необходимо, а изучение его актуально как с теоретической, так и с практической точки зрения, особенно в отношении соматотропина — одного из ключевых тропных гипофизарных гормонов человека и животных.

Целью моей работы является описание основных известных на сегодняшний день молекулярных механизмов регуляции синтеза и секреции гормона роста, описание химической структуры этого гормона и молекулярных механизмов его действия, включая описание его рецепторов, сигнальных путей, через него активируемых гормоном, и примеры некоторых белков, синтез которых им индуцируется. В работе я привожу также основные физиологические эффекты гормона роста и возможные их молекулярные механизмы на основе обобщённых данных. В конце работы кратко опишу основные патологии, развитие которых так или иначе связано с гормоном роста.

Для написания данной работы планирую использовать как русскоязычные источники, так и англоязычные, включающие некоторые новые данные.

1. История вопроса

Как орган гипофиз был открыт весьма давно, его анатомия и гистология у животных и человека были подробно изучены к началу XX века, однако изучение биохимии, физиологии и патологии гормонов, вырабатываемых им, началось сравнительно недавно.

Патологии, связанные с гормоном роста, известны уже давно, например акромегалию как болезнь впервые описал П.Марри в 1886 году, а год спустя Минковски доказал, что патология связана с гормонпродуцирующей активностью передней доли гипофиза. В отечественной литературе первой сообщение об акромегалии сделал Б.М.Шапошников в 1889 году. Таким образом уже на рубеже XIX—XX вв.еков было известно, что гипофиз вырабатывает некоторое вещество, гормон, ответственный за стимуляцию роста тела. Однако впервые удалось выделить гормон роста, или соматотропин, лишь в 1956 году Ли и Паркоффом, а установить его первичную структуру — Нейлу в 1971 году. С этого времени гормон роста и начали изучать с биохимической точки зрения.

Вот перечень некоторых основных открытий, связанных с соматотропином и сделанных в 70−80-х годах XX века (года по времени опубликования статей). В 1973 году П. Бразоу и Р. Бургус изолировали и установили первичную структуру соматостатина. Исследования 1976;1981 годов выявили пульсовой ритм секреции гормона роста у многих видов млекопитающих и половой диморфизм этих ритмов (Саундерс, Мартин, Стейнер, Танненбаум, Терри и другие исследователи). В 1977 году С. Питерз и Х. Г. Фризен доказали наличие в плазме крови белка, связывающего гормон роста с высокой аффинностью. В том же году Бовер с коллегами доказал, что высвобождение гормона роста может стимулироваться эндорфинами и энкефалинами. В 1978 году Левис с коллегами выделили новую изоформу гормона роста, 20-КДа, в 1978;81 годах открыта способность гормона роста образовывать олигомерные структуры в крови (Левис, Шарман и др.), В 1982 году из крови двух пациентов с панкреатической опухолью и акромегалией был выделен соматолиберин, усиливающий синтез и секрецию гормона роста. В 1987 году был клонирован ген и изучена структура рецептора гормона роста у кролика и человека (Д.В. Леунг, С. А. Спенцер, Г. Кахианес и другие). К концу 1980;х годов уже были накоплены достаточные сведения о соматомединах, уже было известно о белках, связывающих их в плазме крови. В 1989 году был предложен механизм образования этого белка в результате альтернативного сплайсинга гена рецептора гормона роста. В 1989;90 годах открыта плацентарная гликозилированная изоформа гормона роста [2−6].

В 90-х годах исследования, касающиеся гормона роста и молекулярных механизмов его действия продолжались. В 1990 году впервые предложена модель димеризации рецептора гормона роста при связывании его с гормоном роста. К 1992 году стало понятно, что рецептор гормона роста при активации активирует МАР-каскад. В 1993 году доказан механизм образования белка, связывающего гормон роста, через протеолиз его рецептора, установлена способность гормона роста активировать транскрипционный фактор сывороточного ответа, уже до того известный своей способностью активировать транскрипцию некоторых мышечных белков. Тогда же стала известна способность гормона роста активировать реорганизацию актинового цитоскелета и миграцию моноцитов. Установили, что сигнальные пути, активируемые гормоном роста, начинаются с активации Янус-киназы JAK-2. В 1994 году открыли активацию через рецептор гормоном роста сигнального пути с участием IRS-белков. В том же году открыли его способность активировать STAT белки. В 1995 году доказано, что гормон роста может связываться б₂ — макроглобулином в крови; установлены приблизительно сайты цитоплазматического домена гормона роста, фосфорилирующиеся при его активации. В 1999 году был изолирован кишечный фактор, стимулирующий секрецию гормона роста (грелин). К 1996 году расшифровали доменную структуру рецептора гормона роста и установили приблизительно функцию каждого из доменов; обнаружили способность гормона роста стимулировать вход кальция в клетку, зависимый от активации протеинкиназы С. В 1998 году обнаружено, что рецептор гормон роста стимулирует реорганизацию актинового цитоскелета через фокальную адгезионную киназу. К 1999 году доказана активация транскрипции гена ИФР-1 гормоном роста через активацию STAT-5. В 2000 году установлен в общих чертах молекулярный механизм действия соматотропина на синтез гормона роста [2−6].

В начале XXI века по настоящее время проводятся уточнения молекулярного механизма действия гормона роста. В 2001 году предложена модель мультипротеинового комплекса, образующегося при активации гормоном роста его рецептора при цитоплазматическом домене его рецептора. В 2002;2005 годах появились данные о возможности существования рецептора гормона роста в димерной форме и в отсутствии самого гормона. К 2003 году стало известно, что помимо JAK-2 рецептор гормона роста способен напрямую активировать и Lyn-киназу. В 2006 году предложена модель активации JAK-2 при связывании гормона с рецептором [7−8].

2. Структура и синтез гормона роста

Основным местом синтеза соматотропина, или гормона роста, является аденогипофиз (передняя доля гипофиза), а точнее — специальная разновидность хромофильных ацидофильных клеток — соматотрофы, накапливающие данный гормон в виде гранул внутри своей цитоплазмы, они наиболее многочисленны в передней доле гипофиза [9−10]. Однако в последнее время открыто, что это место синтеза — не единственное.

