Электронно-микроскопическое исследование сборки ядерной оболочки и ядерных поровых комплексов в растущих ооцитах амфибий

Отличительной особенностью эукариотических клеток является наличие ядра и ядерной оболочки (ЯдО), обеспечивающей разделение процессов репликации и транскрипции от трансляции. Стремительное развитие молекулярно-биологических и генетических методов значительно расширило современные представления о ЯдО. Она является не просто структурным барьером, но и важной функциональной органеллой, дефекты белков которой приводят к серьезным заболеваниям человека (Worman, Courvalin, 2000; Somech et al., 2005). Поэтому исследование структуры, функции и динамики ЯдО является одной из приоритетных задач не только для фундаментальной биологии, но и для практической медицины.

Расположенные в ЯдО ядерные поровые комплексы (ЯПК) выполняют ключевую роль в обеспечении активного и пассивного транспорта различных молекул между ядром и цитоплазмой (Smythe et al., 2000; Adam, 2001; Fahrenkrog, Aebi, 2003). Процессы сборки-разборки ЯдО и ядерных пор в делящихся клетках достаточно хорошо исследованы в условиях in vitro и in vivo в митозе (Zatsepina et al., 1977; Marshal, Wilson, 1997; Burke, Ellenberg, 2002; Мамон, 2005). Однако вопрос о том, каким образом формируются новые. участки ЯдО с ядерными порами на стадии интерфазы, когда в ЯдО уже присутствуют зрелые поры и ламина, практически не исследован.

Выяснение механизмов этого процесса требует детального анализа структурной организации, функции и динамики ЯдО и ее составных компонентов, выполненных на адекватной модели с использованием комплекса различных методов. Одной из наиболее удобных моделей для исследования сборки ЯдО в ядрах растущих неделящихся клеток являются ооциты амфибий. Ядро развивающегося ооцита существенно увеличивается в размере, не претерпевая деления, соответственно, растет и ЯдО. Эта особенность, в сочетании с крупными размерами клетки, определяет преимущество ооцита как подходящего объекта для изучения механизмов формирования ЯдО. Цели и задачи работы.

Цель настоящего исследования состояла в том, чтобы выяснить механизм сборки ядерной оболчки и ядерных поровых комплексов в растущих ооцитах амфибий и определить возможное участие внутриклеточных структур в этом процессе. Для осуществления заданной цели были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Сравнить ультраструктурную организацию ооцитов амфибий на разных стадиях их развития.

2. Провести морфологический и морфометрический анализ динамики мембран ЭПР в растущем ооците.

3. Оценить возможное участие пористых пластинок, содержащих цитоплазматические поры, в процессе формирования ядерной оболочки.

4. Проанализировать ультраструктурную динамику ядерной оболочки и ядерных пор в процессе роста ядра ооцита, в частности, определить, изменяется ли плотность распределения пор в ядерной оболочке на разных стадиях оогенеза.

5. Исследовать влияние инъекции антител к нуклеопорину р62, входящему в состав центрального отдела ядерного порового комплекса, на формирование ядерной оболочки и ядерных пор в ооцитах амфибий.

6. Сравнить механизм сборки ядерной оболочки в ооцитах амфибий и в митотически делящихся клетках синцитиальных эмбрионов дрозофилы на стадии интерфазы. На основании полученных данных создать модель формирования ядерной оболочки в растущих неделящихся клетках.

7. Определить локализацию внутриядерного актина и его взаимодействие с ядерной оболочкой.

Научная новизна и практическая ценность работы.

В работе проведен сравнительных анализ ультраструктурной организации растущих ооцитов амфибий на разных стадиях оогенеза. Установлено, что в процессе развития, одновременно с ростом ооцита и его ядра, меняется равномерность распределения пор в ЯдО. Параллельно наблюдается перераспределение внутриклеточных органелл в цитоплазме ооцита.

Впервые в цитоплазме ранних ооцитов обнаружены компактные миелиноподобные структуры, способные разворачиваться в мембраны ЭПР. Продемонстрирована четкая корреляция между стадией развития ооцита и распределением мембран ЭПР в определенной области цитоплазмы. На ИНУ стадиях оогенеза зарегистрировано множественное слияние пузырьков ЭПР с наружной ядерной мембраной и появление вблизи мест слияния фрагментов ЯдО, не имеющих пор. Гладкие мембранные пузырьки также обнаружены вблизи внутренней ядерной мембраны, что позволяет предположить возможность перемещения части мембраны пузырька через мембранный компонент ядерной поры внутрь ядра и во многом доказывает участие ЭПР в сборке наружной и внутренней ядерной мембран.

