Рекомбинантные (химерные) ДНК

1. Рекомбинантные (химерные) ДНК

Создаваемые генными инженерами рекомбинантные ДНК называют химерными. Они были созданы для самых разнообразных целей, в том числе и для целенаправленого воздействия на ВИЧ. В последние годы число научных работ в этом направлении очень велико. Одна из испытанных схем с использованием химерных ДНК заключалась в следующем. К гену, кодирующему белок-рецептор CD4, «подшили» другой ген, который обеспечивает синтез растительного белка рицина. Рицин еще в средние века использовался в качестве сильнейшего яда. Попадая в клетку, он блокирует синтез белка в цитоплазме, тем самым убивая ее. После внесения в клетки такой рекомбинантной ДНК в конечном итоге происходит образование кодируемого ей химерного белка. Та его часть, которая соответствует белку-рецептору, обеспечивает строго специфическое связывание химеры с клетками, на поверхности которых содержится вирусный белок CD4. Другая же представляет собой яд рицин и уничтожает клетки, с которыми связывается химерная молекула. Таким образом, одна часть химеры обеспечивает направленный поиск в организме клеток, зараженных вирусом, а другая ее часть убивает их. Схема довольно проста и эффективна. В качестве «убийцы» можно использовать не только ген рицина, но и некоторые другие гены.

Другой подход к борьбе с ВИЧ-инфекцией основан на способности некоторых вирусных белков (Tat и Rev), чрезвычайно важных для размножения ВИЧ в клетках, специфически связываться с определенными участками молекулы вирусной РНК. Для того, чтобы предотвратить этот жизненно важный процесс, было предложено вводить в инфицированные клетки искусственно синтезированные РНК, содержащие участки связывания с вирусными белками. Вирусному белку все равно, с чем связываться — с вирусной РНК или точно такой же «копией», сконструированной искусствено. Добавленная в клетку в большом количестве, «копия» играет в данном случае роль «ловушки»: если ее много, белок вируса будет связываться преимущественно с ней, а не с РНК вируса, и, в результате этого, ВИЧ перестанет размножаться.

Теоретически описанные подходы выглядят очень привлекательно. И, как показали проведенные испытания, в изолированных клетках они работают очень хорошо. Однако нет надежных способов доставки и обеспечения долгого функционирования химерных «конструктов» в целом организме.

Указанные трудности ученые пытаются преодолеть с помощью тех же вирусов. Недавно опубликовано сообщение об успешном использовании для противодействия ВИЧ вируса бешенства. Естественно, это был не вирус сам по себе, а его вариант, который не способен приводить к заболеванию. К такому варианту был «пришит» ген белка CD4. В остальном схема была та же, что и в случае с рицином. Связываясь только с ВИЧ-инфицированными клетками, рекомбинантный вирус их уничтожал, другие же клетки оставались неизменными. Возможно, такой путь окажется эффективным в будущем.

Недавно появилось сообщение о создание еще одной «химеры» против ВИЧ на основе антиретровирусного препарата энфервиртид.

Энфервиртид представляет собой короткий фрагмент белка gp41 ВИЧ, который, несмотря на то, что он вроде как «родной», препятствует вирусу «сливаться» с клеткой. На основе ретровируса мышей сконструировали химерный вирус, который способен в клетках человека производить такой короткий фрагмент белка ВИЧ и «выставлять» его на поверхности клеток, зараженных химерным вирусом. В результате ВИЧ не может проникать в клетки даже при наличии в них всех рецепторов и корецепторов. Таким образом, фрагмент вирусного белка выступает в качестве «щита» против целого вируса. Очень важно, что защита срабатывает на самом начальном этапе инфицирования клетки. Ведь когда вирус уже проник в нее, с ним бороться практически невозможно. Начатые в клинике испытания новой «химеры», по утверждению исследователей, дали очень обнадеживающие результаты.

2. Конструирование рекомбинантных ДНК

Под рекомбинантными понимают ДНК, образованные объединением in vitro (в пробирке) двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников. Ключевыми в этом определении являются слова «фрагмент ДНК» и «объединение in vitro», что указывает на сущность генетической инженерии и ее отличие от всех остальных методов получения гибридных (или химерных) организмов, таких как генетическая селекция, эмбриональная инженерия и т. д.

Фрагменты ДНК, в том числе и фрагменты, содержащие гены, получают с использованием ферментов рестриктаз. Рестриктазы могут образовывать фрагменты как с тупыми, так и с липкими концами. Сшивка фрагментов ДНК производится тремя основными методами, зависящими от того, какие концы имеют фрагменты сшиваемых ДНК.

Сшивка по одноименным «липким» концам (рестриктазно лигазный метод)

Этот метод является самым распространенным и популярным. Впервые этим способом гибридная ДНК была получена С. Коэном с сотрудниками в 1973 году. Некоторые рестриктазы, например Pst I, внося в цепи ДНК симметричные, расположенные наискось друг от друга разрывы на равных расстояниях от центра сайта узнавания и образующие «ступеньку» (рис. 36). Эти комплементарные друг другу участки имеют тенденцию к ассоциации за счет спаривания оснований, и поэтому их называют комплементарными или липкими концами. Спаривание оснований происходит только между комплементарными последовательностями, поэтому ААТТ-концы, образуемые Eco RI, не будут спариваться, например, с АГЦТ-концами, образуемыми Hind III. Но любые два фрагмента (независимо от их происхождения), образовавшиеся под действием одной и той же рестриктазы, могут слипаться за счет образования водородных связей между однонитевыми участками комплементарных нуклеотидов (рис. 39).

Однако после такого спаривания полной целостности двойной спирали не восстановится, поскольку останется два разрыва в фосфодиэфирном остове. Для его восстановления, то есть сшивания, или лигирования нитей используют фермент ДНК-лигазу. Этот фермент в живой клетке выполняет ту же функцию — сшивание фрагментов ДНК, синтезирующихся при репликации.