Гормон роста — это типичный белковый гормон. В литературе обычно говорится, что он представляет из себя белок молекулярной массой 22кДа, имеющий в своём составе 191 аминокислоту и 2 внутримолекулярных дисульфидных связи (у человека между остатками цистеина 52−165 и 183−189). Однако в последнее время стало понятно, что дело обстоит несколько сложнее и интереснее.

Гормон роста — гетерогенный белок. Имеется два гена гормонов роста, оба располагаются у человека в локусе 17q24.2. (на длинном плече 17-й хромосомы). Весь кластер, занимаемый этими генами, а также тремя другими, имеет размер 46 800 килобаз (тысяч пар нуклеотидов). Рассмотрим эти гены и их продукты.

Два разных гена (обозначаемых GH1 и GH2, от английского «growth hormone» — гормон роста) кодируют два разных варианта гормона роста — соответственно основной вариант, или GH-N, и минорный вариант, или GH-V. Главный продукт экспрессии гена GH1 — это и есть типичная изоформа гормона роста, имеющая в составе 191 аминокислотный остаток и молекулярную массу 22 129Да, иначе именуемая 22К-GH, образуемый через стадию прогормона молекулярной массой 28кДа, структура показана на рисунке № 1. Это — наиболее распространённая изоформа соматотропина, составляющая 55% от его общего количества в гипофизе и 45% его содержания в крови. Однако мРНК-продукт этого же гена подвержена альтернативному сплайсингу, обусловленному наличием в экзоне 3 гена альернативного сайта сплайсинга (всего в этом гене и других генах этого кластера по 5 экзонов и 4 интрона), в результате которого получается более короткий вариант соматотропина, отличающийся от канонического выпадением аминокислотных остатков 32−46. В этом случае получающийся вариант, включающий 176 аминокислотных остатков и имеющий молекулярную массу 20 274Да — это 20К-GH (скорее, также образуется через прогормон, аналогично укороченный). Эта изоформа имеет более низкое процентное содержание как в гипофизе (6% от всего гормона роста), так и в плазме крови (у человека 5%). Иногда происходит ещё большее укорочение молекулы — при альтернативном сплайсинге выпадает весь экзон 3 (аминокислотные остатки 32−71) и образуется изоформа массой 17 483Да, но она в значительном количестве обнаружена лишь у некоторых пациентов с генетическим дефицитом гормона роста II типа. Кроме того, белки — продукты GH1 — гена могут агрегировать и образовывать димеры и даже олигомеры, существование которых отмечено как в самом гипофизе, так и в плазме крови. При этом встречаются диссоциабельные дии олигомеры, в которых мономерные молекулы гормона связаны нековалентными связями, и недиссоциабельные, в основном связанные при помощи дисульфидных связей. Например, содержание в гипофизе диссоциабельных димеров составляет 10% от всего количества соматотропина, диссоциабельных олигомеров — 5%; в плазме крови концентрация таких 22К-GH димеров составляет 14%, 20К-GH димеров — 3%, олигомеров разных вариантов около 9%. Что касается димеров и олигомеров, в которых молекулы мономеров соматотропина связаны дисульфидными связями, их концентрации меньше и составляют следующие значения: в гипофизе димеры, образованные при связывании мономеров друг с другом S-S мостиками — 7%, такого же рода олигомеры — 2%; в плазме крови 22К-GH аналогичного типа димеры — 6%, 20К-GH — 2%, олигомеры — 4%. Кроме того часть этих белков проходит дополнительные посттрансляционные модификации, происходящие скорее всего неферментативно. Точно установлен пока факт дезаминирования in vivo остатков глутамина-137 и аспарагина-152 (считая по нумерации в 22К-GH). При этом образуются так называемые «кислые» изоформы соматотропина. Форма с дезаминированным аспарагином встречается в гипофизе с частотой 6% от всего количества гормона, с дезаминированным глутамином — 2%. Мономерные дезаминированные формы присутствуют в крови в концентрации до 5%, димерные дезаминированные формы — 2%, олигомерные дезаминированные формы — 2%.

Рисунок 1. Химическая структура гормона роста на примере основной изоформы, 22кДа

Последовательность аминокислот, выделенная жирной линией (32−46), отсутствует в 20кДа изоформе, двумя звёздочками показаны возможные сайты дезаминирования гормона, остатки, подписанные сбоку, соответствуют аминокислотным заменам в GH-V изоформе по сравнению с основной. Древовидным знаком показан остаток Асн-140, гликозилированный лишь в GH-V изоформе; показаны жирными линиями внутримолекулярные дисульфидные связи.

Обобщая вышесказанное, гипофизарный вариант гормона роста GH-N содержится преимущественно в 22К-GH изоформе (от 58 до 82%, в среднем около 72% от концентрации всего гормона роста, считая как его мономеры, так дии олигомеры), и в меньшей степени в виде 20К-GH (3−15%, в среднем 5,2%, мономеры, дии олигомеры).

Продукт гена GH2 — это белок GH-V. Эта изоформа гормона роста экспрессируется предпочтительно, если не исключительно в синцитиотрофобласте плаценты и поэтому называется «плацентарным гормоном роста». Гормон освобождается в материнский (но не плодный) кровоток, тормозит биосинтез GH-N изоформы в гипофизе. Наличие его отмечено только в крови беременных женщин (самок млекопитающих), у женщины начинает продуцироваться на 5−8 неделе беременности и достигает максимальной за 4 недели до окончания срока беременности, когда его концентрация в крови достигает 13−22нг/л. Сразу нужно отметить, что его синтез и секреция, в отличие от синтеза и секреции GH-N изоформы находится не под гипоталамическим контролем и регуляторы этого процесса пока неизвестны. По первичной структуре GH-V изоформа гормона роста отличается от гипофизарной по 13 аминокислотным остаткам, имеются следующие замены: гистидин-18 заменен на аргинин, гистидин-21 на тирозин, фенилаланин-25 на тирозин, пролин-37 на лейцин, глутамат-65 на валин, глутамат-66 на лизин, фенилаланин-92 на лейцин, аспартат-112 на аргинин, лейцин-113 на гистидин, глутамат-126 на триптофан, лизин-140 на аспарагин, треонин-142 на серин, аспартат-150 на лизин. Особое значение, по-видимому, имеет замена лизина-140 аспарагином, поскольку этот аминокислотный остаток у GH-V часто гликозилирован, а GH-N гликозилируется лишь в следовых количествах. О тенденции GH-V к олигомеризации известно очень мало.

