Дипломы, курсовые, рефераты, контрольные...
Срочная помощь в учёбе

Получение мутантов Burkholderia cenocepacia с измененной способностью к формированию биопленок и их характеристика in vitro и in vivo

Диссертация: Получение мутантов Burkholderia cenocepacia с измененной способностью к формированию биопленок и их характеристика in vitro и in vivo
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Медицинская микробиология и клиническая фармакология, к сожалению, только начинают подбираться к разработке современных медикаментозных препаратов с целью их воздействия на биопленки. Однако, в бактериологических лабораториях развитых стран уже начинают оценивать антисептики и антибиотики по эффективности их действия не только на изолированные микроорганизмы, но и на бактерии, находящиеся… Читать ещё >

Содержание

  • ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
  • Глава 1. Биопленки: феномен, история вопроса
  • Глава 2. Методы исследования биопленок
    • 2. I. Микроскопические методы
      • 2. 2. Генетические методы
  • Глава 3. Характеристика бактерий рода Burkholderia
  • Глава 4. Генетический контроль процесса образования биопленок
    • 4. 1. Роль регуляторной системы «quorum sensing» в образовании биопленок
    • 4. 2. Стадии процесса образования биопленок и их генетический контроль
  • Глава 5. Роль клеточных структур в формировании биопленок
  • Глава 6. Значение биопленок в патогенезе хронической инфекции
  • СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
  • Глава 7. Материалы и методы
    • 7. 2. Световая микроскопия
    • 7. 3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
    • 7. 4. Инсерционный мутагенез
    • 7. 5. Анализ формирования биопленок
    • 7. 6. Выделение ДНК, клонирование
    • 7. 7. Протеомный анализ
    • 7. 8. Трансмиссионная электронная микроскопия
    • 7. 9. Заражение лабораторных животных
    • 7. 10. Статистическая обработка результатов
  • Глава 8. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
    • 8. 1. Получение мутантов с нарушенной способностью к образованию биопленок
    • 8. 2. Идентификация генов, принимающих участие в образовании биопленок
    • 8. 3. Протеомный анализ штамма 370 и полученных мутантов
    • 8. 4. Сравнительное морфологическое изучение мутантных штаммов
    • 8. 5. Сравнительная характеристика инфекционного процесса, вызванного мутантными штаммами В. cenocepacia
    • 8. 6. Патоморфологические исследования. легких инфицированных мышей
  • Глава 9. ОБСУЖДЕНИЕ
  • ВЫВОДЫ

Получение мутантов Burkholderia cenocepacia с измененной способностью к формированию биопленок и их характеристика in vitro и in vivo (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Исследования последнего десятилетия показали, что более 99% бактерий существуют в природной среде и в организмах хозяев в виде сложно организованных сообществ — биопленок. Такой образ жизни является основной стратегией их выживания. Биопленки могут быть сформированы популяциями как одного вида бактерий, так и сообществом многих видов микробов. Современные микроскопические методы показали, что биопленки имеют сложную архитектуру: бактерии в биопленке заключены в экзополимерный матрикс, который содержит каналы, наполненные жидкостью, через которые происходит приток питательных веществ и кислорода и выведение продуктов метаболизма. Главным компонентом матрикса являются экзополисахариды, в его состав также входят белки, нуклеиновые кислоты и другие вещества [Ильина Т.С., Романова Ю. М., с соавт., 2004].

Изучение биопленок вызывает огромный интерес исследователей в последние годы в силу того, что этот способ существования бактерий создает большие проблемы в медицинской практике: установлено, что многие хронические инфекции, возникновение которых связано с использованием медицинского имплантированного оборудования — линз, катетеров, протезов, искусственных клапанов сердца, — обусловлены способностью бактерий расти в виде биопленок на поверхностях этих устройств. Причем, будучи организованными в биопленочные сообщества, бактерии проявляют большую устойчивость к действию антибактериальных препаратов, в том числе антибиотиков, факторов иммунной защиты организма и неблагоприятных факторов среды [Donlan R.M., Costerton J.W., 2002].

Объект нашего исследования — бактерии Burkholderia cenocepacia являются одним из возбудителей, вызывающих тяжелые легочные инфекции у иммунодефицитных пациентов и у больных с наследственным заболеваниемкистозным фиброзом легких (КФ). Интенсивные исследования этого возбудителя в последнее время позволили определить у него следующие 4 факторы патогенности: кабельные пили, сидерофоры, липазы, гемолизины, экзополисахариды (EPS), биопленки [Sajjan U.S., Sun L., v et al., 1995; Visser M.B., Majumdar S., et al., 2004; Kooi C., Subsin В., et al., 2006; Hutchison M.L., Poxton I.R., et al., 1998; Cunha M.V., Sousa S.A., et al., 2004]. Вклад каждого из этих факторов в общую патогенность Burkholderia sp. все еще недостаточно определен. Поскольку тяжелые хронические легочные патологии, вызываемые В. cenocepacia у обширной группы людей, обусловлены способностью возбудителя формировать биопленки и поскольку проблема лечения этой инфекции остается актуальной и в нашей стране, и за рубежом, изучение процесса образования биопленок и его генетического контроля как основа для разработки способов борьбы с ними является одной из актуальных проблем современной инфектологии. Изучение механизмов образования биопленок этими бактериями должно внести существенный вклад в поиск мер профилактики и защиты против патогенов путем создания нового класса антимикробных препаратов, способных ингибировать патогенные свойства бактерий или препятствовать процессу образования биопленок.

Одним из подходов к изучению процесса образования биопленок является получение мутантов, влияющих на этот процесс и их комплексное изучение.

Целью настоящей работы являлось получение мутантов бактерий Burkholderia cenocepacia с измененной способностью к формированию биопленок и их характеристика in vitro и in vivo.

Задачи исследования:

1) изучение способности бактерий В. cenocepacia формировать биопленки и отработка методик качественной и количественной оценки этого процесса;

2) получение мутантов В. cenocepacia с измененной способностью к формированию биопленок методом инсерционного мутагенеза;

3) сравнительная электронно-микроскопическая характеристика полученных мутантов;

4) клонирование фрагментов мутантных генов, содержащих инсерцию пласпозона;

5) секвенирование клонированных фрагментов и идентификация мутантных генов с помощью баз данныхпротеомный анализ;

6) изучение in vivo динамики инфекционного процесса, вызываемого полученными мутантными штаммами на биологической модели заражения лабораторных животных.

В работе использовали традиционные микробиологические методы выращивания культур и экспериментального заражения лабораторных животных, современные молекулярно-генетические методы — полимеразную цепную реакцию (ПЦР), клонирование и секвенирование генов, сравнительный протеомный анализ исходных и полученных мутантных штаммов и электронно-микроскопическую технику.

Для количественной оценки образуемых клетками разных штаммов биопленок В. cenocepacia применяли метод спектрофотометрической оценки степени созревания биопленок в 96-луночном планшете при окрашивании специфическими красителями.

Для получения мутантов В. cenocepacia с нарушенной способностью к образованию биопленок применяли метод инсерционного мутагенеза с помощью рекомбинантной структуры из плазмиды и транспозона, получившей название пласпозона рТпМэс/-ККш.

Идентификацию полученных мутаций проводили после клонирования фрагментов мутантных генов по маркеру пласпозона, секвенирования клонированных фрагментов и сравнения полученных сиквенсов с имеющимися в базах данных нуклеотидными последовательностями геномов.

Для характеристики полученных мутантов использовали метод протеомного анализа синтезируемых ими белков.

Морфологические отличия планктонных клеток и клеток в составе биопленки, а также патоморфологические изменения в легких инфицированных животных исследовали в световом, флуоресцентном и трансмиссионном, электронном микроскопах.

Научная новизна.