Сшивка по «тупым» концам (коннекторный метод)

Липкие концы не абсолютно необходимы для связывания фрагментов ДНК. Тупые концы также могут быть соединены за счет действия ДНК-лигазы, если и лигаза, и тупые концы присутствуют в реакционной смеси в высоких концентрациях. В этом случае реакция лигирования имеет свои особенности и ее эффективность ниже, чем при сшивке по липким концам. Впервые такие эксперименты были выполнены в 1972 году Полем Бергом в Стенфордском университете, США. Липкие концы также можно ферментативным путем присоединить к молекулам ДНК с тупыми концами. Для этого используют фермент — концевую трансферазу из тимуса теленка, которая присоединяет нуклеотиды к 3 -концам цепей ДНК. Если к 3'-концам одного из рекомбинируемых in vitro фрагментов ДНК с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы достроить одноцепочечные олиго (dA)-сегменты определенной длины, а к концам другого фрагмента — олиго (dT)-сегменты примерно такой же длины, то при смешении полученных таким образом фрагментов происходит спаривание за счет образования водородных связей между олиго (dА) — и олигo (dT) -последовательностями (рис. 40). Для ковалентного соединения двух фрагментов используется ДНК-лигаза. Эти процедуры составляют основу для второго общего метода получения рекомбинантных молекул ДНК.

Поскольку можно формировать достаточно длинные взаимокомплементарные одноцепочечные концы, гибридные молекулы образуются с высокой эффективностью. В частности, поэтому при клонировании ДНК-копий матричных РНК, которые доступны в ограниченных количествах, обычно используют коннекторный метод. При таком способе соединения между фрагментами встраиваются участки ААААА. Такие дополнительные последовательности ТТТТТ могут влиять на функции соединяемых молекул и поэтому всегда, когда только возможно, для получения рекомбинантных молекул ДНК пользуются липкими концами, образовавшимися в результате действия рестриктаз.

Сшивка фрагментов с разноименными липкими концами

В ситуации, когда необходимо сшить фрагменты, образованные разными эндонуклеазами рестрикции, и имеющие разные, то есть некомплементарные друг другу липкие концы, применяют так называемые линкеры (или «переходники»). Линкеры — это химически синтезированные олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию. Впервые эту идею предложил Шеллер с сотрудниками в 1977 году.

Существуют большие наборы таких генных «переходников». Естественно, что при использовании линкеров должна учитываться необходимость соблюдения правил экспрессии генетической информации. Часто в середину линкера помещают какой-либо регуляторный генетический элемент, например, промотор или участок, связанный с рибосомой. В этом случае линкеры обеспечивают не только объединение генов, но и обуславливают их экспрессию. Существуют линкеры «тупой конец — липкий конец» .

При необходимости липкие концы можно превратить в тупые. Это достигается либо отщеплением липких концов с помощью фермента — эндонуклеазы S1, которая разрушает только одноцепочечную ДНК, либо липкие концы «застраивают», то есть с помощью ДНК-полимеразы I на однонитевых липких концах синтезируют вторую нить.

3. Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) ДНК

Описанные методы, позволившие идентифицировать генетически важные участки ДНК, имели большое значение сами по себе. Но они также проложили путь к разработке исключительно эффективных методов секвенирования ДНК и создания рекомбинантных молекул. Секвенирование позволяет довольно быстро определить полную нуклеотидную последовательность сегмента длиной 100 — 500 нуклеотидных пар, образующегося при расщеплении ДНК рестрикционными эндонуклеазами.

Метод Маскама и Гилберта (химический) Один из методов основан на химической деградации ДНК. Он был предложен в 1976 году Максамом и Гилбертом и назван их именем. Суть метода сводится к следующему: один из концов фрагмента ДНК метят с помощью изотопа фосфора 32Р. В последнее время вместо радиоактивной вводят флюоресцирующую метку. Ее можно «цеплять» и к нуклеотидам, причем для каждого типа нуклеотидов подбирать различную окраску. Препарат меченой ДНК делят на четыре порции и каждую из них обрабатывают реагентом, специфически разрушающим одно или два из четырех оснований, причем условия реакции подбирают таким образом, чтобы на каждую молекулу ДНК приходилось лишь несколько повреждений.

Разрушение идет в 2 этапа. На первом этапе происходит модификация азотистого основания и последующее выщепление его. На втором этапе производят гидролиз ДНК в местах выщепления оснований. Пуриновые основания модифицируются диметилсульфатом. Адениновые остатки метилируются по третьему атому азота, гуаниновые — по положению N7. Если такую модификацию обработать 0,1 М HCl при 0оС, то выщепляется метиладенин. При последующей инкубации в щелочной среде (0,1 М NaOH) при температуре +90оС происходит разрушение сахаро-фосфатной связи в местах выщепления оснований. Обработка поврежденных молекул пиперидином приводит к гидролизу ДНК по остаткам метилгуанина. Пиримидиновые основания модифицируются гидразином. В бессолевой среде модифицируется и цитозин, и тимин, в присутствии 2 М NaCl модифицируется только цитозин. При дальнейшей обработке пиперидином происходит расщепление ДНК по точкам модификации. Можно использовать и другие реакции химической модификации оснований и расщепления по ним молекул ДНК. В результате получается набор меченых фрагментов, длины которых определяются расстоянием от разрушенного основания до конца молекулы. Фрагменты, образовавшиеся во всех четырех реакциях, подвергают электрофорезу в четырех соседних дорожках; затем проводят радиоавтографию, и те фрагменты, которые содержат радиоактивную метку, оставляют «отпечатки» на рентгеновской пленке. По положению отпечатков можно определить, на каком расстоянии от меченого конца находилось разрушенное основание, а зная это основание — его положение. Так набор полос на рентгеновской пленке определяет нуклеотидную последовательность ДНК. Аналогично наблюдают флюоресцентное окрашивание. Если для каждого из четырех нуклеотидов был подобран свой цвет флюоресцентной метки, то при электрофорезе их наносят на 1 дорожку. Тогда расположение нуклеотидов отмечено штрихами разного цвета, а процедуру считывания легко автоматизировать.