В кластере есть ещё три гена. Два из них кодируют близкие к гормону роста по структуре белки — два варианта хорионического соматомаммотропина, или плацентарного лактогена (CS1 и CS2), а при экспрессии последнего гена кластера получается CS-подобный пептид, его обнаруживают в крови в следовых концентрациях. Не исключено, что этот последний ген является псевдогеном без определённой биологической функции. Все пять геном кластера возникли в эволюции, скорее всего, путём неоднократной дупликации одного и того же гена [2], о чём говорят крайне высокая гомология их первичной структуры, расположенность в одном локусе хромосомы, одинаковой число интронов (четыре) и экзонов (пять).

Несмотря на наличие столь большого числа изоформ, считают, что все они имеют примерно одинаковую третичную структуру, включающую 4 б-спирали, хотя в 20К-GH конец первой (с N-конца) б-спирали и часть пели между первой и второй спиралями отсутствует.

Синтез гипофизарного гормона роста регулируют, по-видимому, многие факторы, в том числе вещества пептидной природы и нейромедиаторы, а также он сам по «короткой петле» отрицательной обратной связи. К настоящему моменту времени наиболее прояснён механизм регуляции синтеза гормона роста через регуляцию транскрипции его GH1 гена соматотропин-релизинг гормоном (соматолиберином). Этот гормон представляет собой пептид из 40 или 44 аминокислот, синтезируемый в аркуатном (воронкообразном) и вентромедиальном ядрах гипоталамуса. Соматотропин-релизинг гормон принадлежит к семейству «мозгокишечных» (brain-gut) пептидных гормонов, как и большинство из них имеет остаток гистидина на Nи изолейцина на С-конце. Аркуатное и вентромедиальное ядра иннервируется дофамини холинергическими нейронами. Аксоны этого ядра идут в так называемые срединные возвышения гипоталамуса, где из них в портальную сосудистую систему высвобождается соматотропин-релизинг гормон. Портальная сеть включает в себя первичную капиллярную сеть, которая контактирует с терминалями нейронов многих ядер гипоталамуса, в том числе и вышеназванных, и переходит в портальные вены, идущие вдоль гипофизарной ножки в аденогипофиз, где распадаются на вторую капиллярную сеть, вены от которой уже идут в общий кровоток. Соматотропин-релизинг гормон поступает в эту портальную сеть и по ней достигает соматотрофоцитов, связываясь на них со своим специфическим рецептором, обозначаемым сокращённо GHRHR (от growth hormone releasing hormone receptor). Этот рецептор представляет из себя трансмембранный белок, включающий 7 трансмембранных доменов (423 аминокислотных остатка), N-конец внеклеточный и гликозилированный, а С-конец цитоплазматический, белок имеет пальмитолированный остаток цистеина вблизи С-конца.

Рецептор GHRHR сопряжён с G_s — белком. G-белки — это гетеротримеры, связанные с цитоплазматической мембраной клеток-мишеней (со стороны цитоплазмы), состоят из б-цепи (молекулярная масса 40−50кДа), непрочно связанной с димером вг, где в-субъединица имеет молекулярную массу 35кДа, прочно связана с г-субъединицей (8кДа). Именно б-субъединица определяет специфичность взаимодействия белка с рецептором и эффектором. При активации G-белка посредством его взаимодействия с комплексом рецептор-агонист (в данном случае GHRHR-GHRH) происходи обмен ГДФ в активном центре б-субъединицы на ГТФ, и она теряет сродство к вг-комплексу. Субъединица б белка G_s при активации отходит от вг-комплекса (но остаётся связанной с плазматической мембраной, поскольку её конец N-миристилирован, миристиловая кислота заякоривает белок в мембране) и активирует аденилатциклазу.

Почти все гормонрегулируемые аденилатциклазы — интегральные белки плазматической мембраны, гликопротеины с молекулярной массой от 110 до 180кДа (известно минимум 8 их изоформ). Белки имеют 12 трансмембранных доменов, сгруппированных в две группы (по 6 в каждом, обозначаются как домены М1 и М2), между которыми лежит С1 — цитоплазматический домен, в котором за связывание АТФ ответственен субдомен С1a. После М2 — домена идёт цитоплазматический С-концевой С2 домен, его субдомен С2а взаимодействуя с С1а образует сайт, катализирующий реакцию образования цАМФ из АТФ. Таким образом GHRHR, связываясь с соматотропин-релизинг гормоном, через G_s — белок активирует аденилатциклазу и повышает в клетке концентрацию цАМФ. В результате активируется протеинкиназа А. Этот белок прикреплён к мембране (с помощью остатка миристиловой кислоты или AKAP — cAMP dependent protein kinase anchoring protein) и имеет две регуляторные и две каталитические субъединицы. В присутствии регуляторных субъединиц каталитические субъединицы протеинкиназы не фосфорилируют белки-мишени, но в присутствии цАМФ регуляторные субъединицы, связываясь с ним, теряют сродство к каталитическим и те могут фосфорилировать белки-мишени.

После увеличения концентрации цАМФ в клетках соматотрофоцитов происходит увеличение входящего Na⁺ — тока и деполяризация мембраны (скорее всего Na⁺ — каналы этих клеток являются мишенью протеинкиназы А). Деполяризация открывает потенциалзависимые Ca²⁺ — каналы, что в итоге ведёт к увеличению концентрации Ca²⁺ в этих клетках и усилению экзоцитоза везикул с соматотропином, то есть к увеличению его секреции. Но что даже более важно, протеинкиназа, А фосфорилирует и активирует CREB — транскрипционный фактор (cAMP response element binding protein, то есть белок, связывающий элементы цАМФ-ответа, имеются в виду элементы ДНК). Именно этот транскрипционный фактор ответственен за усиление продукции гормона роста и рецептора к соматотропин-релизинг гормону de novo в соматотрофоцитах.

Рисунок 2. Молекулярный механизм действия соматотропин-релизинг гормона (GHRH) на синтез и секрецию гормона роста (GH)

Здесь GHRHR — рецептор соматотропин-релизинг гормона (и его ген), Gsб — б-субъединица G-белка, стимулирующая аденилатциклазу, PKA — протеинкиназа А, GH1 — ген основной изоформы гормона роста, CREB — белок, связывающий элементы цАМФ-ответа.