На основе комплексного подхода при исследовании процесса формирования биопленок бактериями В. cenocepacia нами были выявлены три гена, принимающие участие в генетическом контроле процесса образования биопленок: ompR и tetR, кодирующие глобальные регуляторы транскрипции, и ген cydB, кодирующий субъединицу I цитохром bd убихинол оксидазы. Впервые для В. cenocepacia показано участие этих генов в генетическом контроле процесса образования биопленок.

Впервые, при использовании протеомного анализа, показана дифференциальная экспрессия белка шаперона GroEL у штаммов с различной способностью к образованию биопленки. Это дает возможность предполагать роль этого белка в генетическом контроле процесса формирования биопленок бактериями В. cenocepacia.

Выявлена наиболее чувствительная к инфекции Bl cenocepacia линия мышей I/St, позволяющая, проводить сравнительные исследования динамики инфекционного процесса, вызываемого различными штаммами этого возбудителя. С использованием этой линии мышей впервые экспериментально показана зависимость более длительной персистенции бактерий В. cenocepacia в органах зараженных животных in vivo от способности возбудителя к формированию биопленок, определяемой in vitro.

Впервые при проведении гистопатологических исследований легких мышей, инфицированных штаммом с повышенной способностью к образованию биопленки, на поверхности альвеол наблюдали окрашенную эозином биопленку. Полученные результаты подтверждают, что способность к образованию биопленок у бактерий В. cenocepacia обусловливает воспалительный процесс в легких, длительную персистенцию возбудителя в организме экспериментальных животных, и даже приводит к гибели мышей.

Практическая значимость.

Медицинская микробиология и клиническая фармакология, к сожалению, только начинают подбираться к разработке современных медикаментозных препаратов с целью их воздействия на биопленки. Однако, в бактериологических лабораториях развитых стран уже начинают оценивать антисептики и антибиотики по эффективности их действия не только на изолированные микроорганизмы, но и на бактерии, находящиеся в составе биопленок. Несмотря на то, что представленная работа носит фундаментальный характер, ее практическая значимость состоит в получении коллекции штаммов В. cenocepacia с различной способностью к образованию биопленок, в применении комплекса методов и подходов для характеристики полученных мутантов in vivo и in vitro, что позволит оценивать степень влияния различных лекарственных средств на этот процесс и на способность образовывать биопленки различными видами бактерий.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. Биопленки: феномен, история вопроса.

Долгое время господствовало общепринятое представление, ' что в природных условиях бактерии живут в виде свободноплавающих (планктонных) клеток, например в поверхностных слоях морских или речных вод, хотя тот факт, что бактерии способны образовывать сложные бактериальные сообщества, микробиологам был известен еще со времен А. Левенгука [Ильина, Романова, Гинцбург, 2004].

То, что более 99% известных бактериальных популяций существуют в природных экосистемах в виде специфически организованных, прикрепленных к различным субстратам сообществ — биопленок, стало ясно благодаря исследованиям последнего десятилетия, которые показали: планктонная, или свободноплавающая, микробиологическая фаза является, прежде всего, стадией 8 перемещения с одной поверхности на другую. Способность к образованию биопленок в последние годы была обнаружена более чем у 50 видов бактерий [Веселова, 2008].

Прогрессу в понимании феномена биопленок способствовало совершенствование техники микроскопирования и особенно применение конфокального сканирующего лазерного микроскопа (KCJIM), позволившее изучать микроструктуру живых биопленок [Costerton, Geesy et al., 1987; Donlan, 2002].

Биопленки — это высокоорганизованные бактериальные сообщества, образованные бактериями одного или нескольких видов и состоящие как из активно функционирующих клеток [Costerton, Lewandowsky et al., 1995; Donlan, Costerton, 2002.], так и из покоящихся, или некультивируемых, форм [Stoodley et al., 2002], заключенных в экзополимерный матрикс [Costerton, Geesy et al., 1987].

Ряд авторов [Costerton, Geesy et al., 1987; Davey, O’Tool, 2000; Shapiro, 1998] считают образование биопленок морфологической дифференциацией в ответ на воздействие факторов внешней среды, таких как изменение температуры, рН среды, осмолярность, что сопровождается изменением метаболизма, гидродинамики, коммуникативных связей и т. д.

Сложная архитектура биопленок обеспечивает возможность метаболической кооперации клеток внутри пространственно хорошо организованных систем, создает условия, благоприятствующие-установлению симбиотических взаимоотношений между бактериями разных видов и защите от воздействия внешней среды. Биопленки пронизывает сеть водных каналов, обеспечивающих доставку питательных веществ членам сообщества и удаляющих продукты метаболизма.

Образование биопленок является сложным многошаговым и строго регулируемым биологическим процессом. Индивидуальные члены сообщества имеют «специфические обязанности», которые, комбинируясь с другими, усиливают жизнеспособность всего консорциума, что подтверждается экспрессией в разных клетках одной биопленки разных генов и синтезом белков различного назначения. Эти факты, а также объединение клеток бактерий в биопленке сложными межклеточными связями позволяет рассматривать биопленку в качестве функционального аналога многоклеточного организма [Shapiro, 1998].

Господство биопленок было установлено, за небольшими исключениями, во всех природных экосистемах. Они образуются на поверхностях различного происхождения (биотических и абиотических) как в природе, так и в организмах различных хозяев, причем предпочтительно на инертных поверхностях или на мертвых тканях. Такой способ существования бактерий создает большие проблемы в промышленности (коррозия), а также в медицине, поскольку бактерии образуют биопленки на медицинских инструментах, имплантируемом оборудовании (линзы, катетеры, в том числе сердечные, внутривенные и мочевыводящие, а также протезы, искусственные клапаны сердца и т. д.) и фрагментах мертвой ткани, таких как омертвевшая часть кости. Они могут также формироваться на живых тканях, как в случае эндокардитов у пациентов, подвергавшихся хирургическим операциям на сердце, а также в легких у больных кистозным фиброзом (КФ).

Считается, что около 60% внутрибольничных инфекций обусловлены биопленками [Романова, Смирнова с соавт., 2006].

Благодаря KCJIM можно наблюдать за самим развитием биопленочных сообществ. Так, первичное прикрепление планктонных бактерий, при котором существенная роль отводится флагеллам и пилям, наблюдается как обратимый процесс — некоторые клетки. способны открепляться. Следующая стадия развития биопленок — созревание, при котором клетки теряют подвижность, прикрепление становится необратимым, нарастает пленочная биомасса, формируются трехмерные грибовидные или колоннообразные структуры. Третий период — процесс дисперсии бактерий из внутренних участков биопленки в окружающую среду: бактерии приобретают подвижность, выплывают через открытые каналы [Ильина, Романова, Гинцбург, 2004].

В процессе образования биопленок микроколонии развиваются в макроколонии, а затем в зрелую биопленку, что обеспечивается продукцией экзополисахаридов (EPS). Экзополисахариды биопленки формируют барьер между клетками и внешней, окружающей их средой и обеспечивают защиту бактерий от различных стрессовых ситуаций (УФ-облучение, высыхание, воздействие антибактериальных препаратов). Одним из основных структурных компонентов биопленок является матрикс — полимерное вещество, состоящее из смеси экзополисахаридов, белков, гликопротеинов, гликолипидов и, в некоторых случаях, нуклеиновых кислот. Матрикс представляет собой некую сеть, которая удерживает клетки биопленки вместе, обеспечивая механическую стабильность в поддержании пространственного расположения микроконсорциума в течение долгого периода. J.W. Costerton с соавт. [Costerton, Geesey et al., 1978] еще в 1978 году заметили, что сообщество прикрепленных бактерий в водной среде заключено в полисахаридный матрикс. Его механическая стабильность обеспечивается гидрофобными взаимодействиями, связыванием мультивалентных катионов и «запутанностью» биополимеров. Матрикс взаимодействует с окружающей средой, например, прикрепляет биопленку к различным поверхностям, позволяет «захватывать» растворенные вещества и частички различных субстанций из окружающей среды, обеспечивая, таким образом, питательными веществами биопленочные организмы.