Впервые в ооцитах амфибий зарегистрировано слияние пористых пластинок, содержащих цитоплазматические поры, с наружной мембраной ЯдО, что доказывает причастность этих органелл к формированию новых участков ЯдО в этих клетках.

На уровне электронной микроскопии установлено, что сборка ЯПК в растущей ЯдО ооцита происходит через формирование промежуточных структур, и выявлены последовательные этапы этого процесса. Обнаружено, что блокирование нуклеопорина р62, одного из белков центрального отдела ЯПК, приводит к нарушению формирования поровых комплексов в растущей ЯдО.

Сочетание методов флуоресцентной и электронной микроскопии позволило выявить внутри ядра ооцитов актин-содержащие филаменты. Установлено, что при инкубации ооцитов с агентом, деполимеризующим филаментный актин, существенно изменяется морфология цитоплазмы и ядра, нарушается строение ЯдО. Обнаружение актин-содержащих филаментов в ядре ооцита открывает новые возможности для изучения функций внутриядерного актина, его роли в динамике внутрядерных структур и взаимодействии с актиновым цитоскелетом.

Проведенное детальное ультраструктурное исследование развивающихся ооцитов демонстрирует единство и тесную взаимосвязь мембранных компонентов клетки. С помощью методов флуоресцентной и электронной микроскопии удалось убедительно продемонстрировать, что формирование ЯдО — это сложный процесс, в который вовлечены различные внутриклеточные структуры. Данная работа подтверждает необходимость комплексного подхода, подразумевающего анализ динамики всех взаимосвязанных клеточных органелл с использованием различных методов, при проведении аналогичных исследований на других объектах.

Результаты проведенного исследования имеют существенное значение для понимания процессов, происходящих на самых ранних этапах оогенеза, и могут быть использованы в работах по изучению организации созревающих и оплодотворенных яйцеклеток, а также эмбриональных клеток. Результаты проведенных исследований имеют фундаментальное значение, поскольку демонстрируют новые аспекты происходящих в ооците процессов, предшествующих оплодотворению.

Полученные в работе данные представляют также определенный теоретический интерес, поскольку рост ооцита напоминает, в определенной степени, рост соматической клетки на стадии интерфазы, и формирование новых участков ЯдО ооцита происходит, как и в интерфазных ядрах, в уже существующей ЯдО, содержащей зрелые ЯПК и ламину. Можно предположить, что формирование ЯдО может проходить в интерфазных ядрах по аналогичному механизму.

Материалы диссертационной работы, опубликованные в обзорной статье в журнале «Цитология» (Морозова и др., 2005), используются при чтении лекций на Кафедре генетики и селекции в Санкт-Петербургском государственном университете и могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических и медицинских факультетов других университетов. Апробация работы.

Результаты, представленные в диссертации, докладывались на отчетной сессии Института цитологии и генетики в 2005 г. Основные положения диссертационной работы докладывались и обсуждались также на следующих российских и международных конференциях и симпозиумах: XLI Международная научная студенческая конференция (Новосибирск, 2003) — 3-я Международная научная конференция «Актуальные проблемы современной биологии и биотехнологии» (Астана, Казахстан, 2003) — 7-я Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Россия, Пущино, 2003) — Международный Симпозиум по проблемам Мейоза (Санкт-Петербург, 2003) — Российско-Китайский Симпозиум «Наука о жизни» (Пущино, 2004) — 8-я Азиатско-Тихоокеанская Конференция по Электронной Микроскопии (Канадзава, Япония, 2004) — III съезд ВОГиС (Москва, 2004) — Международная научная конференция «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология» (Минск, Беларусь, 2004) — Школа-Семинар Европейского Молекулярно-Биологического Сообщества «Молекулярный Транспорт. Каналы и Транспортеры» (Эриче, Сицилия, Италия, 2005) — 7-й Межнациональный Микроскопический Конгресс (Портороз, Словения, 2005) — Конференция Европейского Молекулярно-Биологического Сообщества «Структура и динамика клеточного ядра» (Гран-Мотте, Франция, 2005) — XV Всероссийское Совещание «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург. 2005) — Школа-Семинар

Европейского Молекулярно-Биологического Сообщества «Клеточные мембраны: организация и динамика» (Бильбао, Испания, 2006) — 16-й Международный.

