Технология капиллярно-химического обезвоживания на глауконите для получения перорально применяемых сухих ветеринарных препаратов и кормовых добавок

Актуальность работы.

Необходимость стабилизации материалов биологического происхождения, связанная с их чрезвычайной нестойкостью является актуальной проблемой биотехнологии.

Высушивание является одним из наиболее совершенных процессов стабилизации свойств продуктов биологического (растительного, животного, микробиологического) происхождения и позволяет сохранять данные продукты в обычных условиях длительное время. Вместе с тем высушивание достаточно трудоемкий технологический процесс, который часто является решающим этапом производства, влияющим на качество выпускаемой продукции. (Самуйленко А.Я., 2005).

Разнообразие свойств продуктов требует индивидуального подхода к разработке рациональных методов их высушивания (с учетом требований к качеству готового изделия).

Сложность технологических процессов высушивания, их высокая энергонасыщенность, незначительная производительность технологического оборудования при его сложности, в том числе в плане обеспечения техники безопасности при работе с микроорганизмами различных групп патогенности, ставит в ряд первоочередных задачу изыскания современных способов обезвоживания для реализации в системе технологических процессов приготовления биопрепаратов. Одновременно с этим преследуется цель улучшения технико-экономических показателей производства и как следствие снижения себестоимости продукции с улучшением их потребительских показателей. (Панин А.Н., 2000).

В настоящее время многие биотехнологические лаборатории исследуют методы обезвоживания, в которых процесс влагоотъёма от обезвоживаемого материала реализуется в закрытой системе контактирующих материалов (то есть без удаления влаги из системы) без фазовых переходов влаги (для основной части поглощаемой жидкости), к числу которых относится капиллярно-химическое обезвоживание (КХО). Другое отличие КХО ' заключается в том, что процесс поглощения влаги является экзотермическим, в то время как остальные процессы являются эндотермическими.

Для реализации процессов в биотехнологии КХО были опробованы в качестве обезвоживающих веществ разнообразные органические и неорганические материалы: соли, образующие кристаллогидраты— алюмокалиевые квасцы, гипс, бура, сернокислый магнийнабухающие в воде органические вещества — желатина, агар, пептон, казеин, лактоза и ряд других. Но их использование на фоне низких концентраций микроорганизмов и высокой инактивации при приготовлении и хранении не позволило позитивно ответить на вопрос применения данного способа в конструировании биопрепаратов.

Другое направление было связано с использованием пористых материалов (угли, цеолиты, ионообменные смолы), используемых не только в качестве поглотителя влаги из полуфабриката биопрепарата, но и в качестве матрицы-носителя иммобилизованных микроорганизмов и молекул биопрепарата.

Все сорбенты имеют два общих основных свойства, которые наиболее1 сильно влияют на различие в показаниях к применению и силе воздействия. Это — сорбционная ёмкость (количество вещества, которое может поглотить сорбент на единицу своей массы) и способность сорбировать разного размера и массы молекулы и бактериальные клетки, что для сорбентов, используемых при конструировании биопрепаратов (в отличие от сорбентов в целом) даже • важнее, чем первое). Вместе с тем очень важно еще чтобы сорбент обладал и своими положительными качествами субстрата биопрепарата.

Наибольший интерес со стороны исследователей и производителей вызывает цеолит-глауконит, обладающий уникальными ионообменными и адсорбционными свойствами.

Ажурность кристаллической структуры глауконита создает большой адсорбционный объем, а его геометрия определяет молекулярно-ситовые свойства. Отличительной особенностью глауконита от остальных цеолитов является то, что он обладает не каркасным, а слоистым строением, благодаря чему площадь активной поверхности значительно увеличивается. При этом часть внутримолекулярных сил не уравновешена взаимодействием с расположенными в полости одного такого слоя ионами химических веществ, содержащихся в растворах и в воздухе. В результате они скапливаются на активных поверхностях пластиночек, составляющих общий кристаллравнодействующая этих сил направлена вглубь кристалла и на поверхности возникает силовое поле. Молекулы других веществ, оказываясь в этом силовом поле, удерживаются в нем дисперсионными, ориентационными и индукционными силами. Кроме того между молекулами сорбата и сорбента образуются прочные ковалентные или ионные связи, что приводит к явлениям адсорбции и диффузии.