Антагонистом соматотропин-релизинг гормона является соматостатин. Соматостатин действует через свой специфический рецептор, угнетая синтез и секрецию гормона роста. Исходя из данных [3] механизм действия соматостатина заключается, скорее всего, в том, что его связанный с агонистом рецептор через G_i — белок ингибирует аденилатциклазу.

Интересно, что помимо CREB синтез транскрипцию гена гормона роста играет другой фактор — PIT1 (или POU1F1), член белков семейства POU — транскрипционных факторов, участвующих в регуляции транскрипции не только гена соматотропина, но и пролактина, в-субъединицы тиреотропного гормона. В свою очередь в раннем эмбриогенезе экспрессия РIT-1 связана с PROP-1 (Prophet of PIT-1, «предсказатель PIT-1»). PROP-1 в эмбриогенезе важен как триггер, запускающий синтез гормона роста.

Все остальные эффекторы влияют в большей степени именно на секрецию гормона роста, поэтому их целесообразнее рассмотреть далее.

3. Секреция гормона роста

Секреция гормона роста осуществляется по механизму экзоцитоза секреторных везикул. Секреция гормона роста соматотрофоцитов имеет ту характерную особенность, что она носит пульсирующий характер, причём это явление, как считается вызвано не особенностями метаболической регуляции секреции гормона роста, а связано с регуляцией его секреции гипоталамусом, активация медиальной преоптической области которого (нейроны вырабатывают соматостатин) ингибирует секрецию гормона роста, а активация аркуатного и вентромедиального ядра (вырабатывают соматотропин-релизинг гормон) активируют. Пульсовая активность же этих ядер может быть связана с особенностями их регуляции ядрами ствола мозга и лимбической системой.

Наиболее полно изучен ритм секреции у крыс. Здесь особенность состоит ещё и в разных ритмах секреции гормона у самцов и самок. У самцов крыс гормон секретируется строго периодически, с подъёмами каждые 3−4 часа, причём во время этих всплесков концентрация гормона в крови может доходить до 500−1000нг/мл, но после такого скачка следует период 30−90 минут, во время которого концентрация гормона роста в крови опускалась ниже 5нг/мл, то есть разница между периодом пика и спада достигает более двух порядков. Секреторный профиль соматотропина у самок имел менее регулярный характер, пики наблюдались каждые 1−2 часа, но были весьма различны по величине. Более того обнаружено. что у самок крыс во время этих пиков концентрация гормона роста не превосходила 300нг/мл, но зато в межпиковые состояния концентрация гормона роста была выше, чем в аналогичные периоды у самцов — 10−20нг/мл, да и сами периоды между пиками были короче (15−30 минут). То есть при схожем периодизме секреции соматотропина у самцов всплески были более резкими и частота их была меньше. чем у самок.

У остальных животных (мыши. кролики, собаки, макаки-резусы, бабуины) и у людей также наблюдается пульсовая секреция гормона роста. Причём отмечены аналогичные различия между самцами и самками, хотя и не такие явные, как у крыс. Хотя пульсовая секреция гормона роста определяется гипоталамусом, на неё влияют половые стероидные гормоны. Так у кастрированных самцов крыс паттерн секретиции был близок к таковому у самок, причём чем раньше была проведена кастрация, тем больше был этот эффект, а в случае кастрации во взрослом состоянии паттерн секреции гормона у самцов не менялся. Из этого и некоторых других данных заключают, что стероидные гормоны меняют в раннем периоде развития (на всю дальнейшую жизнь) чувствительность соматотрофоцитов к гормону роста (то есть к механизму регуляции его секреции по короткой петле обратной связи).

Физиологическое значение разных паттернов секреции самцов и самок не ясно. Возможно, оно необходимо для детерминации длины тела и веса взрослых животных [12], согласно другому предположению оно необходимо для транскрипции в органах-мишенях генов цитохрома Р-450 изоформ 2С11 и 3А10 у самцов, в то время как секреция в менее «резком» пульсовом режиме у самок приводит к транскрипции преимущественно генов изоформы Р-450 2С12.

У человека гормон роста также секретируется в пульсовом режиме, интервалы составляют 20−30 минут, один из наибольших пиков отмечается вскоре после засыпания. У нерастущих взрослых людей концентрация гормона роста в крови обычно до 10нг/мл. хотя под влиянием белковой диеты и физических упражнений может повышаться до 30−100нг/мл.

Кроме соматотропин-релизинг гормона и соматостатина на процесс секреции, как оказалось, влияют и другие вещества. Одно из них — это грелин.

Довольно давно было замечено, что морфин, эндорфины и энкефалины увеличивают секрецию гормона роста. Но сравнительно недавно (в 1999 году) были прояснены сведения по поводу специфических рецепторов на соматотрофоцитах, через которые осуществляется их влияние, и об естественном лиганде этих рецепторов. Оказалось, что в различных отделах желудочно-кишечного тракта человека, и в значительно меньшей мере в аркуатном и вентромедиальном ядрах гипоталамуса синтезируется небольшой 28-аминокислотный пептид грелин. Синтез его идёт через более длинный предшественник из 117 аминокислот, ген его у человека располагается в 3-й хромосоме (3q25−26). В результате альтернативного сплайсинга может вырабатываться и его 27-аминокислотный вариант. Интересно, что по третьей аминокислоте его происходит необычная посттрансляционная модификация — октаноирование (присоединение остатка октановой, или каприловой кислоты), совершенно необходимое для проявления его биологической активности.

Рецептор грелина соматотрофоцитов (GHSR, growth hormone secretagogue receptor, то есть рецептор стимулятора секреции гормона роста) — белок с 6−7 трансмембранными доменами (есть две изоформы рецептора — длинная, с 7 трансмембранными доменами и 366 аминокислотными остатками, GHSR1a, и более короткая, скорее с 6 трансмембранными доменами и 289 аминокислотными остатками, GHSR1b, большую роль в регуляции секреции гормона роста имеет длинная изоформа). Ещё пока полностью не прояснён молекулярный механизм действия грелина через свой рецептор, но уже многое точно ясно, например что его эффекты Mg²⁺ и ГТФ-зависимы. Есть данные, что рецептор грелина сопряжён с G-белком, стимулирующим фосфолипазу С, которая гидролизует фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат до диацилглицерола и инозитол-1,4,5-бисфосфата, последний является Ca²⁺ — высвобождающим (из эндоплазматического ретикулума) агентом, а диацилглицерол и Ca²⁺ активируют протеинкиназу С.