Метод Сэнгера (ферментативный) Другой метод, разработанный Сэнгером и носящий его имя, основан не на химическом, а на ферментативном подходе. Cэнгер использовал ДНК-полимеразу I. В клетке этот фермент участвует в процессе репликации, заполняя пробелы между вновь синтезированными фрагментами ДНК (фрагментами Оказаки). Для работы фермента в пробирке требуются предшественники ДНК — дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (dNTP), а также одноцепочечная матрица, на которой должен быть небольшой двухцепочечный участок — затравка, с которого начинается синтез (рис. 41). Были также синтезированы модифицированные дидезоксирибонуклеотиды, в которых дезоксирибоза 3'-ОН отсутствует, для каждого из четырех оснований ДНК. ДНК-полимераза включает эти предшественники в ДНК. Однако, включившись в ДНК, модифицированное основание не может образовать фосфодиэфирную связь со следующим дезоксирибонуклеотидом. В результате рост (элонгация) данной цепи останавливается (терминируется) в том месте, где в ДНК включился дидезоксирибонуклеотид (ddNTP). Поэтому их называют терминаторами элонгации.

Реакционная смесь по Сэнгеру состоит из цепи ДНК, нуклеотидную последовательность которой надо определить, короткого фрагмента «меченой» ДНК, комплементарной концевому отрезку этой цепи (затравка), одного из четырех ddNTP и соответствующего dNTP в строго определенном соотношении (чтобы они конкурировали), а также остальных трех dNTP. Готовят четыре смеси, каждая из которых содержит один из четырех ddNTP. В каждой из пробирок образуется набор меченых фрагментов разной длины. Длина их зависит от того, в каком месте в цепь включен дефектный нуклеотид. Полученные меченые фрагменты ДНК разделяют в полиакриламидном геле (с точностью до одного нуклеотида), проводят радиоавтографию и по картине распределения фрагментов в четырех пробах устанавливают нуклеотидную последовательность ДНК (рис. 41).

В настоящее время определение точной нуклеотидной последовательности любого сегмента ДНК умеренной длины — вполне разрешимая задача. Уже определена последовательность нескольких сотен генов прои эукариот. Зная последовательность гена и генетический код, легко определить аминокислотную последовательность кодируемого им белка. Раньше для определения структуры белка приходилось делать тщательный и весьма трудоемкий анализ выделенного и очищенного белка. Сейчас часто бывает проще определить структуру белка через нуклеотидную последовательность, чем с помощью прямого секвенирования. Если секвенирование белка занимает месяцы и даже годы, то ДНК удается секвенировать за несколько недель.

Определение последовательности ДНК привело также к тому, что были обнаружены области, которые не кодируют белки, но принимают участие в регуляции экспрессии генов и репликации ДНК. В 1996 году был секвенирован геном дрожжей, в 1998 г. — геном арабидопсиса, в 2000 году — геном человека, однако в данном случае речь идет только об установлении последовательности нуклеотидов, так как генетическая структура и функции отдельных участков генома еще не идентифицированы, это более сложная задача.

Сразу вслед за разработкой быстрых методов секвенирования появились столь же быстрые и простые методы синтеза сравнительно длинных олигонуклеотидов с определенной, заранее заданной последовательностью. Теперь за три-четыре дня можно синтезировать последовательность из 12 — 20 нуклеотидов. Автоматизация этой процедуры еще более облегчает и ускоряет синтез. Появились приборы — ДНК-синтезаторы, которые выполняют эту работу за несколько часов.

Гибридизация как высокочувствительный метод выявления специфических последовательностей нуклеотидов Если водный раствор ДНК нагреть до 100оС и повысить рН до 13, то ДНК диссоциирует на 2 цепи (денатурирует), так как комплементарные связи между основаниями разрушаются. В 1961 году было обнаружено, что этот процесс обратим: выдерживание ДНК при температуре 65оС вело к восстановлению структуры двойной спирали. Этот процесс называется ренатурация или гибридизация. Процессы гибридизации происходят между любыми одинарными цепями, если они комплементарны: ДНК — ДНК, РНК — РНК, ДНК — РНК.

Для теста необходимо иметь чистый одноцепочечный фрагмент ДНК, комплементарный той последовательности, которую хотим обнаружить. Этот фрагмент получают либо клонированием, либо путем химического синтеза. Одноцепочечная ДНК, используемая в качестве индикатора, называется ДНК-зонд. Она может содержать от 15 до 1000 нуклеотидов.

ДНК-зонды применяются в различных целях. Гибридизация ДНК-зонда с РНК, выделенной из анализируемой клетки, может выявить наличие или отсутствие экспрессии гена. Если гибридизации не происходит, значит ген молчит, не работает. ДНК-зонды также позволяют проводить диагностику наследственных болезней.

В большинстве случаев мутации, ведущие к наследственным болезням, рецессивны, то есть болезнь развивается, если человек получает дефектные гены от обоих родителей. Аномальные эмбрионы лучше выявлять до рождения. Например, для серповидноклеточной анемии в мутантном гене, кодирующем бэта-цепь гемоглобина, последовательность ГАГ заменена на ГТГ. В этом случае синтезируют олигонуклеотид длиной около 20 оснований, метят радиоактивной меткой. Из эмбриональных клеток, содержащихся в амниотической жидкости, выделяют ДНК и используют ее для гибридизации. Если эмбрион дефектен, то тест будет положительным.

Анализ проводят по следующей схеме (рис. 42): исследуемую ДНК гидролизуют рестриктазами, фракционируют электрофорезом, переносят разделенные фрагменты на нитроцеллюлозный фильтр и проводят реакцию гибридизации с мечеными олигонуклеотидами. Этот метод был разработан Саузерном в 1975 году. В отечественной литературе его принято называть «южный блоттинг». «Блоттинг» — в переводе с английского означает «промокашка», «саузерн» — «южный», в данном случае игра слов: фамилия ученого переводится как географическое направление.

Молекулы ДНК разгоняют в агарозном геле электрофорезом. ДНК в геле денатурируют щелочью. Щелочь нейтрализуют и пластину геля покрывают листом нитроцеллюлозы. Сверху на нитроцеллюлозу помещают стопку листов фильтровальной бумаги, обеспечивая медленный ток буферного раствора через гель в направлении, перпендикулярном направлению электрофореза. ДНК диффундирует из геля и связывается с нитроцеллюлозным фильтром. После прогревания фильтра при 80оС в вакууме ДНК необратимо связывается с нитроцеллюлозой. Расположение полос иммобилизованной ДНК точно соответствует их расположению в геле.