На сегодняшний день известно, что у различных видов бактерий состав матрикса различается. Показано, что основным компонентом матрикса биопленок, образуемых S. typhimurhim, является целлюлоза, у P. aeruginosa таким веществом является альгинат (полианионный полисахарид), а у В. cepacia — экзополисахарид, получивший наименование по видовому названию бактерий «сепациан» [Cunha, Sousa et al., 2004].

В состав матрикса биопленок, как было сказано выше, входят также нуклеиновые кислоты, так называемая экстраклеточная ДНК (эДНК). Как правило, нуклеиновые кислоты локализованы внутри живых клеток и выполняют основную функцию, хранение и передачу генетической информации, а эДНК, главным образом, рассматривалась как результат лизиса клеток. Однако U. Bockelmann с соавт. [Uta Bockelmann et al., 2006] показали, что эДНК бактерий формирует некую пространственную структуру. На примере водных бактерий {Aquatic bacteria) штамма F8 было показано, что эДНК образует стабильную сеть филаментов. При сравнении последовательностей эДНК и геномной ДНК этих бактерий обнаружилось как их большое сходство, так и некоторые различия. Известно также, что некоторые (но не все) бактерии способны продуцировать большое количество эДНК. Показано, что ее образование может происходить как при росте биопленок, образованных бактериями одного вида, так и при формировании биопленок, образованных несколькими видами бактерий. Предполагается также роль эДНК в обмене генетической информацией в результате естественной трансформации, а также использовании ее клетками в качестве источника питания при голодании [Steinberg R.E. et al., 2005]. Несмотря на то, что остается еще много вопросов, касающихся источников появления и функций эДНК, ее роль при формировании биопленок несомненна.

Сложная архитектура биопленок обеспечивает возможность метаболической кооперации клеток и создает условия для установления симбиотических взаимоотношений в одной биопленке между бактериями разных видов [Costerton, Lewandowsky, 1995]. В большинстве природных и индустриальных сред биопленки представляют собой комплекс сообществ, состоящих более чем из одного микробного вида. Биопленки, состоящие из нескольких видов, часто толще и стабильнее, чем моновидовые, что может усиливать и без того их чрезвычайную устойчивость к антимикробным агентам [Al-Bakri, Gilbert et al., 2004]. При этом между отдельными клетками бактерий, принадлежащих к одному и тому же виду, а также разным видам, родам и даже семействам, осуществляется передача информации с помощью определенного рода сигнальных молекул, которые можно считать «словами» в своеобразном языке бактерий. В подобном поведении проявляются черты сходства бактерий с многоклеточными организмами: бактерии используют преимущества «социального поведения». Передача информации способствует быстрой адаптации популяции бактерий к меняющимся условиям и их выживанию в природной среде [Miller, Bassler, 2001; Завильгельский, Манухов, 2001; Taga, Bassler, 2003; Гинцбург, Ильина, Романова, 2003; Waters, Bassler, 2005].

Глава 2. Методы исследования биопленок.

2.1. Микроскопические методы.

Как было сказано выше, J.W. Costerton с соавт. еще в 1987 году определили, что биопленки состоят из отдельных клеток и микроколоний, заключенных в экзополимерный матрикс, и до 1990 года биопленки воспринимались как некие неструктурированные наросты. Такое представление основывалось на результатах изучения биопленок при электронном и световом микроскопировании. Первые исследования биопленок были выполнены с помощью сканирующего электронного микроскопа, причем подготовка препаратов, основанная на использовании дегидратантов, приводила к разрушению образцов перед анализом и к артефактам: внеклеточные полимерные субстанции, состоящие на 95 процентов из воды, выглядели как волокна, а не как плотный желеобразный матрикс, окружающий клетки [Donlan, Costerton, 2002]. Световое микроскопирование дает искажения из-за внефокусных эффектов.

Попытки изучать биопленки с помощью трансмиссионной электронной микроскопии были неудачны, поскольку сама технология подготовки образцов приводила к их обезвоживанию и разрушению. Применение же трансмиссионного микроскопического анализа с использованием специальных полисахаридных красителей типа «рутения красного» позволило прояснить природу внеклеточных волокон в биопленке и их ассоциации с клетками [Donlan, Costerton, 2002].

Для изучения живых клеток и наблюдения их в процессе движения, в том числе при образовании биопленок, применяются фазово-контрастный и интерференционный микроскопы. Фазово-контрастная микроскопия служит для получения контрастных изображений прозрачных и бесцветных живых объектов, невидимых при обычных методах микроскопирования. В интерференционной микроскопии используется эффект интерференции, возникающий при комбинации двух наборов волн, который создает изображение микроструктур. При фазово-контрастной и интерференционной микроскопии регистрация движения клеток может производиться с помощью цейтраферной (покадровой) микрокиносъемки.

Конфокальный сканирующий лазерный микроскоп (KCJIM), изобретенный еще в 50-х годах XX века, сначала не применялся для изучения бактерий. По мере накопления данных о распространенности и роли биопленок в природных процессах, в медицине и промышленности выявилась необходимость поиска новых методов их исследования. С помощью КСЛМ стало возможным проводить непосредственное наблюдение за живыми биопленками. Сочетание КСЛМ и эпифлуоресцентной микроскопии за счет комбинации красителей и специально разработанных компьютерных программ позволяло выявлять общее число клеток и процентный состав клеток в биопленке [Dennis, Zylstra, 1998].

Для наблюдения за процессом формирования биопленок с использованием КСЛМ конструируют так называемые проточные камерынепрерывно-проточные системы из тефлона, металла либо пластика, сквозь которые непрекращающимся потоком пропускают питательную среду. Камеры снабжены визуализационными отверстиями, позволяющими осуществлять непосредственное наблюдение за процессом образования и развития биопленки без ее разрушения. Такие камеры чаще всего бывают однопроточными — для того чтобы свежая среда, поступающая в систему, проходила сквозь клетки и накапливалась в них, но не рециркулировала.

Описываемые камеры использовались для исследования биопленок в различных гидродинамических состояниях, при которых питательную среду пропускали в виде либо ламинарного, либо турбулентного течения. Структура биопленок изменяется в ответ на различные проточные состояния биопленок, выращенных под ламинарным потокомбиопленки представляют собой нечто вроде обрывков, состоящих из неровных овальных клеточных агрегатов, разделенных пустотамибиопленки, выращенные в турбулентном потоке, также представляли собой участки, похожие на лохмотья, но вытянутые наподобие ленты, которая колеблется в толще текущей (вращающейся) жидкости. Исследования показали, что биопленка полиморфна и структурно адаптирована к изменяющемуся количеству питательных веществ.

выводы.

1. Методом инсерционного мутагенеза получено более 1000 инсерционных клонов Burkholderia cenocepacia со случайным внедрением пласпозона pTnMod-RKm в хромосому. Тотальная проверка инсерционных клонов позволила выделить 36 мутантов с измененной способностью к формированию биопленки и у 3-х мутантов идентифицировать мутантные гены.

2. Клонирование фрагментов мутантных генов, содержащих инсерцию пласпозона, и секвенирование клонированных фрагментов, позволило впервые идентифицировать три гена ompR, cydB и tetR, участвующих в генетическом контроле процесса образования биопленок у В. cenocepacia.

3. С помощью протеомного анализа показана дифференциальная экспрессия гена groE в штаммах с мутациями cydB' и ompR", что предполагает роль белка GroEL в процессе формирования биопленок бактериями В. cenocepacia.

4. Трансмиссионный электронно-микроскопический анализ позволил выявить ультраструктурные особенности строения организации биопленок, образуемых родительским и мутантными штаммами В. cenocepacia.