Протеинкиназа С — мономерный белок, который в неактивном состоянии находится в цитозоле. а в активном прикреплён к мембране. Существует около 12 различных изоформ протеинкиназы, наиболее часто встречающиеся — это б, в1, в2 и г. Последовательность различных доменов в их молекулах следующая: с N-конца идёт небольшой домен, так называемый «псевдосубстрат»; далее идёт более длинный С1-домен, его функция заключается в связывании диацилглицерола, в этом домене вторичная структура образует так называемый «цинковый палец», представляющий из себя структуру из 20 аминокислотных остатков, в которой на ближних Nи C-концах находятся соответственно два остатка цистеина и два остатка гистидина, связывающиеся с одним ионом Zn²⁺, средняя же часть данной структуры образует б-спиральный участок, связывающий лиганд (здесь диацилглицерол), так называемый «палец». Сразу же за доменом С1 следует домен С2, главная функция которого — связывать Ca²⁺, причём после его связывания он приобретает сродство к фосфатидилсерину плазматической мембраны. С3 и С4 домены, расположенные ближе к С-концу, это собственно каталитический центр фермента, причё С3 ответственен за связывание АТФ, а С4 — за сам процесс фосфорилирования. В отсутствии Ca²⁺ фермент находится в неактивной форме. поскольку доступ субстрата к каталитическому сайту закрывает «псевдосубстратный» домен, но при увеличении концентрации Ca²⁺ домен С2, присоединяя его и приобретая сродство к фосфатидилсерину, опосредует связывание белка с плазматической мембраной; далее С1-домен связывает диацилглицерол в мембране, что ещё больше увеличивает сродство фермента к мембране и его активность, поскольку изменяет конформацию белка так. что его «псевдосубстратный» домен больше не может блокировать каталитический центр; фермент переходит в активную форму [10−11].

Протеинкиназа С фосфорилирует в соматотрофоцитах некие белки-мишени, в любом случае конечный эффект грелина, опосредованный ею, заключается в усилении экзоцитоза секреторных везикул. Точно установлено, что грелин не индуцирует транскрипцию гена GH1 в соматотрофоцитах, он влияет лишь на секрецию гормона роста, а не на его биосинтез [3], в отличие от соматолиберина.

На секрецию гормона роста влияют и другие гормоны. Например вазопрессин стимулирует его секрецию. Долгое время эффект считался малозначимым физиологически. пока в 1973 году не обнаружили вазопрессин в портальной системе. Тогда возникла версия, что при некоторых стрессовых ситуациях вазопрессин может высвобождать гормон роста. Точно известно, что стимулирует секрецию соматотропина глюкагон. б-меланоцитстимулирующий гормон оказывает аналогичное влияние, но специфичность этого явления и его значение неизвестны. Субстанция Р может приводить к высвобождению гормона роста и пролактина, но её влияние опосредуется гипоталамусом.

Нейромедиаторы через нейроны гипоталамуса регулируют секрецию гормона роста. Норадреналинэргические нейроны в гипоталамусе присутствуют в паравентрикулярном, медиальном преоптическом, переднем гипоталамическом, супрахиазматическом и некоторых других ядрах. Норадреналин и его агонисты через гипоталамус стимулируют секрецию гормона роста, причём большое значение играют б-адренергические механизмы. Дофаминовые нейроны в гипоталамусе располагаются в аруатном и паравентрикулярном ядре. Их возбуждение стимулирует секрецию гормона роста, но внутривенное введение дофамина и его агонистов ингибирует секрецию. Поэтому некоторые из агонистов дофамина (апоморфин, L-допа, бромокриптин) используют в лечении акромегалии. Возможно их прямое влияние на гипофиз. Серотонин через гипоталамус стимулирует секрецию гормона роста, а гистамин ингибирует.

4. Гормон роста в крови

Из капиллярной сети гипофиза гормон роста поступает в общий кровоток и перераспределяется в нём. Как было сказано выше. гормон роста гипофиза имеет две основные изоформы — 22К-GH и 20K-GH, и кроме того может присутствовать в крови в виде олигомеров. Как оказалось, T_½ 20K-GH несколько больше, чем 22К-GH у человека и крыс, хотя для морской свинки это не было отмечено. Но больше T_½ (период полужизни гормона в плазме крови) зависит от олигомеризованности. Для мономера он равен 19 минутам, для димера 26,5 минутам, для олигомеров около 45 минут.

Но самое интересное оказалось, что значительная часть фракции гормона роста в крови находится в связанном состоянии с так называемым GHBP — growth hormone binding protein (белок, связывающий гормон роста). Впервые данных, говорящие об этом, были получены ещё в 1960;х годах. но подвергнуты критике, поскольку считалось. что все белковые и пептидные гормоны должны находиться в крови лишь в свободном состоянии. Но позже существование GHBP пришлось признать. Оказалось, что имеются два белка, связывающих гормон роста. Один из них связывает его с низкой активностью, это низкоаффинный GHBP, он идентичен б₂ — макроглобулину [2,4,13]. Концентрация этого б₂ — глобулина в крови 2,6г/л [10], но связывает он гормон роста с Ка порядка нескольких милимоль. Второй белок — высокоаффинный GHBP, или просто GHBP. Остановлюсь подробней именно на нём.

Этот белок оказался идентичен внеклеточному (N-концевому) домену белка — рецептора к гормону роста (GHR — growth hormone receptor). Соответственно он кодируется одним с ним геном. У людей есть две разновидности GHBP, отличающиеся на 21 аминокислотный остаток. Молекулярная масса GHBP человека 60−65кДа, а у цыплёнка всего 28кДа. Белок человека очень сильно гликозилирован, собственно полипептидная цепь в нём имеет массу лишь 28−30кДа. Белок обнаружен не только в крови. но и в моче, амниотической жидкости, молоке, семенной жидкости, но не в цереброспинальной. Но даже в крови белок находится в низких концентрациях, поэтому преимущественно формирует комплекс с соматотропином в соотношении 1:1. GHBP образуется по двум основным механизмам: в результате альтернативного сплайсинга гена рецептора GHR или в результате протеолитического расщепления уже встроенного в плазматическую мембрану рецептора GHR.