ДНК, связанную с нитроцеллюлозным фильтром, можно гибридизовать с радиоактивно меченой ДНК. Блоттинг по Саузерну является исключительно полезным также и для локализации изучаемых генов в определенных фрагментах, полученных в результате гидролиза различными рестриктазами гибридных молекул ДНК, хромосомной ДНК и т. д.

Аналогичным методом на нитроцеллюлозу переносят молекулы РНК (Северный блоттинг) и белка (Западный блоттинг). Из частей света осталась свободной только западная, хотя вакантными остались 2 класса макромолекул — углеводы и липиды.

Одним из наиболее точных и современных методов анализа является использование чипов. Они представляют собой пластинки с иммобилизованными меченными ДНК-зондами. Каждая такая пластинка может содержать несколько десятков тысяч зондов, расположенных в определенной последовательности. Метка проявляется только в спаренных двухцепочечных фрагментах. Если в исследуемом образце есть последовательности, комплементарные последовательностям зонда, то гибридизацию можно определить визуально или с помощью специальных приборов. Как правило, детекторы соединены с компьютером, то есть процедура считывания и обработки информации автоматизирована.

Такие ДНК-чипы можно применять для комплексной диагностики инфекционных заболеваний, наследственных дефектов, установления экспрессии тех или иных генов (в этом случае идет гибридизация с мРНК), то есть отслеживания нарушений обмена веществ. Они дешевы, очень надежны, просты в обращении и могут многократно использоваться. Недостаток — дорогая аппаратура для детекции.

4. Методы клонирования ДНК

После того, как ДНК сшита в пробирке, ее необходимо размножить.

Существует два подхода к клонированию ДНК. Первый подход предполагает использование бактериальных или дрожжевых клеток для размножения введенной в них чужеродной ДНК. Второй способ представляет собой амплификацию ДНК in vitro.

Клонирование ДНК in vivo

Используя микроорганизмы, можно создавать два типа библиотек ДНК: геномную и клоновую (кДНК).

Геномная библиотека. Если геном какого-либо организма разрезать, вставить в плазмидные или вирусные вектора и ввести в клетку, то в таком виде его можно сохранить. При разрезании плазмидной или фаговой ДНК вероятность выпадения целых и неизмененных кусков генома довольно высока.

Такой способ получения геномной библиотеки получил название «метод дробовика», так как геном в данном случае представлен отдельными фрагментами.

Принципы создания плазмидных и вирусных векторов общие, поэтому рассмотрим их на примере плазмидных. Следует отметить, что из вирусных ДНК лучше использовать ДНК фагов, так как они имеют большую емкость и позволяют вставлять более крупные куски генома.

Очищенные кольцевые молекулы ДНК обрабатывают рестриктазой, получая линейную ДНК. Клеточную ДНК обрабатывают той же рестриктазой, добавляют к плазмидной, добавляют лигазы. Таким образом получают рекомбинантную плазмидную ДНК, которую вводят в бактериальные или дрожжевые клетки. Плазмида реплицируется с образованием многих копий. Многие плазмиды несут ген устойчивости к антибиотикам, и если в рекомбинантной плазмиде есть такой ген, то клетки легко выявлять, выращивая на среде с антибиотиком.

Каждая такая колония представляет собой клон или потомство одной клетки. Плазмиды одной колонии содержат клон геномной ДНК, а совокупность плазмид можно назвать библиотекой геномной ДНК. Недостаток такого метода в том, что фрагменты ДНК образуются в огромном количестве. Разрезание геномной ДНК определяется случаем, поэтому лишь часть фрагментов содержат полноценные гены. Некоторые фрагменты могут содержать только часть гена или же интронные последовательности.

Библиотека кДНК. Создание кДНК начинается с синтеза на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы комплементарной нити ДНК. Затем создают щелочные условия, разрушают цепь РНК на нуклеотиды, после чего с помощью ДНК-полимеразы синтезируют комплементарную цепь ДНК. При этом образуется фрагмент ДНК с тупыми концами. Такую ДНК встраивают в плазмиды и вводят в клетки бактерий. При амплификации плазмиды образуется клон комплементарной копии ДНК (кДНК).

Преимущества клоновой ДНК перед клонами геномной ДНК в том, что кодирующая белок нуклеотидная последовательность гена ничем не прерывается.

Гены эукариот содержат интроны, которые должны удаляться из транскриптной РНК перед превращением ее в матричную, после чего следует сплайсинг (сращивание). Бактериальные клетки не могут осуществлять такую модификацию РНК, образовавшуюся путем транскрипции гена эукариотической клетки. Поэтому если преследуют получение белка путем экспрессии клонированного гена, то лучше использовать банк кДНК, полученной на основе матричной РНК.

Методы клонирования ДНК Полимеразная цепная реакция В 1985 году К. Мюллис с сотрудниками разработали метод клонирования последовательностей ДНК in vitro, который получил название полимеразной цепной реакции (ПЦР).

К анализируемому образцу ДНК добавляют в избытке 2 синтетических олигонуклеотида — праймера размером около 20 нуклеотидов. Каждый из них комплементарен одному из 3'-концов фрагмента ДНК. ДНК нагревают для разделения цепей двойной спирали, а при охлаждении происходит гибридизация праймеров с комплементарными участками фрагментов ДНК. В результате в растворе будут находиться однонитевые ДНК с короткими двухцепочечными участками — затравками (праймерами). При добавлении нуклеотидов и ДНК-полимеразы синтезируются комплементарные цепи и образуются идентичные фрагменты ДНК (первый цикл, рис. 43). Реакция останавливается и ДНК снова денатурируется прогреванием.