Глауконит участвует в каталитических процессах, регулирует содержание свободной жидкости в кишечнике, состав и концентрацию электролитов, минеральный обмен и кислотно-щелочное равновесие, иммобилизирует ферменты желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), повышая их активность за счет выброса свободных радикалов кислорода, оказывает в кишечнике бактерицидный эффект и способствует образованию кремниевой кислоты, которая обеспечивает высокое буферное действие в отношении органических кислот (Овчинников А.А., 2001). Благодаря строго калиброванному размеру пор (около 4 ангстрем), он способен проявлять сорбционные свойства только по отношению к ионам макрои микроэлементов и органическим соединениям с небольшими размерами молекул (метан, сероводород, аммиак и др.), не вступая в прямое взаимодействие со сложными органическими соединениями (витаминами, белками и др.).

Получаемые на основе глауконита препараты могут использоваться для иммобилизации нутриетов (ферментов, витаминов, белковых компонентов) и постепенного (пролонгированного) высвобождения их в ЖКТ, связывания кишечных газов, токсинов, солей тяжелых металлов и профилактики воспалительных и аллергических реакций. (Паничев A.M., 2003).

Таким образом, конструирование биологических препаратов на основе ионообменных матриц с набором собственных положительных биологических свойств, позволяет значительно сократить негативные воздействия на активные ингредиенты и затраты на производство, что является актуальной задачей биотехнологии и фармакологии.

Цель и задачи исследований.

Целью нашей работы являлась разработка технологии капиллярно-химического обезвоживания на глауконите для получения перорально применяемых ветеринарных препаратов и кормовых добавок.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Исследовать закономерности капиллярно-химического обезвоживания жидких полуфабрикатов обезвоживающими веществами и требования к установлению сорбционного равновесия.

2. Обосновать выбор глауконита как основы капиллярно-химического обезвоживания и изучить его биологические и влагопоглотительные характеристики для конструирования ветеринарных препаратов.

3. Разработать технологию капиллярно-химического обезвоживания и предложения по аппаратурно-технологическому оформлению процесса получения сухих ветеринарных препаратов и кормовых добавок на глауконите.

4. Приготовить пять производственных серий БКД «Баксин-вет» по разработанной технологии методом капиллярно-химического обезвоживания и оценить потребительские свойства.

5. Рассчитать экономическую эффективность метода капиллярно-химического обезвоживания.

6. Разработать нормативно техническую документацию и методики контроля технологии приготовления методом капиллярно-химического обезвоживания перорально применяемых сухих ветеринарных препаратов и кормовых добавок.

Научная новизна.

Впервые исследован механизм капиллярно-химического обезвоживания жидких препаратов пористыми сорбентами с использованием модельных представлений о межфазном массообмене в системе насыщенных и ненасыщенных влагой пористых частиц.

Изучены свойства различных пористых материалов и обоснованы требования к потенциальным обезвоживающим материалам при реализации капиллярно-химического высушивания. Отсутствие у глауконита токсических, канцерогенных, мутагенных свойств и наличие богатого макро-и микроэлементный состава, высокой сорбционной емкости и способности сорбировать молекулы различного размера и иммобилизировать бактериальные клетки позволило использовать его в качестве основы для капиллярно-химического обезвоживания и получения ветеринарных препаратов и кормовых добавок со стабильными биологическими свойствами и остаточной влажностью не выше 12%.

Впервые на основе природного глауконита реализован метод капиллярно-химического обезвоживания для приготовления перорально применяемых сухих ветеринарных препаратов и кормовых добавок, позволивший исключить высокозатратный способ лиофильного обезвоживания, обогатить готовую форму препаратов ионообменными свойствами и обеспечить длительное хранение.

Аппаратурно-технологическое оформление производства сухих ветеринарных препаратов и кормовых добавок по технологии капиллярно-химического обезвоживания на глауконите позволяет реализовать процесс на специализированных предприятиях, в лабораториях и животноводческих фермах.