У крыс, мышей, коров, свиней идёт механизм образования GHBP альтернативным сплайсингом. К крыс и мышей ген GHR содержит между экзонами 7 и 8 в интроне специальный встроенный экзон 8А, кодирующий гидрофильную последовательность аминокислот (27 у крыс и 17 у мышей), и при сплайсинге возможно «отрезание» от мРНК участка после 8А-экзона, поэтому белок рецептора синтезируется не только укороченным (без цитоплазматического), но и с заменой гидрофобного трансмембранного домена на гидрофильный. что и позволяет ему секретироваться в кровь. У макак-резусов экзона 8А не найдено, продукция GHR у них возможна при прочитывании сразу после экзона 7 части интрона 7/8, при этом трансмембранного домена при трансляции такой мРНК вновь не образуется (у макак-резусов установлен и протеолитический механизм образования GHBP).

У людей, кроликов и некоторых других видов преобладает протеолитический механизм образования GHBP. На включённый в мембрану (в плазматическую, хотя не исключают возможность прохождения процесса и во внутриклеточных компартментах) действует особая металлопротеиназа TACE (TNFб — converting enzyme, синоним ADAM-17), которая осущесвляет протеолитическое расщепление рецептора в примембранном участке внеклеточного его домена (точное место расщепления ещё не установлено, но ясно, что важную роль здесь играет остаток цистеина-241 молекулы рецептора), в результате чего внеклеточный домен рецептора как бы «сбрасывается», «сбривается» (процесс «shedding»). Этот домен становится свободным и уходит в кровоток (межклеточную среду) и становится собственно GHBP. Остальная часть рецептора, уже нефункционабельная, остаётся связанной с мембраной. TACE-протеаза может осуществлять ограниченный протеолиз и других цитокиновых рецепторов.

С высокоаффинным GHBP в среднем у человека связано 47% 22К-GH мономера, 10% 20K-GH мономера. С б₂-макроглобулином (низкоаффинным GHBP) соответственно 4% и 40%. Для дии олигомеров эти проценты не ясны. Поскольку 22К-GH изоформа гормона преобладающая, то получается, что гормон роста связан в основном с высокоаффинным GHBP, хотя его 20К изоформа связывается преимущественно с б₂ — макроглобулином. В целом у человека 45% всего гормона роста связано с GHBP, но на пике секреции гормона это количество может достигнуть 80%.

2/3 гормона роста элиминируется через почки, но в проксимальных извитых канальцах нефрона идёт его интенсивная реабсорбция и деградация (поэтому гормон роста хотя и присутствует в моче, но в очень малых количествах) [2], но комплекс GH-GHBP слишком громоздкий (молекулярная масса 85кДа) для того чтобы попасть в первичную мочу, и поэтому элиминируется медленнее из крови. Поэтому средняя продолжительность существования мономера GH в крови человека 19 минут как бы среднее из двух Т_½ — периода полужизни не связанного с GHBP гормона — 7 минут, и периода полужизни связанного с GHBP — 27 минут.

В виду вышеназванного скорее всего основная роль GHBP состоит в «забуферивании» концентраций активного гормона роста, что предотвращает её чрезмерные колебания при пульсовой секреции и что более важно — в пролонгировании действия гормона роста. Интересно, что у самок млекопитающих (больше для крыс, в меньшей степени это характерно для мышей, кроликов и людей) установлено более высокое содержание GHBP плазме крови, чем у самцов того же вида.

GHBP является внеклеточной частью GHR, который может существовать в плазматической мембране органов-мишеней гормона роста в мономерной и димерной форме. К передаче сигнала внутрь клетки способен лишь полноценный димер. Между внеклеточными частями GHR в димере есть нековалентные взаимодействия. Поэтому GHBP может вступать в аналогичные взаимодействия с внеклеточными доменами GHR на мембранах, например клеток печени, что приводит к формированию «неполноценных» рецепторов соматотропина, которые могут его связывать, но к внутриклеточной передаче сигнала не способны. Поэтому синтез GHBP может служить механизмом отрицательного регулирования действия гормона роста. Важно и то, что связанная в данный момент с GHBP молекула гормона роста не может взаимодействовать одновременно со своим рецептором из-за конкуренции за участки связывания на молекуле гормона роста для GHR и GHBP.

У крыс (да, скорее всего и у других млекопитающих) основной источник GHBP — это печень. Предполагается, что его может вырабатывать и висцеральная жировая ткань. У всех исследованных по этому поводу млекопитающих GHBP секретируется больше у юных животных и при переедании. Действие других факторов у разных видов неоднозначно. Например, эстрогены у крыс повышают, а у кроликов понижают количество GHBP в плазме крови; гонадолиберин повышает его количество у человека, а у крыс понижает. Инсулин и гормон роста потенцируют его синтез у грызунов, но не у человека.

Теперь можно перейти к молекулярным механизмам действия соматотропина.

5. Молекулярный механизм действия и биологические эффекты гормона роста

5.1 Рецептор гормона роста и сопряжённые с ним белки

Рецептор гормона роста на клетках — мишенях представляет собой интегральный белок плазматической мембраны клеток-мишеней с одним трансмембранным доменом, Nконец расположен вне клетки, С-конец внутриклеточный. Этот рецептор принадлежит к суперсемейству белков — рецепторов цитокинов/гемопоэтинов, куда помимо него относятся, например, рецепторы к пролактину. эритропоэтину, гранулоцитарному колониестимулирующему фактору, гранулоцит-макрофагальному колониестимулирующему фактору, интерлейкинам 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 12 и некоторые другие.

Рецептор гормона роста имеет молекулярную массу (мономер) 130кДа, 6 потенциальных сайтов для гликозилирования во внеклеточном домене, 6 остатков цистеина там же, связанных между собой S-S связями и один свободный остаток цистеина. Существует две точки зрения на организацию рецептора в мембране, согласно традиционной в отсутствие гормона рецептор представляет собой мономер, а при связывании гормона роста димеризуется (два рецептора связывают одну молекулу гормона) [4,7,10], но в последнее время приводятся сведения о том, что и в отсутствие гормона рецептор находится в димерном состоянии.