В процессе охлаждения праймеры, находящиеся в избытке, вновь эффективно гибридизуются, но уже не только с цепями исходной ДНК, но и с вновь синтезированными. Внесение в систему ДНК-полимеразы инициирует второй цикл полимеразной реакции. Многократное повторение описанной процедуры позволяет провести 30 и более циклов ферментативного удлинения праймеров. При этом число сегментов ДНК, ограниченных с обоих концов используемыми праймерами, с каждым циклом ПЦР увеличивается экспоненциально (приближается к зависимости 2n, где n — число циклов). Выход всех других продуктов реакции увеличивается по линейной зависимости (рис. 44). Таким образом, в процессе рассматриваемой реакции эффективно амплифицируется только та последовательность ДНК, которая ограничена праймерами.

Первоначально для ПЦР использовали фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I E. coli. Однако недостатком данного подхода являлось то, что после каждого цикла реакции необходимо было вносить в реакционную смесь новую порцию фермента. Кроме того, в оптимальных температурных условиях такой полимеразной реакции (37 °С) появлялись вторичные участки связывания праймеров и наблюдалась амплификация незапланированных сегментов генома, т. е. специфичность амплификации не была полной. Существенное улучшение метода полимеразной цепной реакции было достигнуто после замены фрагмента Кленова на ДНК-полимеразу термофильной бактерии Thermus aquaticus (Taq-полимераза). Температурный оптимум реакции, направляемой Taq-полимеразой, находится в районе 70 °C. Другим важным свойством является то, что данная полимераза не инактивируется после длительной инкубации при 95 °C.

Используя Taq-полимеразу, удалось решить сразу две проблемы. Во-первых, термостабильная полимераза не инактивируется на этапе денатурации ДНК, и поэтому нет необходимости после каждого цикла реакции добавлять новую порцию фермента. Такое упрощение процедуры позволило автоматизировать проведение ПЦР, так как теперь требовалось лишь перенесение образца с определенным интервалом времени в разные температурные условия: 90—95 °С (температура денатурации) и 60—70 °С (температура ренатурации ДНК и ферментативной реакции). Во-вторых, высокий температурный оптимум реакции, катализируемой Taq-полимеразой, позволяет подбирать жесткие температурные условия отжига, обеспечивающие гибридизацию праймеров только в заданном районе изучаемого генома, что существенно повышает специфичность и чувствительность метода.

Используя метод ПЦР, можно in vitro селективно обогащать препарат ДНК фрагментом с определенной последовательностью в миллион и более раз. Это позволяет надежно выявлять однокопийные гены и их варианты в таких больших и сложных геномах, каким является геном человека. Чувствительность метода такова, что амплифицировать в ПЦР и выявить целевую последовательность можно даже в том случае, если она встречается однажды в образце из 105 клеток. Получаемый сегмент ДНК надежно выявляется в виде дискретной полосы после электрофоретического разделения молекул ДНК и окраски их этидиум бромидом. Если к праймеру пришить фермент, то ферментная метка будет накапливаться при амплифицировании. Продукт амплификации проверяется по принципу ИФА, то есть добавляется субстрат и отмечается изменение окраски. В качестве метки можно использовать стрептавидин (см. главу 3). Его можно пришивать как к праймеру, так и к нуклеотидам. В последнем случае нуклеотиды, меченные стрептавидином, добавляются к обычным, идущим на синтез комплементарной цепи ДНК. Этим достигается еще большее усиление сигнала.

Размноженный in vitro фрагмент получают в количествах, достаточных для его прямого секвенирования. Поскольку при этом не требуется промежуточный этап клонирования фрагмента ДНК в молекулярных векторах, ПЦР иногда называют бесклеточным молекулярным клонированием (cell-free molecular cloning). Автоматизированная процедура Taq-полимеразной цепной реакции, состоящая из 30 и более циклов, занимает 3—4 часа, что существенно быстрее и проще процедуры клонирования определенного

5.Контроль над исследованиями рекомбинантных ДНК

Споры о роли генетики начались задолго до современного расцвета генной инженерии. Еще в 1970;х годах не только ученое сообщество, но и широкая публика принялись обсуждать вопросы, связанные с противоречивыми перспективами новых биологических технологий. В чем же заключался основной вопрос? Основной темой споров была рекомбинантная ДНК, которую называли также химерной ДНК. В лабораторных условиях стало возможным создавать искусственные ДНК, комбинируя между собой гены разных видов и получая такие сочетания, которые бы никогда не встретились в природе. Большинство искусственных ДНК синтезируются в научных целях. Это контролируемые эксперименты, на основе которых ученые стремятся получить новые сведения об изучаемых ими биологических системах. Однако в некоторых случаях исследователям просто любопытно «посмотреть, что получится». Часто получаются ожидаемые результаты, но порой происходит нечто неожиданное. И это вполне объяснимо с научной точки зрения: ведь мы никогда не можем заранее все знать и все предсказать. Поэтому ученые никогда не могут обещать, что полученные ими клетки с рекомбинантными ДНК будут абсолютно безопасными. Именно такая неуверенность и послужила отправной точкой для дискуссий по поводу опасностей современной генетики.

С такой проблемой столкнулись молекулярные биологи, изучавшие в 1970;х годах гены вирусов, вызывающих возникновение рака, и внедрявшие их в бактерии Е. coli. При этом они руководствовались благими намерениями: изучить функции раковых генов на примере простых биологических систем. Но с помощью данной технологии можно было бы создать и вредные канцерогенные бактерии, заражающие людей. По мере развития технологии ученые все более приходили к мысли об опасном направлении своей работы и задумывались о ее глобальных последствиях. В конце концов, 11 известных молекулярных биологов опубликовали открытое письмо в престижных журналах «Nature» и «Science», призвав своих коллег наложить мораторий на определенные виды экспериментов и с большей осторожностью относиться к остальным опытам. В частности, они предлагали ввести запрет на эксперименты с генами устойчивости к антибиотикам, генами токсинов и генами канцерогенных вирусов; призывали организовать дискуссию на эту тему; просили Национальный институт здоровья США (NIH) разработать правила и принципы проведения подобных экспериментов.