5. Выявлена наиболее чувствительная к инфекции В. cenocepacia линия мышей, позволяющая проводить сравнительные исследования динамики инфекционного процесса, вызываемого различными штаммами В. cenocepacia.

6. Экспериментально in vivo показана более длительная персистенция в органах зараженных животных мутанта cydB' с повышенной способностью к образованию биопленок по сравнению с исходным штаммом и другими мутантными штаммами.

7. Патоморфологические исследования показали, что в легких мышей, зараженных бактериями мутанта cydB' с повышенной способностью к формированию биопленок, происходят воспалительные процессы, проявляющиеся в инфильтрации альвеол и стромы легкого лейкоцитами и их скопление вокруг бронхов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Многолетние исследования российских и зарубежных ученых в области образования биопленок патогенными бактериями, в том числе бактериями, имеющими большое медицинское значение — ответственными за развитие легочных и других хронических инфекций Е. coli, P. aeruginosa, В. cenocepacia, показали, насколько сложным и строго регулируемым является этот биологический процесс.

Авторами описываются стадии развития биопленочных сообществ, приводятся многочисленные данные о структурной организации биопленок, об экспрессии генов бактерий на разных стадиях развития биопленок и о ее регуляции, описываются соответствующие методы исследованиямикроскопические и генетические, выясняется значение биопленок в патогенезе хронических инфекций, указываются различные причины устойчивости биопленок к проникновению антимикробных агентов, обсуждается значимость исследований в этой области для медицины, в частности для поиска мер профилактики и защиты против патогенных бактерий, для создания нового класса антимикробных препаратов.

Приведенный выше обзор научной литературы последнего десятилетия свидетельствует о том, что достигнут немалый прогресс в области изучения генетического контроля процесса образования биопленок у В. cenocepacia, являющегося среди представителей рода Burkholderia наиболее интересным, с необычным строением генома микроорганизмом, значимость которого как возбудителя инфекционных заболеваний еще не до конца распознана. В частности, показана роль сигнальной генетической системы «quorum sensing», описаны механизмы генетического контроля каждой из стадий процесса образования биопленок, а также раскрыта роль экзополисахаридного матрикса и различных клеточных структур — флагелл, пилей, курли, а также фимбрий и некоторых других адгезиноспособных структур клеток на разных стадиях биопленкообразования, в том числе во время начального прикрепления к субстрату планктонных бактерий.

Тем не менее исследование самого феномена образования биопленок патогенными бактериями разных видов и генетического контроля этого процесса продолжается и в России и за рубежомэто свидетельствует о важности и актуальности исследований одного из механизмов, ответственного за хроническое течение инфекционного процесса, с целью создания базы для разработки подходов к поиску новых средств борьбы с хроническими инфекциями.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Глава 7. Материалы и методы.

7.1. Штаммы бактерий, плазмиды и условия выращивания бактериальных культур

Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в работе, представлены в табл. 2.