Научная новизна работы подтверждена Сертификатом регистрации • объекта интеллектуальной собственности SRI № RU02R1RU20100003 «Технология получения биопрепаратов и кормовых добавок способом капиллярно-химического обезвоживания на глауконите».

Практическая и теоретическая значимость работы.

Определены основные технологические и биологические свойства природного глауконита Каринского месторождения, позволяющие применять его для капиллярно-химического обезвоживания пероральных препаратов и кормовых добавок.

Аппаратурно-технологическое оформление производства ветеринарных препаратов и кормовых добавок по технологии капиллярно-химического обезвоживания на глауконите позволило реализовать процесс на специализированных предприятиях, а также непосредственно в лабораториях и животноводческих фермах.

Разработан комплект нормативно-технической документации: ТУ 9 291 001−95 532 231−2010 и регламент производства на БКД «Баксин-вет», ТУ 9 365 002−71 368 318−2008 и регламент производства на ветеринарный препарат «Зоо Актимакс».

Разработаны и утверждены РАСХН «Методические рекомендации получения готовой формы биопрепаратов и кормовых добавок способом капиллярно-химического обезвоживания на глауконите», «Сборник методик определения параметров ингридиентов и готовой формы биопрепаратов и кормовых добавок, полученных методом капиллярно-химического обезвоживания».

Годовой экономический эффект от внедрения метода капиллярно-химического обезвоживания в технологическую схему получения биопрепарата «Биоспорин» по сравнению с ранее применяемым методом лиофильного высушивания составил 91,7%.

По разработанной технологии капиллярно-химического обезвоживания на глауконите произведены ветеринарные препараты «ЗооАктимакс» ООО «Лаборатория технологии оздоровительных препаратов», г. Санкт-Петербург и БКД «Баксин-вет» ООО «Никофарм», г. Москва.

Результаты исследований по разработке технологии капиллярно-химического обезвоживания на глауконите для получения пероральных, препаратов и кормовых добавок, используются в учебном процессе по дисциплине «Биотехнология» в ФГОУ ВПО МГАВМиБ имени К. И. Скрябина.

Личный вклад соискателя. Автору принадлежат организация и непосредственное осуществление исследований по выбору и обоснованию глауконита как основы для конструирования биопрепаратов методом КХО, разработке метода КХО на глауконите, по разработке методик оценки качества получаемых биопрепаратов и кормовых добавок, по анализу и теоретическому обобщению полученных данных и разработке научно-технической документации на метод КХО и препарат БКД «Баксин-вет».

Результаты экспериментальных исследований, полученные совместно с другими исполнителями, приводятся с согласия соавторов.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на XXVI Московском международном ветеринарном конгрессе по лечению мелких домашних животных (Москва — 2008 г.), XII ' Международной научно-практической конференции молодых учёных и специалистов «Вклад молодых учёных в реализацию приоритетного национального проекта «Развитие агропромышленного комплекса» (Троицк — 2008 г.), Международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Вопросы ветеринарной медицины и биотехнологии» (Москва — 2009 г.), IX Международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности» (Санкт-Петербург — 2010).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 7 научных работ: в журнале, включенном в перечень ВАК РФ — 6, в сборнике материалов конференции — 1.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 225 страницах машинописного текста, в т. ч. 23 страниц приложений и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованой литературы (211 источников, из которых 180 отечественных и 31 иностранных). Материалы диссертации иллюстрированы 33 рисунками, 58 таблицами.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Использование глауконита как основного компонента при производстве перорально применяемых сухих ветеринарных препаратов и кормовых добавок методом капиллярно-химического обезвоживания.

2. Технология получения и компонентный состав перорально применяемых ветеринарных препаратов и кормовых добавок методом капиллярно-химического обезвоживания на глауконите.

3. Аппаратурно-технологическая линия получения сухих ветеринарных препаратов и кормовых добавок методом капиллярно-химического обезвоживания на глауконите.

4. Эффективность применения ветеринарного препарата БКД «Баксинвет».

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Характеристика основных методов высушивания термолабильных биологических препаратов.