Для ученого сообщества это был шаг огромной важности: перед лицом неизвестной и в общем-то не вполне определенной опасности ученые осознанно воздерживались от проведения экспериментов. Подписавшиеся под этим письмом, по всей видимости, не ожидали, какой резонанс вызовет их заявление во всем мире.

Как только о письме стало известно средствам массовой информации, широкая публика восприняла потенциальную опасность, как вполне реальную. «Если бы эти эксперименты не были так опасны, — часто рассуждали люди со стороны, — то разве ученые стали бы их запрещать?» Однако технология получения рекомбинантных ДНК открыла совершенно новые направления исследований. Перспективы получения Нобелевской премии и огромных экономических выгод также смущали ученых. Ко времени проведения дискуссий многие из них уже стремились не столько обсудить возможные этические проблемы, сколько убедить публику в безопасности своих работ. То, что начиналось как ответственный поступок, превратилось в нежелание допускать в свои планы непосвященных. И хотя многие противоречия к нашему времени уже удалось более или менее разрешить, да и накал страстей снизился, было бы полезно кратко напомнить о сути этих споров.

С 24 по 27 февраля 1975 года ряд известных во всем мире молекулярных биологов собрался в Аси-ломаре, близ города Монтерей в штате Калифорния. Некоторые из собравшихся заявили, что этические опасения преувеличены и потребовали продолжения важных исследований. Другие были обеспокоены возможными законодательными постановлениями или судебными преследованиями, если будет доказано, что исследования представляют опасность для здоровья. Многие же просто считали, что они попусту тратят время. На конференции было принято постановление продолжать исследования и заменить мораторий на ряд принципов, которых следует придерживаться при проведении экспериментов с различной степенью риска. Были высказаны следующие предложения:

увеличить число уровней безопасности для экспериментов, представляющих высокую степень потенциального риска;

использовать ослабленные разновидности генетически измененных микроорганизмов в специальных лабораторных условиях.

Главная трудность тогда (впрочем, как и сейчас) заключалась в том, чтобы оценить степень риска таких обстоятельств, о которых еще мало что известно. Национальный институт здоровья, финансирующий большую долю биологических проектов, взял инициативу в свои руки и разработал ряд положений, предложив их для открытого обсуждения. Для определения правил проведения исследований был образован Комитет по рекомбинантной ДНК, состоявший из экспертов разных областей биологии, а также из представителей частных компаний, использующих новые технологии. Последующие дискуссии также развертывались в основном вокруг возможных опасностей. И хотя от представителей промышленных компаний стоило ожидать того, что они будут ратовать за практически свободное экспериментирование, многие из них проявили ответственность и высказались за регулирование исследований. Они тоже опасались возможных негативных последствий и судебных исков в случае нанесения ущерба с их стороны, а потому также предложили разработать основные принципы. Другие же ученые утверждали, что им не дают работать, хотя исследования в области рекомбинантной ДНК помогли бы решить такие глобальные проблемы, как голод и инфекционные болезни.

23 июня 1976 года Дональд Фредериксон, директор Национального института здоровья, утвердил ряд формальных правил исследований в области рекомбинантной ДНК, придерживаться которых должны были все, кто получает гранты от этого института. В них были определены четыре уровня физической безопасности исследований согласно оцененной степени их риска. Первый уровень — безвредные эксперименты с использованием стандартных биологических технологий. С каждым последующим уровнем количество ограничений и предостережений возрастало настолько, что для экспериментов четвертого уровня — вроде тех, что показаны в фильме «Штамм Андромеды», — подходящих лабораторий не существовало вплоть до 1978 года. Кроме того, три штамма Е. coli были распределены по трем уровням биологической безопасности. Стандартные лабораторные штаммы обозначили как ЕК1. Штаммы ЕК2 были определены как характеризующиеся преднамеренно вызванной мутацией, способные выжить вне лаборатории с вероятностью 1×10−8. ЕКЗ — те же штаммы, только совершенно не способные выжить в организмах животных и растений или вне лаборатории. Для того чтобы вырастить ослабленный штамм Е. coli, в который можно было бы внедрить рекомбинантную ДНК, Рой Кер-тисс, член комитета при Национальном институте здоровья, разработал штамм хи-1776 (в честь 200-летия провозглашения независимости США), содержащий 15 отдельных блоков для нормального размножения. Роль, которую образованная публика может сыграть при решении вопросов, связанных с регулированием потенциально опасных научных исследований, прояснилась в ходе одного из обсуждений в Кембридже (штат Массачусетс). В тот день, когда были опубликованы правила проведения генетических экспериментов, мэр Кембриджа Альфред Ве-луччи открыл публичные слушания по поводу предложения построить специальную лабораторию по переносу генов животного вируса SV40 в Е. coli. Это предложение выдвинул Марк Пташне, ученый Гарвардского университета. На этом слушании присутствовал один из авторов этой книги. В Кембридже, где располагаются Гарвардский университет и Мас-сачусетский технологический институт, конечно же уже имелись многочисленные лаборатории, где проводились генетические эксперименты, но строительство нового здания требовало разрешения городского совета, и предложение Пташне, получившее широкую огласку, решили обсуждать на открытом заседании.

В течение двух с половиной часов перед представителями телевидения, радио и прессы, а также перед сотнями собравшихся выступали сторонники и противники строительства. Одни ученые приводили аргументы о необходимости строительства, утверждая, что такая лаборатория необычайно полезна для изучения рака, тогда как риск выведения опасных бактерий «крайне невелик». Другие ученые и представители общественности утверждали, что непредвиденные инциденты уже неоднократно происходили в самых надежно защищенных лабораториях и что, если будут выведены опасные микроорганизмы, их уже нельзя будет остановить. Вопросы мэра и его советников показывали, что они хорошо подготовились к слушаниям и ознакомились с материалом. В заключение мэр потребовал наложить двухлетний мораторий на все исследования рекомбинантной ДНК, проводимые в Кембридже, но городской совет предложил создать Экспериментальный гражданский совет по пересмотру (CERB) в составе восьми членов, не принадлежащих к кругу ученых. В него вошли четыре мужчины и четыре женщины: врач, философ, агент по продаже горючего, инженер-проектировщик, клерк, медсестра, социальный работник и домохозяйка. Члены совета ознакомились с необходимыми специальными сведениями из молекулярной биологии и в январе 1977 года вынесли единогласное решение — одобрить строительство лаборатории. Этот комитет создал прецедент для последующих слушаний подобного рода по поводу исследований в области рекомбинантной ДНК. Данный случай показал, что обычные граждане вполне способны понять научные проблемы и вынести здравое решение, не препятствующее развитию науки и не представляющее опасности для общества.