Показать весь текст

Список литературы

  1. А.С., Тарасова Н. Н., Хмель И. А. Регуляция формирования биопленок у Escherichia coli: влияние мутаций в генах hns, stpA, lon, rpoN 3. 1. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2008- № 4.
  2. М.А. Изучение Quorum sensing систем регуляции у Pseudomonas chiororaphis и Burkholderia cepacia. // Автореф. дисс. к.б.н. М., -2008.
  3. А.Л., Ильина Т. С., Романова Ю. М. -2003. «Quorum sensing» или социальное поведение бактерий. // Ж. микроб., эпидемиол., иммунобиол. № 5, -С. 86−93.
  4. Г. Б., Манухов И. В. «Quorum sensing», или как бактерии «разговаривают» друг с другом. // Молекуляр. Биология. -2001. Т. 35. № 2. -С. 268−277.
  5. Т.С., Романова Ю. М., Гинцбург А. Л. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития. // Генетика. -2004. Т. 40. № 11. -С. 1445−1456.
  6. Т.С., Романова Ю. М., Гинцбург А. Л. Системы коммуникаций у бактерий и их роль в патогенности. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология: научно-теоретический журнал. -2006. № 3. -С. 22−29.
  7. Г. Ф. Биометрия. // М: Высш. шк., -1990. -С. 1−352.
  8. Г. В., Гинцбург А. Л. Методы флюоресцентной детекции и их применение в микробиологии. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. -2004. № 3. -С. 30−40.
  9. Л.И. Искусственные генетические системы. // -2004. Том 1. Москва. Наука.
  10. Ю.М., Смирнова Т. А., Андреев А. Л. и др. Образование биопленок — пример «социального» поведения бактерий. // Микробиология. -2006. Том 75. № 4. -С 1−6.
  11. B.H. Основы теории биоценологии. // M., -1947. -С. 283.
  12. И.А., Чернуха М. Ю. // Молекул. Генетика. -2003. № 2. -С. 3−10.
  13. И.А., Хмель И. А., Романова Ю. М. и др. Клинические штаммы комплекса Burkholderia cepacia: характеристика и выявление компонентов регуляторной системы Quorum sensing. // Молекуляр. генетика, микробиология и вирусология. -2003. № 4. -С. 15−20.
  14. Alisson D.G. The biofilm matrix. // Biofouling. 2003.V. 19: P. 139−150.
  15. Aim R.A., and Mattick J.S. Genes involved in the biogenesis and function of type-4 fimbriae in Pseudomonas aeruginosa. II Gene. -1997.V. 192: -P. 89−98.
  16. Al-Bakri A.G., Gilbert P. and Allison D.G. Immigration and emigration of Burkholderia cepacia and Pseudomonas aeruginosa between and within mixed biofilm communities. // Journal of Applied Microbiology. -2004. V. 96. -P. 455−463.
  17. Bakker D., Willemsen P.T., Simons L.H., van Zijderveld F.G. & de Graaf F.K. Characterization of the antigenic and adhesive properties of FaeG, the major subunit of K88 fimbriae. // Mol. Microbiol. -1992. V. 6: -P. 247−255.
  18. Bernier S.P., and Sokol P.A. Use of supression-subsractive hybridization to identify genes in the Burkholderia cepacia compex that are unique to Burkholderia cenocepacia. II J. Bacteriol. -2005. V. 187: -P. 5278−5291.
  19. Bentzmann de S., Aurouze M., Ball G., and Filloux A. FppA, a Novel Pseudomonas aeruginosa Prepilin Peptidase Involved in Assembly of Type IVb Pili. // J. Bacteriol. -2006. V. 188: -P. 4851 4860.
  20. Ben Nasr A., Olsen A. et al. Assembly of human contact phase proteins and release of bradykinin at the surface of curli-expressing Escherichia coli. // Mol Microbiol. -1996. V. 20(5): -P. 927−35.
  21. Belas R., Schneider R., and Melch M. Characterization of Proteus mirabilis Precocious Swarming Mutants: Identification of rsbA, Encoding a Regulator of Swarming Behavior. // J. Bacteriol. -1998. V. 180: -P. 6126 6139.
  22. Bieber D., Ramer S.W. et al. Type IV Pili, Transient Bacterial Aggregates, and Virulence of Enteropathogenic Escherichia coli. // Science. -1998. V. 280: -P. 2114.
  23. Burkholder W.H. Sour skin, a bacterial rot of onion bulbs. // Phitopathology. -1950. V. 40: -P. 115−117.
  24. Buell C.R., and Anderson A.J. Genetic analysis of the aggA locus involved in agglutination and adherence of Pseudomonas putida, a beneficial fluorescent pseudomonad. //Mol. Plant Microbol Interact. -1992. V. 5: -P. 154−162.
  25. Bockelmann U, Janke A, Kuhn R. et al. Bacterial extracellular DNA forming a defined network-like structure. // FEMS Microbiology Letters. -2006. V. 262. -P. 31−38.
  26. Caiazza N.C., Merritt J.H. et al. Inverse Regulation of Biofilm Formation and Swarming Motility by Pseudomonas aeruginosa PA14. // J. Bacteriol. -2007. V. 189: -P. 3603 -3612.
  27. Characklis W.G., and Marshall K.C. Biofilms: a basis for an interdisciplinaly approach,. In Charaklis W.G. and Marshall K.C. (ed.) Biofilms. John Wiley & Sons. -1990. -P. 3−5.
  28. Chater K.F. Genetics of differentiation in Streptomyces. // Annu. Rev. Microbiol. -1993. V. 47: -P. 685−713.
  29. Cheng H., Lessie T. Multiple replicons constituting the genome of Pseudomonas cepacia 17 616. //J. Bacteriol. -1994. № 176. -P. 4034−4042.
  30. Costerton J.W., Cheng K.-J., Geesey G.G., Ladd T.I., Nickel J.C., Dasgupta M., and Marrie T.J. Bacterial biofilms in nature and disease. // Annu. Rev. Microbiol. -1987. V. 41: -P. 435−464.
  31. Collins F.S. Cystic fibrosis: molecular biology and therapeutic implications. // Science. -1992. V. 256: -P. 774 779.
  32. Costerton J.W., Geesey G.G., and Cheng G.K. How bacteria stick. // Sci. Am. -1978. V. 238:-P. 86−95.
  33. Costerton J.W., Cheng K.-J., Geesey G.G., Ladd T.I., Nickel J.C., Dasgupta M., and Marrie T.J. Bacterial biofilms in nature and disease. // Annu. Rev. Microbiol. -1987. V. 41: -P. 435−464.
  34. Corbett C.R., Burtnick M.N., Kooi C., Woods D.E., and Sokol P.A. An extracellular zinc metalloprotease gene of Burkholderia cepacia. II Microbiology. -2003. V. 149: -P. 2263−2271.
  35. Costerton J.W., Lewandowski Z., Caldwell D.E., Korber D.R., and Lappin-Scott H.M. Microbial biofilms. // Annu. Rev. Microbiol. -1995. V. 49: -P. 711 745.
  36. Collinson S.K., Emody L. et al. Purification and characterization of thin, aggregative fimbriae from Salmonella enteritidis. // J. Bacteriol. -1991. V. 173: -P. 4773 -4781.
  37. Crosa J.H. Genetics and molecular biology of siderophore-mediated iron transport in bacteria. // Microbiol. Rev. -1989. V. 53: -P. 517−530.
  38. Cox C.D., and Graham R. Isolation of an iron-binding compound from Pseudomonas aeruginosa. II J. Bacteriol. -1979. V. 137: -P. 357−364.
  39. Davies D.G., Geesey G.G. Regulation of the alginat biosynthesis gene algC in Pseudomonas aeruginosa during biofilm development in continuous culture. // Appl. Environ. Microbiol. -1995. V. 61: -P. 860−867.
  40. Davies D.G., Parsek M.R., Pearson J.P., Iglewski B.H., Costerton J.W., and Greenberg E.P. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm. // Science. -1998. V. 280: -P. 295−298.
  41. Davey M.E., O’Tool G.A. Microbiol Biofilms: from ecology to molecular genetics. // Microbiol, and Molecular Biol. Rew. -2000. V. 4. -P. 847−864.
  42. Danese N., Pratt L.A., Dove S., and Kolter R. The outer-membrane protein, Ag43, mediates cell-to-cell interactions in of E. coli biofilms. // Mol. Microbiol. -2000. V. 37: -P. 424−432.
  43. Davies D.G., and Geesey G.G. Regulation of the alginate biosynthesis gene algC in Pseudomonas aeruginosa during biofilm development in continuous culture. // Appl. Environ. Microbiol. -1995. V. 61: -P. 860−867.
  44. Darling P., Chan M., Cox A. D., and Sokol P.A. Siderophore production by cystic fibrosis isolates of Burkholderia cepacia. II Infect. Immun. -1998. V. 66: -P. 874−877.
  45. Dennis J.J. and Zylstra G.J. Plasposons: Modular Self-Cloning Minitransposon Derivatives for Rapid Genetic Analysis of Gram-Negative Bacterial Genomes. // Appl. Envir. Microbiol. -1998. V. 64: -P. 2710 2715.