Внеклеточные участки рецептора гормона роста имеют два фибронектиновых домена III типа, это домены в-складчатой сендвичевой структуры, соединённые коротким подвижным линкерным участком. Эти два домена занимают аминокислотные участки в молекуле с 43-го по 218-й, причём образуют они как бы два обособленных в первичной структуре, но по-видимому представляющих в третичной структуре единый сайт связывания, включают они по 33 и 31 аминокислотных остатка. При этом вначале при связывании соматотропина участвует лишь первый (из 33 аминокислотных остатков) сайт связывания, а затем второй. В димере гормона роста один из мономеров связывает гормон с сильной аффинностью, а другой — со слабой. Для проведения сигнала внутрь клетки димеризация рецептора (смотри рисунок № 3) крайне необходима. По этой причине гормона роста в больших концентрациях может быть «самоантагонистом» [4], поскольку стехиометрические соотношения его и его рецептора будут не 1:2, а например 1:1, то есть каждая его молекула свяжется лишь с одной рецепторной молекулой и не будет проводить сигнал в клетку-мишень, хотя если рецептор является димером изначально, то «самоантагонизм» не будет наблюдаться.

Как и все белки семейства рецепторов цитокинов/гемопоэтинов, рецептор гормона роста вблизи трансмембранного домена во внеклеточной части имеет так называемый WSXWS-мотив (последовательность аминокислотных остатков триптофан-серин-Х-триптофан-серин, где Х — любая аминокислота). Присутствие его совершенно необходимо как для связывания гормона роста, так и для дальнейшей передачи сигнала, причём критическими для передачи сигнала являются первый остаток триптофана и последний серина. У цыплят при мутации рецептора гормона роста, приводящей к замене этого серина на изолейцин, рецептор теряет сродство к гормону и развивается синдром карликовости цыплят, сцепленный с полом.

Выше были кратко охарактеризованы несколько изоформ гормона роста. Несмотря на то, что у них третичная структура всё же несколько различается, хотя и незначительно, пока не выявлено какого-либо существенного отличия в их биологических эффектах, все они связываются одинаково с рецептором гормона роста, хотя есть сведения [3], что 20K-GH имеет меньшее сродство к рецептору, чем 22K-GH. 20K-GH у человека при связывании с рецептором в клетках-мишенях осуществляет в основном те же биологические эффекты, что 22K-GH, единственное что пока не полностью доказана его способность индуцировать пролиферацию, в то время как для 22K-GH это один из основных биологических эффектов. Аффинность GH-V изоформы к рецептору гормона роста сопоставима с аффинностью 22K-GH, но он в меньшей степени стимулирует родственные пролактиновые рецепторы. Насчёт дии олигомерных форм гормона роста данные о их биологической активности варьируют, называют числа от 20 до 100% активности мономерной формы.

Во внутриклеточной части рецептора наиболее важны для передачи сигнала следующие домены (по направлению к С-концу): Lyn, box1 и box2 [9,10] (рисунок № 3). Lyn — домен практически вплотную прилегает к трансмембранному домену. При активации рецептора этот домен активирует Lyn-киназу, белок из семейства Src — киназ. Данная киназа с участием малых ГТФазных белков RalA и RalB активируют киназы ERK½ (p44/42MAPK), а те далее транскрипционный фактор Elk-1. Было также показано, что одновременно происходит активация и других регуляторных малых ГТФаз — Rap1 и Rap2, ингибирующих дальнейшую активацию ERK½. Бокс 1 в молекуле рецептора расположен ближе к С-концу, он имеет характерную для подобных рецепторов последовательность аминокислот Ш-X-X-X-Али-Про-Х-Про, где Про — пролин, Али — алифатическая аминокислота, Х — любая аминокислота, Ш — гидрофобная аминокислота. Например в рецепторе гормона роста млекопитающих последовательность эта следующая: изолейцин-лейцин-пролин-пролин-валин-пролин-валин-пролин. Бокс 2, располагающийся ещё далее, по первичной структуре характеризуется наличием кластера гидрофобных аминокислотных остатков, разбросанных среди кислых, и кончается двумя положительно заряженными остатками.

Рисунок 3. Структура рецептора гормона роста (димерная форма)

Фиолетовым изображены внеклеточные домены, синим — связанная молекула гормона роста, Y — остатки тирозина, важные для передачи сигнала внутрь клетки; показаны некоторые (не все) белки сигнальных путей, связанные с внутриклеточными участками рецептора.

Бокс 1 у цитокин/гемопоэтиновых рецепторов служит для связывания Янус-киназ (JAK), тирозиновых киназ [7,14]. Интересно рассмотреть сами молекулы Янус-киназ (JAK). Особенностью этих киназ является отсутствие в них SH2 или SH3-доменов в отличие от других нерецепторных тирозинкиназ. В их молекулах вместо этого присутствуют семь консервативных JH-доменов (JH 1−7, считая с Ск N-концу). Из них JH1 домен выполняет собственно каталитическую роль, а JH2 — роль псевдокиназного домена. В отсутствии активирующего стимула JH2 плотно контактирует с JH1-доменом, ингибируя его работу. Интересно, что их ближайший к N-концу JH7-домен по структуре похож на небольшой примембранный цитоскелетный белок эритроцитов — белок полосы 4.1., в некоторых других белках (эрзине, радиксине, моэзине) и в FAK (Focal adhesion kinase), ассоциированной с рецептором гормона роста через JAK-2. Значение этого домена в функционировании Янус-киназ пока не ясно, но установлено, что он может связывать фосфорилированные производные фосфоинозитола (фосфоинозитиды).

Показано, что связанный с лигандом гормон роста активирует именно JAK-2 киназу, хотя нельзя полностью исключать и активацию в небольшой степени других подобных киназ (JAK1, JAK3 и tyk2). Димеризованный при связывании с гормоном рецептор гормона роста также активирует две молекулы JAK-2.

Исходя из данных JAK2 киназа связана с рецептором гормона роста и тогда, когда он не связан с лигандом, но при этом JH2 её домен (JAK2-pseudokinase domain) контактирует с её каталитическим JH1 — киназным (ближайшем к С-концу JAK2) доменом и ингибирует её, что блокирует работу этой киназы. При связывании же с рецептором гормона роста две субъединицы его димера претерпевают конформационные изменения и, кроме того, поворачиваются друг относительно друга, что приводит к тому, что JAK2 — киназа активируется, её псевдокиназный домен уже не блокирует домен каталитический. При эактивации JAK2 происходит реакция «трансфосфорилирования», то есть две молекулы JAK2, связанные с рецептором, фосфорилируют друг друга и молекулу рецептора. Критическим для связывания с рецептором гормона роста у JAK2 является её N-концевая часть 1/3 полипептидной цепи. Мышиная JAK2 содержит 48 остатков тирозина в своем составе, но какие из них подвергаются фосфорилированию — пока точно не ясно. Более полно изучены сайты, фосфорилирующиеся на молекуле гормона роста. Так, у крыс в большей степени фосфорилируются остатки тирозинов 333 и 338 внутриклеточного домена гормона роста, у свиней чаще всего фосфорилирование идёт по тирозину 534.