В Великобритании вопрос о рекомбинантной ДНК был решен иным образом. Правительство учредило Консультативную группу по генетическим манипуляциям (Genetic Manipulation Advisory Group, GMAG), в состав которой вошли политики, ученые и представители профсоюзов. Все предлагаемые эксперименты в области рекомбинантной ДНК должны получить одобрение GMAG, принятое на основе современных данных. Основное отличие от американской практики состоит в отсутствии общественного обсуждения, в объединении в одном органе представителей правительства, частного сектора и ученых и в том, что решение может быть изменено в свете последующих научных открытий. В настоящее время как минимум семь стран Европы учредили комитеты по генной инженерии. Канадский Медицинский исследовательский совет придерживается постановлений Национального института здоровья, но уделяет особое внимание вирусам и клеточным культурам млекопитающих.

Генетически модифицированные организмы Вопросы общественного влияния на генетику и регулирования научных исследований в этой области, во многом не решены до сих пор. По мере совершенствования микробиологических технологий и методов появляются все новые и новые поводы для беспокойства. В настоящее время речь уже идет не о том, чтобы добавить несколько новых генов лабораторным бактериям. В наше время вполне доступной стала технология создания в коммерческих целях генетически модифицированных организмов, то есть трансгенных растений и животных с заданными признаками. Многие трансгенные организмы до сих пор содержатся в лабораториях для тестирования, но некоторые уже выпущены на рынок. Трансгенные технологии стали очередным поводом для жарких споров, так как здесь сошлись интересы получения выгоды и сохранения окружающей среды и здоровья людей. Вопрос сводится к тому, насколько безопасно внедрять в организм чужую ДНК и насколько далеко можно предвидеть результаты такого внедрения. Последние десять с лишним лет, в течение которых генетически модифицированные продукты использовались достаточно широко, доказали, что эти технологии не такие уж безвредные. Например, в некоторых случаях инсулин, полученный от трансгенных бактерий, приводил к неблагоприятным последствиям. Однако и особо опасных ситуаций еще не возникало. Национальный институт здоровья пересмотрел некоторые свои рекомендации, и теперь генетики могут пользоваться значительной свободой в своих экспериментах, хотя наиболее опасные из них по-прежнему находятся под контролем. Вопросы по поводу модифицированных организмов остаются, и стоит упомянуть хотя бы некоторые из них.

Первыми генетически модифицированными организмами были бактерии центров кристаллизации льда и помидоры сорта Flavrsaver, выведенные еще в 1970;х годах. Бактерии предназначались для того, чтобы после распыления на растениях они образовывали центры кристаллизации льда; таким образом можно было бы немного повысить устойчивость сельскохозяйственных культур к холоду и увеличить период роста. Помидоры должны были созревать позднее обычного, чтобы дольше сохраняться на складе. Планировалось также уменьшение отходов из-за помятых и слишком мягких экземпляров. После шумных протестов общественности разведение этих организмов запретили.

Многие генетики восприняли шум вокруг модифицированных продуктов как своего рода бурю в стакане воды, и, действительно, за первыми протестами последовало несколько относительно спокойных лет. Но два события показали, что некоторые представители общественности настроены резко против внедрения достижений современной генетики в повседневную жизнь. Сначала в 1993 году некто по прозвищу Унабомбер (позже выяснилось, что его настоящее имя Теодор Качински) послал почтой бомбу ведущему американскому генетику Чарльзу Эпштейну в знак протеста против «новой генетики». Этот инцидент получил широкое освещение в прессе. Позже, в 1996 году, многие газеты и журналы обошли фотографии, на которых члены организации «Гринпис» протестуют против генетически модифицированных продуктов. Это было довольно серьезное, хорошо организованное мероприятие с сотнями участников на надувных лодках «Зодиак» и большими плакатами с надписью «Остановим генетическое загрязнение». Своей мишенью «гринписовцы» выбрали грузовые суда, доставлявшие трансгенную сою из Северной Америки в Европу. Для ванкуверских генетиков (таких, как А. Гриффите и Д. Сузуки, авторов этой книги) это событие стало поистине двойным потрясением, поскольку организация «Гринпис», поначалу боровшаяся с китобойным промыслом и испытаниями ядерного оружия, зародилась именно в Ванкувере. Каким же ударом было узнать, что в разряд своих врагов она включила и «злых генетиков»! За последние несколько лет лихорадка протеста распространилась быстрыми темпами и охватила весь цивилизованный мир. Многочисленные демонстрации против генетически модифицированных продуктов стали обычным явлением; решительно настроенные члены радикальных группировок выражают свое гражданское неповиновение тем, что уничтожают трансгенные растения и даже пытаются разрушить фабрики по их производству и научные центры. Недавно вышел номер журнала «Экономист», на обложке которого была изображена чудовищная картофелина «Франкенфуд», восклицающая: «Кто боится ГМ-пищи?» (ГМ — генетически модифицированный продукт). В то же время и надежды ученых на то, что с помощью генетически модифицированных продуктов удастся накормить бедные страны и решить проблему голода, также не сбылись. Об этом мы поговорим далее.

Технологии в контексте Одна из сторон возникшей проблемы — научное просвещение. Как шутят агенты по продаже недвижимости, три ключевых элемента, помогающих продать дом, — это его место, место и еще раз место. Точно так же и в научном просвещении основные три момента — это контекст, контекст и еще раз контекст. Без знания контекста все новые открытия ученых подобны воздушным шарам — красивым, но ничего не значащим для остального человечества. Неприятие достижений современной генетики во многом коренится в том, что неизвестен контекст их применения, и поэтому мы должны для начала рассмотреть новые генетические технологии в свете технологии вообще.