  46. Donlan R.M., Costerton J.W. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. // Clinical Microbiology, -2002, -P. 167−193.
  47. Donlan R.M. Biofilms: microbial life on surfaces. // Emerg. Infect. Disease. -2002. V. 8. -P. 881−890.
  48. Duan K., Dammel C. et al. Modulation of Pseudomonas aeruginosa gene expression by host microflora through interspecies communication. // Mol Microbiol. -2003. V. 50(5): -P. 1477−91.
  49. Dworkin M. Recent advances in the social and developmental biology of the myxobacteria. //Microbiol. Rev. -1996. V. 60: -P. 70−102.
  50. Eberhard A. Inhibition and activation of bacterial luciferase synthesis. // J. Bacteriol. -1972. V. 109: -P. 1101−1105.
  51. Elsen S., Swem L.R., Danielle L. Swem and Bauer C.E. RegB/RegA, a Highly Conserved Redox-Responding Global Two-Component Regulatory System. // Microbiol. Mol. Biol. Rev. -2004. V. 68: -P. 263 279.
  52. Egan S.M. Growing repertoire of AraC/XylS activators. // J. Bacteriol. -2002. V. 184: -P. 5529−5532.
  53. Engebrecht J., Nealson K., and Silverman M. Bacterial bioluminescence: Isolation and genetic analysis of functions from Vibrio fischeri. // Cell. -1983. V. 32:-P.773−781.
  54. Erickson D.L., Endersby R., Kirkham A. et al. Pseudomonas aeruginosa quorum sensing system may control virulence factor expression in the lungs of patients with cystic fibrosis. // Infect. Immun. -2002. V. 70: -P. 1783−1790.
  55. Finlay B.B. and Falkow S. Common themes in microbial pathogenicity revisited. //Microbiol. Mol. Biol. Rev. -1997. V. 61: -P. 136 169.
  56. Finelli A., Gallant C.V., Jarvi K., and Burrows L.L. Use of In-Biofilm Expression Technology To Identify Genes Involved in Pseudomonas aeruginosa Biofilm Development. // J. Bacteriol. -2003. V. 185: -P. 2700 -2710.
  57. Francez-Charlot A, Laugel B. et al. RcsCDB His-Asp phosphorelay system negatively regulates the flhDC operon in Escherichia coli. // Mol Microbiol. -2003 V. 49(3): -P. 823−32.
  58. Friedman L. and Kolter R. Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms. // Mol Microbiol. -2004. V. 51(3): -P. 675−90.
  59. Fuqua W.C., Greenberg E.P. Listening in on bacteria: acyl-gomoserin lacton signaling. //Nat. Rev. Mol. Cell Biol. -2002. V. 3. -P. 685−695.
  60. Fuqua W.C., Winnas S.C., Greenberg E.P. Quorum sensing in bacteria: the luxR/luxI family of cell density rensponsive transcriptional regulation. // J. Bacteriol. -1994. V. 176: -P. 269−275.
  61. Fuqua W.C., Parsec M.R., Greenberg E.P. Regulation of gene expression by cell-to cell communication: acyl-gomoserin lacton quorum sensing. // Annu. Rev. Gen. -2001. V. 35. -P. 439−468.
  62. Gambello M.J. and Iglewski B.H. Cloning and characterisation of the Pseudomonas aeruginosa lasR gene, a transcriptional activator of elastase expression. // J. Bacteriol. -1991.V. 173: -P. 3000−3009.
  63. Genevaux P., Muller S. and Bauda P. A rapid screening procedure to identify mini-TnlO insertion mutants of Escherichia coli K-12 with altered adhesion propertiese. // FEMS Microbiol. Lett. -1996. V. 142: -P. 27−30.
  64. Genevaux P., Bauda P., DuBow M.S., and Oudega B. Identification of TnlO insertions in rfaG, rfaP, and galU genes involved in lipopolisaccharide core biosynthesis that affect Escherichia coli adhesion. // Arch. Microbiol. -1999. V. 172: -Pp. 1−8.
  65. Gillian S.H. et al. New rules on medicines. // Vet Rec. -1995. V. 136: -P. 203.
  66. Govan J.R.W., Vandamme P. Agricultural and medical microbiology: a time for bridging gaps. // Microbiol. -1998. V. 144: -P. 2373−2375. '
  67. Govan J.R.W., and Deretic V. Microbiol pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. // Microbiol. j
  68. Rev. -1996. V. 60: -P. 539−574.
  69. D., Bergonzelli G.E., Pridmore R.D. // Infect, and Immun. -2004. V. 72. № 4. -P. 2160−2169.
  70. Guerinot M.L. Microbial iron transport. -1994. // Annu. Rev. Microbiol. V. 48: -P. 743−772.
  71. Hatchison M.L., Poxton I.R., and Govan J.R. Burkholderia cepacia produces a hemolysin that is capable of inducing apoptosis and degranulation of mammalian phagocytes. -1998. // Infect. Immune. V. 66: -P. 2033−2039.
  72. Hales B.A., Morgan J.A., Hart C.A., and Winstanley C. Variation in flagellin genes and proteins of. -1998. // J. Bacteriol. V. 180: -P. 1110−1118.
  73. Heilmann C., Gerke C., Perdreau-Remington F., and Gotz F. -1996. Characterization of Tn917 insertion mutants of Staphylococcus epidermidis affected in biofilm formation. // Infect Immun. V. 64: -P. 277−282.
  74. Holmes A., Govan J., Goldstein R. Agricultural use of Burkholderia (Pseudomonas) cepacia: a threat to human haelth. // Emerg. Infect. Disease. -1998. V. 4. -P. 221−227.
  75. Huber В., Riedel K., Hentzer M. et al., The сер quorum-sensing system of Burkholderia cepacia Hill controls biofilm formation and swarming motility. //Microbiology. -2001. V. 147: -P. 2517 2528.
  76. Hultgren S.J. and Normark S. Biogenesis of the bacterial pilus. // Curr Opin Genet Dev.-1991. V. 1(3): -P. 313−318.
  77. Isles A. Maclusky I. Corey M. et al. Pseudomonas cepacia infection in cystic fibrosis: an emerging problem. // J. Pediatr. -1984. V. 104(2): -P. 206−10.
  78. A.A., Simons B.H. & de Graaf F.K. The role of lysine-132 and arginine-136 in the receptor-binding domain of the K99 fibrillar subunit. // EMBO J. -1987. V. 6: -P. 1805−1808.
  79. Jungblut P.R., Bumann D., Haas G. et al. Comparative proteome analysis of Helicobacter pylori. // Mol Microbiol. -2000. V. 36(3): -P. 710−252.
  80. Kaiser D., and Losick R. How and why bacteria talk to each other. // Cell. -1993.V. 73:-P.873−885.
  81. Kachlany S.C., Planet P.J. et al. flp-1, the first representative of a new pilin gene subfamily, is required for non-specific adherence of Actinobacillus actinomycetemcomitans. //Mol Microbiol. -2001. V. 40(3): -P. 542−54.
  82. Kempner E.S. and Hanson F.E. Aspects of light production by Photobacterium fischeri. //J. Bacteriol. -1968. V. 95: -P. 975−979.
  83. Kievit De T.R. and Iglewski B.H. Bacterial Quorum Sensing in Pathogenic Relationships. // Infection and Immunity. -2000. V. 68. -P. 4839−4849.
  84. Klausen M., Heydorn A., Ragas P. et al. Biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa wild type, flagella and type IV pili mutants. // Mol Microbiol. -2003. V. 48(6): -P. 1511−24.
  85. Kooi C., Subsin В., Chen R., Pohorelic В., and Sokol P.A. Burkholderia cenocepacia ZmpB Is a Broad-Specificity Zinc Metalloprotease Involved in Virulence. //Journal of Bacteriology. -2005. V. 187. №. 15. -P. 5278−5291.
  86. Kothe M., Antl M., Huber В., Stoecker K., Ebrecht D., Steinmetz I., and Eberl L. Killing of Caenorhabditis elegans by Burkholderia cenocepacia iscontrolled by the сер quorum-sensing system. // Cell. Microbiol. -2003. V. 5: -P. 343−351.
  87. Krogfelt K.A. Bacterial adhesion: genetics, biogenesis, and role in pathogenesis of fimbrial adhesins of Escherichia coli. II Rev Infect Dis. -1991. V. 13:-P. 721−735.
  88. Krogfelt K.A., Bergmans H., and Klemm P. Direct evidence that the FimH protein is the mannose-specific adhesin of Escherichia coli type 1 fimbriae. // Infect. Immun. -1990. V. 58: -P. 1995 1998.
  89. Lefebre M.D. and Valvano M.A. Construction and Evaluation of Plasmid Vectors Optimized for Constitutive and Regulated Gene Expression in Burkholderia cepacia Complex Isolates. // Appl. Envir. Microbiol. -2002. V. 68: -P. 5956 5964.
  90. Lennin E. and DeCicco B. Plasmid of P. cepacia strains of diverse origins. // Appl. Environ. Microbiol. -1991. V. 57. -P. 2345−2350.