Микроскопический Конгресс (Саппоро, Япония, 2006).

Список публикаций по теме диссертации.

По теме диссертационного исследования опубликованы 3 статьи и 12 тезисов в сборниках конференций и симпозиумов, 2 статьи приняты в печать.

1. Семакова К. Н., Киселева Е. В. Структурная динамика и взаимосвязь ядерной оболочки и эндоплазматического ретикулума в растущих ооцитах амфибий. Материалы XLI Международной научной студенческой конференции. Новосибирск, 2003. С. 37.

2. Semakova К., Kiseleva Е. A new source of membranes in amphibian oocytes, The Third International scientific conference «Actual problems of contemporary biology and biotechnology» Astana, Kazakhstan. 2003. Abstract book. P. 190−191.

3. Семакова K.H., Киселева Е. В. Миелиноподобные структуры — возможный источник мембран в растущих ооцитах амфибий. Сборник тезисов 7-й Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века». Россия, Пущино. 2003. С. 41−42.

4. Киселева Е. В., Семакова К. Н. Тайны внутриклеточного зодчества. Химия и жизнь. 2003. № 10: 14−15.

5. Семакова К. Н., Киселева Е. В. Динамика эндоплазматического ретикулума и ядерной оболочки в мейозе у амфибий. Международный Симпозиум по проблемам Мейоза. Санкт-Петербург, 2003. Цитология. 2003. 45(9): 923.

6. Семакова К. Н., Киселева Е. В. Миелино-подобные структуры как возможный источник гладкого эндоплазматического ретикулума в ранних ооцитах амфибий. Цитология. 2003. 45(8): 246−257.

7. Morozova К., Kiseleva Е. Cytoplasmic annulate lamellae are specific organelles of actively growing and rapidly dividing cells. Materials of Russian-Chinese Symposium «Life Science». Puschino, Russia, 2004. P. 122.

8. Morozova K., Kiseleva E. New model of nuclear envelope assembly using endoplasmic reticulum vesicles. 8th Asia-Pacific Conference on Electron Microscopy (8APEM) Kanazawa, Japan. 2004. P. lb.

9. Морозова К. Н., Аллен Т. Д., Киселева Е. В. Исследование механизмов формирования внутренней ядерной мембраны в растущих ооцитах амфибий. III съезд ВОГиС Генетика в XXI: современное состояние и перспективы развития. 2004. Т. И С. 263.

Ю.Морозова К. Н., Киселева Е. В. Возможная функция окончатых мембран в опухолевых и активно делящихся клетках. Международная научная конференция «Молекулярная генетика, геномика и биотехнология». Минск, Беларусь, 2004. С. 92−93.

11.Morozova K.N., Kiseleva E.V. Striking myelin-like structures unwrapping in Xenopus oocytes: a source of membranes or the store of their excess? 7th Multinational Congress on Microscopy. Portoroz, Slovenia, 2005. Abstract book. P. 27.

12. Kiseleva, E, Morozova, K., Goldberg, M.W., Rutherford, S., Allen, T.D. New mechanism of nuclear envelope ancl nuclear pore assembly in growing nuclei. Abstract Book of the EMBO/FEBS Conference on Nuclear Structure and Dynamics. La Grande Motte, France, 2005. P-081.

13. Морозова K.H., Губанова H.B., Киселева Е. В. Структурная организация и возможная функциональная роль пористых пластинок, содержащих цитоплазматические поры. Цитология. 2005. 47(8): 667−678.

14. Киселева Е. В., Морозова К. Н., Голдберг М. В., Разерфорд С., Аллен Т. Д. Новый механизм сборки ядерной оболочки и ядерных поровых комплексов в растущих неделящихся ядрах. Материалы XV Всероссийского Совещания «Структура и функции клеточного ядра». Санкт-Петербург. Цитология. 2005. 47(9): 814.