Во всякой технологии есть свои положительные и отрицательные стороны. Многие согласятся с тем, что промышленная революция XIX века, основанная на научных достижениях в области физики и химии, повысила уровень жизни в индустриально развитых странах. Однако обратная сторона прогресса налицо. Например, промышленная революция подарила человечеству двигатель внутреннего сгорания, с помощью которого передвигаются автомобили и другие машины. Автомобиль люди любят за скорость, за то, что в нем легко перемещаться в удаленные места, но при этом он наносит большой ущерб окружающей среде и здоровью людей своими выхлопными газами, не говоря уже о том, что для производства автомобилей добывают в шахтах металлы, выкачивают из недр земли нефть; для строительства шоссе вырубают леса, уменьшая тем самым биологическое разнообразие. С развитием транспортной сети города растут и еще более уменьшают площадь нетронутых участков природы. Только в одной Канаде ежегодно около 16 тыс. смертей относят на счет загрязнения атмосферы транспортными средствами. К этому количеству нужно добавить тысячи тех, кто гибнет в автомобильных авариях. И эти смерти реальны, а не гипотетичны. Хотя все трагические случаи близко затрагивают членов семьи погибших, общество относится к ним снисходительно и считает неизбежной платой за те блага, которые принес двигатель внутреннего сгорания.

Химическая промышленность тоже производит огромные загрязнения. Химическая революция прошлого века (проходившая под лозунгом «Химия даст нам лучшие вещи для большего комфорта») подарила нам пластмассы, синтетические красители и многие другие полезные материалы. Но она же стала причиной пищевых отравлений инсектицидами, дыр в озоновом слое, загрязнения водоемов, радиоактивных отходов и тысяч ядовитых отстойников по всему миру. Химическая промышленность несет ответственность не только за многие болезни людей, но и за гибель бесчисленных растений и животных в естественных экосистемах.

Генетически модифицированные организмы следует рассматривать в таком же контексте. Конечно, никто не спорит с тем, что современные биотехнологии имеют свои отрицательные стороны с социальной, экологической и медицинской точек зрения, даже если до сих пор практически не было сообщений о заболеваниях, вызванных потреблением модифицированных продуктов. Но потенциальный вред любой технологии нужно рассматривать вместе с потенциальным благом от ее применения, и в этом отношении генетические технологии стоят вровень с другими технологиями.

Современные дискуссии по поводу применения генетических технологий следует вести с учетом опыта прошлого и использования в будущем любых технологий. Человечество уже достаточно ошибалось в прошлом, пора научиться осторожности. Таков основной принцип осторожности: при условии выбора тактики и при ограниченных возможностях предвидеть последствия, действовать так, чтобы причинить минимум вреда, и так, чтобы любой шаг был обратим. В любом случае не следует принимать важных решений, пока не будут тщательно рассмотрены все стороны проекта. Такая тактика основана на том, что в прошлом уже принимались безответственные решения об использовании новых технологий, не имеющих прецедентов, а возможность переносить гены из одного организма в другой действительно не имеет прецедентов. Когда обнаружилось, что ДДТ может убивать насекомых, то с помощью этого вещества надеялись навсегда покончить с вредителями. В 1948 году открывший его Пауль Мюллер получил Нобелевскую премию. И хотя генетики понимали, что отбор резистентных мутантов неизбежен, а экологи знали, что вредные насекомые представляют собой лишь небольшую часть всех насекомых, широкое применение инсектицида казалось вполне приемлемым способом контроля над извечными врагами полей. Никто и не предполагал, что ДДТ и другие химикаты распространятся в природе настолько, что войдут в пищевые цепи. Химикаты накапливаются в жировой ткани и вместе с пищей переходят в организм других животных. В процессе биомагнификации концентрация этих веществ увеличивается в тысячи, и даже сотни тысяч раз, достигая критического уровня в скорлуповых железах птиц и молочных железах женщин. Этот феномен обнаружили только после того, как начали исчезать многие хищники. Никакие меры предосторожности не помогали предотвратить столь непредвиденную опасность. Не было возможности предвидеть последствия применения и хлорфторуглеродов, которые в первое время называли чудом современной химии. Эти вещества химически инертны и служат прекрасными переносчиками химических веществ в аэрозольных баллончиках. Никто не знал, что хлорфторуглероды будут накапливаться в верхних слоях атмосферы и свободные радикалы хлора начнут разрушать озоновый слой. Природа революционных технологий такова, что мы не можем предусмотреть всех последствий их использования.

Заключение

Генетическая инженерия, а в частности работа с рекомбинантными ДНК на сегодняшний день является важнейшей и наиболее быстро развивающейся составной частью биотехнологии. Методы генной инженерии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в «фабрики» для масштабного производства любого белка. Это дает возможность детально анализировать структуру и функции белков и использовать их в качестве лекарственных средств. В настоящее время кишечная палочка (E. coli) стала поставщиком таких важных гормонов как инсулин и соматотропин. Ранее инсулин получали из клеток поджелудочной железы животных, поэтому стоимость его была очень высока. Для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 800−1000 кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200 — 250 грамм. Это делало инсулин дорогим и труднодоступным для широкого круга диабетиков. В 1978 году исследователи из компании «Генентек» впервые получили инсулин в специально сконструированном штамме кишечной палочки. Инсулин состоит из двух полипептидных цепей, А и В длиной 20 и 30 аминокислот. При соединении их дисульфидными связями образуется нативный двухцепочечный инсулин. Было показано, что он не содержит белков E. coli, эндотоксинов и других примесей, не дает побочных эффектов, как инсулин животных, а по биологической активности от него не отличается. Впоследствии в клетках E. coli был осуществлен синтез проинсулина, для чего на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы синтезировали ее ДНК-копию. После очистки полученного проинсулина его расщепили и получили нативный инсулин, при этом этапы экстракции и выделения гормона были сведены к минимуму. Из 1000 литров культуральной жидкости можно получать до 200 граммов гормона, что эквивалентно количеству инсулина, выделяемого из 1600 кг поджелудочной железы свиньи или коровы.