  91. Lewenza S., Conway В., Greenberg E.P., Sokol P.A., Quorum sensing in Burkholderia cepacia: identification of the LuxRI homologs CepRI. // J. Bacteriol. -1999.V. 181: -P. 748−756.
  92. Lewenza S., Sokol P.A. Regulation of ornibactin biosynthesis and N-acyl-l-homoserine lactone production by CepR in Burkholderia cepacia. J. Bacteriol. -200l.V. 183: -P. 2212−2218.
  93. LiPuma J.J., Mahenthiralingam E. Commercial use of Burkholderia cepacia. //Emerg. Infect. -1999. V. 5. -P. 305−306.
  94. Losick R., Youngman P., and Piggot P.J. Genetics of endospore formation in Bacillus subtilis. //Annu. Rev. Genet. -1986. V. 20: -P. 625−669.
  95. Lundberg J.O., Weitzberg E., Cole J.A., and Benjamin N. Nitrate, bacteria and human health. //Nat Rev Microbiol. -2004. V. 2(7): -P. 593−602.
  96. Lutter E., Lewenza S., Dennis J.J. et al. Distribution of quorum sensing genes in the Burkholderia cepacia complex. // Infect. Immun. -2001. V. 69: -P. 4661−4666.
  97. Marshall K.C. Interfaces in microbial ecology. // Harvard University Press, Cambridge, Mass. -1976. V. 15: -P. 44−47.
  98. Makin S.A., and Beveridge T.J. The influence of A-band and B-band lipopolisaccharide on the surface characteristics and adhesion of Pseudomonas aeruginosa to surfaces. // Microbiology. -1996. V. 142: -P. 299−307.
  99. Mary E.D., and O’Tool G.A. Microbial biofilms: from Ecology to Molecular Genetics. // Microbiology and Molecular biology reviews. -2000. V. 64. -P. 847−867.
  100. Marklund B.I., Tennent J.M., Garcia E. et al. Horizontal gene transfer of the Escherichia coli pap and prs pili operons as a mechanism for the development of tissue-specific adhesive properties. // Mol Microbiol. -1992. V. 6 (16): -P. 2225−2242.
  101. Meitsner T.A., and Morse S.A. The role of iron-binding proteins in the survival of pathogenic bacteria. // Annu. Rev. Nutr. -1994. V. 14: -P. 471−493.
  102. Meyer J.M., Hohnadel D., and Halle F. Cepabactin from Pseudomonas cepacia, a new type of siderophore. // J. Gen. Microbiol. -1989. V. 135: -P. 1479−1487.
  103. Meyer J.M., Van V.T., Stintzi A., Berge O., and Winkelmann G. Ornibactin production and transport properties in strains of Burkholderiavietnamiensis and Burkholderia cepacia (formerly Pseudomonas cepacia). // Biometals. -1995. V. 8: -P. 309−317.
  104. Meyer J.M., Azelvandre P., and Georges C. Iron metabolism in Pseudomonas fluorescens CHAO. // Biofactors. -1992. V. 4: -P. 23−27.
  105. Miller M.B. and Bassler B.L. Quorum sensing in bacteria. Annu Rev // Microbiol. -2001. V. 55: -P. 165−99.
  106. Nealson K.H., Piatt T. and Hastings J.W. Cellular control of the synthesis and activity of the bacterial luminescence system. // J. Bacteriol. -1970. V. 104: -P. 313−322.
  107. Neilands J.B. Siderophores: structure and function of microbial iron transport compounds. // J. Biol. Chem. -1995. V. 270: -P. 26 723−26 726.
  108. Nyvad В., and Kilian M. Comparision of the initial streptococcal microflora an dental enamel in cariese-active and in caries-inactive individuals. // Caries Res. -1990. V. 24: -P. 267−272.
  109. S., Vandamme P. & Govan J.R.W. Influence of taxonomic status on the in vitro antimicrobial susceptibility of the Burkholderia cepacia complex. // J. Antimicrobe Chemother. -2002. V. 50: -P. 265−269.
  110. Olsen A., Jonsson A., and Normark S. Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli. // Nature. -1989. V. 338 (6217): -P. 652−655.
  111. O’Toole GA., and Kolter R. The initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signaling pathways: a genetic analysis. // Mol. Microbiol. -1998. V. 30: -P. 295−304.
  112. O’Toole G.A. To Build a biofilm. // J. of Bacteriology. -2003. V. 185: -P. 2687−2689.
  113. O’Toole G.A., and Kolter R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. // Mol. Microbiol. -1998. V. 30 (2): -P. 295−304.
  114. O’Toole G.A., Gibbs К.A. et al. The Global Carbon Metabolism Regulator Crc Is a Component of a Signal Transduction Pathway Required for Biofilm Development by Pseudomonas aeruginosa^ // J. Bacteriol. -2000. V. 182: -P. 425−431.
  115. Parkins M.D., Ceri H., and Storey D.G. Pseudomonas aeruginosa GacA, a factor in multihost virulence, is also essential for biofilm formation. // Mol. Microbiol. -2001. V. 40: -P. 1215−1226.
  116. Parsek M.R. and Greenberg E.P. Quorum sensing signals in development of Pseudomonas aeruginosa biofilms. // Methods Enzymol, Jan -1999- V. 310: -P. 43−55.
  117. Pesci E.C., Milbank J.B., Pearson J.P. Quinoline signaling in the cell-to-cell communication system of Pseudomonas aeruginosa. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1999. V. 96: -P. 11 229−11 234.
  118. Pier G. Pseudomonas aeruginosa: a key problem in cystic fibrosis. // ASM News. -1998. V. 64: -P. 339−347.
  119. Pratt L.A., Kolter R. Genetic analisys of Escherichia coli biofilm formation: roles of flagella, motility, chemotaxis and type I pili. Mol. Microbiol. -1998. V. 30: -P. 285−294.
  120. Prigent-Combaret C., Vidal O. Dorel C., and Lejune P. Abiotic surface sensing and biofilm dependent regulation of gene expression in Eschericia coli. -1999. // J. Bacteriol. V. 181: -P. 5993−6002.
  121. A. -1992. Adhesins and receptors of associated with infection of the respiratory tract. // Microb. Pathog. V. 13: -P. 251−260.
  122. Priifi B.M., Besemann C. et al. A Complex Transcription Network Controls the Early Stages of Biofilm Development by Escherichia coli. // J. Bacteriol., Jun -2006- V. 188: -P. 3731 3739.
  123. Prigent-Combaret C., Brombacher E. et al. Complex Regulatory Network Controls Initial Adhesion and Biofilm Formation in Escherichia coli via Regulation of the csgD Gene. // Journal of Bacteriology, Dec. -2001, -P. 7213−7223.
  124. Ramos J.L., Marti’nez-Bueno M. et al. The TetR Family of Transcriptional Repressors. // Microbiology and molecular biology reviews, June -2005,-P. 326−356.
  125. Ren D, Bedzyk L.A., Thomas S.M., Ye R.W., Wood Т.К. Gene expression in Escherichia coli biofilms. // Appl Microbiol Biotechnol. -2004. Jan 16. V. 64(4): -P. 515−524.
  126. Richardson J., Stead D.E., and Coutts R.H. Incidence of the cblA major subunit pilin gene amongst Burkholderia species. // FEMS Microbiol Lett, Mar -2001- V. 196(1):-P. 61−66.
  127. Rodney M., Donlan and J. William Costerton. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms. // Clinical Microbiology Reviews. Apr -2002. -P. 167−193.
  128. Ryley H.C. et al. Characterisation of Burkholderia cepacia from cystic fibrosis patients living in Wales by PCR ribotyping. // J. Med. Microbiol. -1995.V. 43: p. 436−441.
  129. Sajjan U.S., Sun L., Goldstein R., Forstner J. F. // J. Bacteriol. 1995. V. 177: -P. 1030−1036.
  130. Saiman L., Ishimoto K., Lory S., and Prince A. The effects of piliation and exoproduct expression on the adherence of Pseudomonas aeruginosa to respiratory epithelial monolayers. -1990. // J. Infect. Dis. V. 161: -P. 541−548.
  131. U.S., & Forstner J.F. Role of a 22-kilidalton pilin protein in binding of Pseudomonas cepacia to buccal epithelial cells. -1993. // Infect Immun. V. 61:-P. 3157−3163.
  132. Sajjan U.S., Sylvester F.A., Forstner J. Cable-piliated Burkholderia cepacia bind to cytokeratin 13 of epithelial cells. -2000. // Infect Immun. V. 68: -P. 1787−1795.
  133. Sajjan U., Liu L. et al. Lack of cable pili expression by cblA-containing Burkholderia cepacia complex. // Microbiology, Nov -2002- V. 148: -P. 3477 -3484.
  134. Sajjan U. and Forstner J.F. Identification of the mucin-binding adhesin of Pseudomonas cepacia isolated from patients with cystic fibrosis. // Infect. Immun., Apr -1992- V. 60: -P. 1434 1440.