JAK2 киназа при фосфорилировании активируется и активирует следующие основные сигнальные мессенджеры: МАР-киназы; IRS-белки; протеинкиназу С; Stat-белки. Рассмотрим их кратко далее.

5.2 Сигнальные пути, активируемые гормоном роста

Src-опосредованный сигнальный путь. Как было сказано выше, связавшись с лигандом, рецептор гормона роста через свой Lyn — домен активирует Lyn — киназу. Это — член семейства Src-киназ (тирозинкиназ), названные так потому, что впервые они были обнаружены в саркоме (sarcoma). В настоящее время известно около 9 таких киназ — Src, Fyn, Yes, Fgr, Lck, Hck, Lyn, Blk. В этих киназах, как и в других тирозиновых киназах, есть SH2 — домен, состоящий примерно из 100 аминокислотных остатков. Этот домен представляет собой «карман», к которому должен подходить фосфорилированный остаток тирозина. Показано, что этот домен после аутофосфорилировании рецептора связывается с его фосфорилированным тирозином, что приводит к активации Src-киназы. В данной киназе есть и очень похожий SH3-домен (около 60 аминокислотных остатков), который после активации киназы осуществляет активацию следующей киназы путём её фосфорилирования. Согласно данным далее этот белок при участии малых ГТФаз RalA и RalB активируют киназы ERK½ (Extracellular regulated kinases), хотя в непосредственным субстратом Src должен быть белок SHC. Белок SHC, скорее всего, активирует киназу MEK1 (MAP kinase/extracellular signal-regulated kinase), иначе именуемую как MAPKK (MAP konase kinase), которая в этом случае активирует MAP (рисунок № 4), а та (естественно, путём фосфорилирования) ERK1 (синоним p42/44 MAPK). Так или иначе, ERK1 активирует уже в ядре транскрипционный фактор Elk1 (а возможно, и другие, например Ets, Tcf, ATF2), которые обычно запускают транскрипцию генов «раннего ответа», и при действии гормона роста, скорее всего, происходит то же самое. Продукты данных генов названы так потому, что в клеточной культуре после действия митогена их концентрация достигает максимальной уже через 30 минут. Сами по себе продукты этих генов FOS и JUN — это также транскрипционные факторы, но специфичные в отношении уже так называемых «генов замедленного ответа». Среди продуктов этих генов в основном регуляторы клеточного цикла, например циклин D, Cdk4, Myc, Cdk25a.

Целесообразно здесь же рассмотреть функции этих белков. Центральную роль в регуляции клеточного цикла играют циклины и циклинзависимые киназы (Cdk, cyclin-dependent kinase). Циклинзависимые киназы — это те ферменты, которые фосфорилированием различных белков-мишеней регулируют ход митоза. Это — односубъединичные белки, находящиеся в неактивном состоянии вплоть до момента, когда с ними свяжется специальный белок — циклин. Название «циклин» пошло от того, что концентрация этих белков в клетке меняется циклически во время всего клеточного цикла. Циклин, связываясь с Cdk, не только активирует её, но и придаёт ей субстратную специфичность. Каждая циклинзависимая киназа образует комплекс со своим циклином. Комплекс циклин D — Cdk4 запускает клеточный цикл следующим образом. В неделящихся клетках присутствует белок pRb (от «ретинобластома» — опухоль, развивающаяся при его мутации), который в нефосфорилированном виде ингибирует комплекс двух транскрипционных факторов E2F-DP. Комплекс циклин D — Cdk4 фосфорилирует данный белок, и тот теряет сродство к комплексу транскрипционных факторов E2F-DP. Далее эти транскрипционные факторы, связываясь с промоторами соответствующих генов, индуцируют транскрипцию генов: ферментов синтеза и репликации ДНК (дигидрофолатредуктазы, тимидинкиназы, ДНК-полимеразы б, белка PCNA, закрепляющего комплекс полимераз на реплицируемой ДНК); циклинов Е и А, Cdk2 и Cdk1; ген самого транскрипционного фактора E2 °F; гены транскрипционных факторов для гена циклина В. Кроме того циклин D-Cdk4 комплекс фосфорилирует белок APC (anaphase-promoting complex), являющегося убиквитинлигазой, специфичной к циклину В. Фосфорилирование Cdk4 блокирует APC, предотвращая стимулируемое им разрушение циклина В. В синтетическом периоде клеточного цикла комплекс циклин Е-Cdc2 фосфорилирует и тем самым инактивирует ещё одни ингибиторы пролиферации — белки семейства KIP1 (p21, p27, p57), которые связываются с уже сформировавшимися комплексами циклин-Cdc и служат для предупреждения преждевременной репликации ДНК. Циклин А-Cdc2 комплекс фосфорилирует, как предположено в [15], некоторые белки формирующееся в точке начала репликации комплекса, ответственного за инициацию репликации ДНК, и репликация начинается. Что касается белка циклина В, то он образует комплекс с Cdk1, который для краткости обозначают как MPF — mitosis promoting factor — фактор, обеспечивающий митоз. Если говорить кратко, его работа заключается в фосфорилировании белков-мишеней, после чего начинается профаза митоза, переходящая в дальнейшие стадии его. Например, MPF фосфорилирует гистон H1, особые белки SMS (structural maintenance of chromosomes, белки, необходимые для поддержания структуры конденсированных хромосом) и, скорее всего, какие-то ещё белки, после чего начинается перестройка хроматина, его уплотнение и конденсация, что присуще стадии профазы. Также MPF фосфорилирует мономеры ламинов (белков, образующих ядерные филаменты, поддерживающие ядерную оболочку) и мономеры тубулина (из них при полимеризации образуются микротрубочки); первое приводит в конечном итоге к распаду ядерной оболочки и началу формирования веретена деления (конец профазы).