15. Morozova K.N., Kiseleva E.V. Defects in nucleo-cytoplasmic transport ancl nuclear pore complexes assembly caused by immunodepletion of p62 nucleoporin. Matherials th of 16 International Microscopy Congress. Sapporo, Japan, 2006. P. 369.

16. Губанова H.B., Морозова K.H., Киселева Е. В. Структурная организация, функция и динамика ядерных пор. Цитология. 2006. 48(11) (принята в печать).

17. Морозова К. Н., Киселева Е. В. Морфометрический анализ динамики эндоплазматического ретикулума в растущих ооцитах амфибий. Цитология. 2006. 48(12) (принята в печать).

Благодарности.

Автор выражает глубокую благодарность научному руководителю Киселевой Елене Владимировне за чуткое и внимательное руководство работой, за всестороннюю поддержку, идейное вдохновление, неисчерпаемый энтузиазм и проявленное терпение. Особые слова благодарности автор выражает заведующему лабораторией Рубцову Н. Б. за помощь в освоении методик работы на конфокальном микроскопе, а также за ценные советы на разных этапах подготовки диссертационной работы, плодотворное обсуждение результатов и ценную критику. Автор признателен Губановой Н. В. за предоставленные образцы эмбрионов дрозофилы. Отдельно хотелось бы поблагодарить Байбородина С. И. за неоценимую помощь в освоении методов электронно-микроскопического анализа и Мельникова В. А. за техническую поддержку, без которой было бы невозможно получение результатов. Автор выражает искреннюю признательность Алешиной Т. Е. за помощь в освоении флуоресцентной микроскопии. Также хотелось бы выразить слова благодарности всему коллективу Лаборатории морфологии и функции клеточных структур за искреннюю помощь и советы по выполнению работы и за постоянную моральную поддержку.

Список использованных сокращений;

АТФ — аденозинтрифосфорная кислота ГДФ — гуанозиндифосфорная кислота ГТФ — гуанозинтрифосфорная кислота МПС — миелиноподобные структуры ПП — пористые пластинки ППК — пороподобный комплекс ЭПР — эндоплазматический ретикулум ЯдО — ядерная оболочка ЯПК — ядерный поровый комплекс.

Глава 5. ВЫВОДЫ.

1. Увеличение площади поверхности и объема мембран ЭПР в околоядерной области ооцита на 3-й стадии оогенеза может быть обусловлено сборкой новых фрагментов растущей ядерной оболочки.

2. Пористые пластинки, входящие в состав ЭПР и содержащие цитоплазматические поры, могут сливаться с наружной мембраной ядра и служить источником мембран и нуклеопоринов для собирающейся ядерной оболочки и ядерных пор.

3. В цитоплазме ранних ооцитов амфибий впервые выявлены миелиноподобные структуры, которые могут выполнять роль депо мембран для эндоплазматического ретикулума на стадиях интенсивного роста и развития ооцита.

4. Сборка ядерных поровых комплексов происходит через формирование промежуточных структур. Блокирование встраивания нуклеопорина р62 в ядерную пору нарушает начальные этапы ее сборки в растущих ооцитах амфибий.

5. Предложена модель сборки ядерной оболочки в растущих ооцитах амфибий за счет слияния пузырьков ЭПР с наружной ядерной мембраной и перемещения части мембраны пузырька внутрь ядра. Сближение двух фрагментов мембраны пузырька формирует новый участок ядерной оболочки, в котором инициируется сборка новых ядерных пор.

6. Электронно-микроскопический анализ выявил в ядрах ооцитов актин-содержащие филаменты, контактирующие с ядрышками и ядерными поровыми комплексами. Деполимеризация этих филаментов нарушает морфологию ядра. Предполагается, что данные филаменты вовлечены во внутриядерный и ядерно-цитоплазматический транспорт, а также в сборку новых фрагментов ядерной оболочки.

Заключение

.