  135. Sajjan U., Xie H. et al. Identification and molecular analysis of cable pilus biosynthesis genes in Burkholderia cepacia. // Microbiology, Apr -2003- V. 149: -P. 961 -971.
  136. H., Munson G.P. & Scott J.R. A conserved residue in the tip proteins of CS1 and CFA/I pili of enterotoxigenic Escherichia coli that is essential for adherence. -1999. I I Proc Natl Acad Sci USA. V. 96: -P. 1 282 812 832.
  137. H., & Scott J.R. New tools in an old trade: CS1 pilus morphogenesis. -1998. // Mol Microbiol. V. 30: -P. 681−687.
  138. Sauer K., Camper A.K. et al. Pseudomonas aeruginosa displais multiple phenotypes during development as a biofilm. // J. Bacteriol. -2002. V. 184: -P. 1140−1154.
  139. Sauer K., Cullen M.C., et al. Characterization of Nutrient-Induced Dispersion in Pseudomonas aeruginosa PAOl Biofilm. // J. Bacteriol., Nov -2004- V. 186: -P. 7312 7326.
  140. Scordilis G.E., H. Ree, T.G. Lessie Identification of transposable elements which activate gene expression in Pseudomonas cepacia. // J. Bacteriol. -1987. V. 169: -P. 8−13.
  141. Sherry L. Kuchma, John P., Connoly, and O’Tool G.A. A Three-Component Regulatory System Regulates Biofilm Maturation and Type III Secretion in Pseudomonas aeruginosa. I I Journal of Bacteriology. Feb. -2005. -P. 1441−1454.
  142. Shapiro J.A. Bacterial as multicellular organism. // Sci. Am. -1998. V. 256: -P. 82−89.
  143. Shapiro J.A. Thinking about bacterial populations as multicellular organism. // Ann. Rev. Microbiol. -1998. V. 52: -P. 81−104.
  144. Simpson D.A., Ramphal R., and Lory S. Characterization of Pseudomonas aeruginosa fliO, a gene involved in flagellar biosynthesis and adherence. -1995. // Infect. Immun. V. 63: -P. 2950−2957.
  145. Slauch J.M., Mahan M.J., and Mekalanos J.J. In vivo expression technology for selection of bacterial genes specifically induced in host tissues. //MethodsEnzymol, Jan -1994- V. 235: -P. 481−92.
  146. Smith R.S., Harris S.G., Phillips R., Iglewski B. The Pseudomonas aeruginosa quorum sensing molecule N-(3-oxododecanoil) homoserine lacton contributes to virulence and induce inflammation in vivo. // J. Bacteriol. -2002, V. 184: -P. 1132−1139.
  147. Sokol P.A., Sajjan U., Visser M.B., Gingues S., Forstner J., and Kooi C. The CepIR quorum-sensing system contributes to the virulence of Burkholderia cenocepacia respiratory infections. -2003. I I Microbiology. V. 149: -P. 3649−3658.
  148. Sokol P.A., Lewis C.J., and Dennis J.J. Isolation of a novel siderophore from Pseudomonas cepacia. -1992. // J. Med. Microbiol. V. 36: -P. 184−189.
  149. Soto G.E. and Hultgren S.J. Bacterial Adhesins: Common Themes and Variations in Architecture and Assembly. // J. Bacteriol., Feb -1999- V. 181: -P. 1059 1071.
  150. Sousa S.A., Ulrich M., Bragonzi A. et al. Virulence of Burkholderia cepacia complex strains in gp91phox-/- mice. // Cell Microbiol, December 1, -2007- V. 9(12): c. 2817−25.
  151. Stoodley P., Sauer K. et al. Biofilms as complex differentiated communities. // Ann. Rev. Microbiol. -2002. V. 56: -P. 187−209.
  152. Stephan H., Freund S., Beck W., Jung G., Meyer J.M., and Winkelmann G. Ornibactins a new family of siderophores from Pseudomonas. -1993. // Biometals. V. 6: P. 93−100.
  153. Steinberger R. E, Holden P.A. Extracellular DNA in single- and multiple-species unsaturated biofilms. // Appl Environ Microbiol. 2005. V. 71(9): -P. 5404−10.
  154. Stevenson M.M., Kondratieva Т.К., Apt A.S., Tam M.F., and Skamene E. In vitro and in vivo T cell responses in mice during bronchopulmonary infection with mucoid Pseudomonas aeruginosa. // Clin Exp Immunol, January 1,-1995- V. 99(1): -P. 98−105
  155. Sun L., Jiang R.Z., Steinbach S. & 7 other authors. The emergence of a highly transmissible lineage of cbl+ Pseudomonas (Burkholderia) cepacia causing CF centre epidemics in North America and Britain. -1995. // Nat Med. V. 1: -P. 661−666.
  156. Su S., Stephens B.B., Alexandre G. et al. Lon protease of the -proteobacterium Agrobacterium tumefaciens is required for normal growth, cellular morphology and full virulence. // Microbiology, Apr -2006- V. 152: -P. 1197- 1207.
  157. Taga M.E. and Bassler B.L. Chemical communication among bacteria. // Proc. Natl. Acad. Sci. -2003. V. 100: -P. 14 549 14 554.
  158. Taga M.E., Semmelhack J.L., Bassler B.L., The luxS-dependent autoinducer AI-2 controls the expression of an ABC transport that functions in AI-2 uptake in Salmohella typhimurium. // Mol. Microbiol. -2001. V. 42: -P. 777−793.
  159. Teresa A. Urban, Adam Griffith, Anastasia M. Torok, Mark E. Smolhin, Jane L. Burns, and Joanna B. Goldberg. Contribution of Burkholderia cenocepacia Fagella to Infectivity and Inflammation. -2004. // Infection and Immunity. -P. 5126−5134.
  160. Tennent J.M., and Mattick J.S. Type 4 fimbriae, In P. Klemm (ed.), Fimbriae: adhesion, genetics, biogenesis, and vaccines. // Ann Arbor, Mich. CRC Press, -1994. -P. 127−146.
  161. Tomlin K.L., Clark S.R., and Ceri H. Green and red fluorescent protein vectors for use in biofilm studies of the intrinsically resistant Burkholderia cepacia complex. // J. Microbiol Methods, Apr -2004- V. 57(1): -P. 95−106.
  162. Tomich M. and Mohr C.D. Adherence and autoaggregation phenotypes of a Burkholderia cenocepacia cable pilus mutant. // FEMS Microbiol Lett, Nov -2003- V. 228(2): -P. 287−97.
  163. Tsilibaris V., Maenhaut-Michel G., and Van Melderen L. Biological roles of the Lon ATP-dependent protease. // Res Microbiol, Oct -2006- V. 157(8):-P. 701−13.
  164. Vasil M.L., Kreig D.P., Kuhns J.S. et al. Infect. -1990. // And Immun. V. 58: -P. 4020−4029.
  165. Vasseur P., Vallet-Gely I. et al. The pel genes of the Pseudomonas aeruginosa РАК strain are involved at early and late stages of biofilm formation. // Microbiology, Mar -2005- V. 151: -P. 985 997.
  166. Visser M.B., Majumdar S., Hani E., and Sokol P.A. Importance of the Ornibactin and Pyochelin Siderophore Transport Systems in Burkholderia cenocepacia Lung. // Infections Infect. Immun., May -2004- 72: -P. 2850 -2857.
  167. Vidal О., Longin R. et al. Isolation of an Escherichia coli K-12 Mutant Strain Able To Form Biofilms on Inert Surfaces: Involvement of a New ompR Allele That Increases Curli Expression. // J. Bacteriol., May -1998- V. 180: -P. 2442 2449.
  168. Waters C.M. and Bassler B.L. Quorum sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annu Rev Cell Dev Biol. -2005- V. 21: -P. 319−46.
  169. Wall D., and Kaiser D. Type IV pili and cell motility. // Mol. Microbiol. 1999. V. 32: p. 1−10.
  170. Whitchurch C.B., and Mattick J.S. Characterization of a gene, pilU, required for twitching motility but not phage sensitivity in Pseudomonas aeruginosa. 1994.//Mol. Microbiol. V. 13: p. 1079−1091.
  171. Whitchurch C.B., Hobbs M., Livingstone S.P., Krishnapillai V., and Mattick J.S. Characterization of Pseudomonas aeruginosa twitching motility gene and evidence for a specialised protein export sysrem in eubacteria. -1991. //Gene. V. 101:-P. 33−44.
  172. Zhu J., Miller M.B., Vance R.E. et al. Quorum sensing regulation control virulence gene expression in Vibrio cholerae. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2002. V. 99:-P. 3129−3134.
  173. Zielinski N.A., Chakrabarty A.M. and Alan Berry. Characterization and regulation of the Pseudomonas aeruginosa algC gene encoding phosphomannomutase. // The journal of biological chemistry. -1991. V. 266. № 15: -P. 9754−9763.
Заполнить форму текущей работой

Заказал и сдал!