Необходимость стабилизации материалов биологического происхождения, связанная с их чрезвычайной нестойкостью является актуальной проблемой биотехнологии. /11/ Известно, что в обычных условиях продолжительность сохранения большинства биологических продуктов исчисляется несколькими днями. В связи с этим разрабатывались различные способы консервирования биологических препаратов, которые в настоящее время можно разделить на консервирование при положительных температурах с помощью химических соединений (хлороформ, фенол, глицерин, формалин и т. д.), консервирование при низких температурах (замораживание) и консервирование высушиванием. /116/.

Высушивание является одним из наиболее совершенных процессов стабилизации свойств продуктов биологического (растительного, животного, микробиологического) происхождения и позволяет сохранять данные продукты в обычных условиях длительное время. /23/.

Высушивание достаточно трудоемкий технологический процесс, который часто является решающим этапом производства, влияющим на качество выпускаемой продукции. Процесс высушивания — это • разнообразный комплекс тепловых, диффузионных, биологических и химических явлений. Препараты биологического происхождения обычно представляют собой сложные объекты сушки, характеризующиеся рядом показателей, важнейшими из которых являются начальная, конечная и равновесная влажность, термические, электрофизические, структурно-механические и массообменные характеристики. /147/ Разнообразие свойств продуктов требует индивидуального подхода к разработке рациональных методов их высушивания (с учетом требований к качеству готового изделия).

Исходя из свойств материалов биологического происхождения необходимо выбирать оптимальные режимы высушивания с учетом допустимой температуры нагрева материала, т. е. температуры, при которой. обезвоженный продукт получается стандартного качества и обладает наилучшими технологическими свойствами. Различная природа объектов сушки обусловила выбор диапазонов температур и экспозиций нагрева с учетом максимального сохранения числа жизнеспособных микроорганизмов и биологической активности продуктов. /83/.

Исследования устойчивости микроорганизмов в технологических процессах показали, что уменьшение скорости высушивания, как правило, 4 способствует сохранению биологических свойств. /60, 185/ При длительном высушивании наибольшее отмирание микроорганизмов происходит в некоторой критической зоне влажности материала (близкой к гигроскопической), когда микроорганизмы находятся продолжительное время в концентрированном растворе реагентов при повышенных температурах.

5. ВЫВОДЫ.

1. В результате математического моделирования закономерностей капиллярно-химического обезвоживания — начального и равновесного влагосодержания, физико-химических показателей жидкой фазы, сорбционных характеристик, являющихся исходными параметрами при определении оптимального состава биологического препарата — обоснованы требования к наполнителю-обезвоживателю для установления сорбционного равновесия в сухих биопрепаратах: высокие сорбционные свойства (по воде), сферически-пористая или слоисто-пористая форма частиц с минимальным размером пор (значительно меньших размера молекул воды), дисперсный состав (определяемый конечной формой биопрепарата), прочность частиц наполнителя к воздействию химических и физико-механических нагрузок, рациональная укладка частиц наполнителя с обеспечением наибольшего объема межшарового пространства для размещения высокодисперсного биопрепарата, ионообменные свойства со значительным (представительным) содержанием микро и макроэлементов.

2. Отсутствие токсических (по ГОСТ 12.1.007−76 глауконит Каринского месторождения относится к 4 классу — вещества малоопасные), канцерогенных (по содержанию бенз (а)пирена и НДМА — единственного из обнаруженных N-нитрозаминов — глауконит Каринского месторождения соответствует пункту 1.10.6. САНПиН 2.3.2.1078−01), мутагенных (по результатам теста Эймса показано отсутствие содержания в глауконите Каринского месторождения мутагенов прямого или непрямого действия) свойств, макрои микроэлементный состав (около 70 элементов) глауконита Каринского месторождения, наряду с высокой сорбционной емкостью (не менее 20%), способностью сорбировать молекулы различного размера и бактериальные клетки обеспечивает капиллярно-химическое обезвоживание с сохранением основных биологических свойств высушенных препаратов с остаточной влажностью не выше 12%, что способствует длительному хранению.