В настоящей работе проведено сравнительное исследование ультраструктурной организации ооцитов амфибий на разных стадиях их развития. Сочетание морфологического и морфометрического анализа позволило установить, что в процессе оогенеза происходит существенная реорганизация внутриклеточных органелл. Так например, в ходе развития ооцита отмечается перемещение мембран ЭПР с периферии клетки в центр, к ядру. На ПНУ стадиях роста ооцита, сопровождающихся активацией транскрипции, происходит увеличение относительной протяженности и площади мембран ЭПР в средней и околоядерной областях цитоплазмы и уменьшение этих параметров в периферическом отделе клетки. Одновременно наблюдается множественное слияние пузырьков ЭПР с наружной ядерной мембраной, что может свидетельствовать об активном использовании компонентов ЭПР для формирования новых фрагментов растущей ЯдО. В целом, в ходе развития ооцита, увеличивается общий объем и площадь поверхности мембран ЭПР. Предполагается, что выявленная реорганизация ЭПР в растущих ооцитах амфибий обусловлена процессами накопления желткавиттелогенеза, перераспределением ионов Са2+, синтезом и запасанием белков и липидов, необходимых для обеспечения развития будущего эмбриона, а также сборкой новых фрагментов растущей ЯдО.

При ультраструктурном исследовании цитоплазмы ранних ооцитов амфибий (1-П стадии развития) нами впервые были обнаружены миелиноподобные структуры (МПС), способные декомпактизоваться в мембраны гладкого ЭПР. МПС встречались также и в межклеточном пространстве между ооцитом и фолликулярной клеткой, причем при контакте МПС с плазматической мембраной ооцита в прилежащих участках цитоплазмы ооцита появлялись многочисленные мембраны ЭПР. Таким образом, присутствие МПС в ранних ооцитах может быть обусловлено активизацией процесса синтеза и сборки новых мембранных компонентов, в частности, ЭПР и ЯдО в клетке.

На уровне электронной микроскопии мы исследовали организацию пористых пластинок (ПП) в цитоплазме ооцитов амфибий и установили сходство и различие встроенных в них пороподобных комплексов с ядерными порами. Впервые было продемонстрировано прямое слияние ПП с наружной ядерной мембраной, что подтвердило существующее ранее предположение о возможной функции ПП в качестве депо мембран и нуклеопоринов для ЯдО и ЯПК. Предложено несколько моделей использования ПП для формирования новых ЯПК в растущей ЯдО.

Используя различные методы электронной микроскопии, мы воссоздали последовательные этапы формирования новых фрагментов ЯдО и сборки ЯПК. Согласно предложенным моделям этих процессов, рост ЯдО в ядре ооцита происходит при непосредственном участии пузырьков ЭПР, а формирование новых ЯПК инициируется вблизи участков слияния пузырьков ЭПР с наружной ядерной мембраной. Выяснилось, что сборка зрелой ядерной поры осуществляется через промежуточные структуры, в которых сначала собираются центральные компоненты ЯПК, а затем периферические.

Поскольку рост ядра ооцита в какой-то степени аналогичен росту ядра соматической клетки на стадии интерфазы, было высказано предположение о том, что формирование новых фрагментов ЯдО и сборка новых ЯПК в интерфазных ядрах будет протекать по сходному сценарию. Исследования, проведенные на ранних эмбрионах дрозофилы, свидетельствуют в пользу этой гипотезы.

В настоящей работе с использованием конфокальной и электронной микроскопии продемонстрировано наличие актин-содержащих филаментов в ядрах ооцитов амфибий. Показано, что воздействие агента, разрушающего актиновые филаменты, приводит к значительным нарушениям как в цитоплазме, так и в ядре. Выявленный в ходе электронно-микроскопического анализа тесный контакт внутриядерных актин-содержащих филаментов с ядрышковым материалом и с ядерными порами, в совокупности с литературными биохимическими данными, позволяет предполагать существование внутриядерного актинового каркаса, динамически взаимодействующего с компонентами ядра и участвующего во внутриядерном, а также, возможно, в ядерно-цитоплазматическом транспорте молекул. Соединяя внутриядерные структуры напрямую с ядерными порами, актин-содержащие филаменты могут, вероятно, обеспечивать путь для направленного транспорта материала внутри ядра и его быстрого экспорта в цитоплазму. Полученные данные свидетельствуют также о возможном участии актин-содержащих филаментов в формировании ЯдО.

Таким образом, выполненная диссертационная работа может рассматриваться как новый важный шаг в изучении механизмов сборки ядерной оболочки в растущих неделящихся клетках.