3. Разработана технология капиллярно-химического обезвоживания получения сухих ветеринарных биопрепаратов и кормовых добавок на глауконите и типовая схема аппаратурно-технологической линии производства на основе отечественного оборудования.

4. Приготовленные лабораторные образцы препарата и производственные серии БКД «Баксин-вет» по разработанной технологии методом капиллярно-химического обезвоживания соответствуют требованиям нормативной документации и обладают высокими потребительскими свойствами — низкая гигроскопичность (10,4%) и сыпучесть (15%), длительный срок годности (не менее 2 лет).

5. Экономическая эффективность от применения в технологической схеме получения препаратов метода капиллярно-химического обезвоживания в сравнении с лиофилизацией составила 91,7% на 1 кг продукции.

6. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ.

РЕЗУЛЬТАТОВ.

1. Определены основные технологические и потребительские свойства природного глауконита Каринского месторождения, определяющие возможность его применения для капиллярно-химического обезвоживания ветеринарных препаратов и кормовых добавок.

2. Созданная технология и разработанная типовая аппаратурно-технологическая линия позволяют получить сухие ветеринарные биопрепараты и кормовые добавки методом капиллярно-химического обезвоживания на глауконите не только в крупных специализированных предприятиях, но и в лабораториях или животноводческих фермах.

3. Разработаны и утверждены РАСХН «Методические рекомендации получения готовой формы биопрепаратов и кормовых добавок способом капиллярно-химического обезвоживания на глауконите», «Сборник методик определения параметров ингридиентов и готовой формы биопрепаратов и кормовых добавок, полученных методом капиллярно-химического обезвоживания».

4. На разработанную технологию составлена нормативно-техническая документация — технические условия ТУ 9291−001−95 532 231−2010 и регламент производства на БКД «Баксин-вет» и регламент производства ветеринарного препарата «ЗооАктимакс».

5. Получено свидетельство регистрации объекта интеллектуальной собственности «Технология получения биопрепаратов и кормовых добавок способом капиллярно-химического обезвоживания на глауконите».

6. По разработанной технологии капиллярно-химического обезвоживания на глауконите производятся ветеринарные препараты БКД «Баксин-вет» ООО «Никофарм», г. Москва и «ЗооАктимакс» ООО «Лаборатория технологии оздоровительных препаратов», г. Санкт-, Петербург.

7. Результаты исследований по разработке технологии капиллярно-химического обезвоживания на глауконите для получения биопрепаратов и кормовых добавок, используются в учебном процессе по дисциплине, «Биотехнология» в ФГОУ ВПО МГАВМиБ имени К. И. Скрябина.

7. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ.

1. Основные технологические и потребительские свойства природного глауконита Каринского месторождения, позволяют рекомендовать его в качестве носителя-субстрата для различных молекул и иммобилизованных микроорганизмов при получении ветеринарных препаратов (например, витаминов, ферментов или пробиотиков) пролонгированного действия.

2. Глауконит Каринского месторождения рекомендуется для применения в животноводстве и птицеводстве в качестве минеральной добавки к рациону и сорбента для санации кормов от микотоксинов.

3. Разработанная технология капиллярно-химического обезвоживания получения сухих ветеринарных препаратов и кормовых добавок на глауконите и типовая схема аппаратурно-технологической линии производства на основе отечественного оборудования рекомендуются для биотехнологических производств и животноводческих ферм.

4. БКД «Баксин-вет» рекомендуется зооветспециалистам и владельцам животных в качестве лечебно-профилактического средства с антиоксидантным, иммуномодулирующим, противовоспалительным и адаптогенным действием. Препарат «ЗооАктимакс» рекомендуется зооветспециалистам и владельцам животных в качестве лечебно-профилактического средства при желудочно-кишечных заболеваниях.

1.5.

Заключение

.

Перспективным направлением биотехнологии является определение параметров протекания процессов капиллярно-химического обезвоживания и применение природных минералов алюмосиликатов для реализации процессов сорбции при конструировании кормовых добавок и биопрепаратов перорального применения, обладающих пролонгированным действиемиммобилизированных микроорганизмов, молекул белковых веществ (витаминов, ферментов и др.).

В настоящее время запасы и ресурсы глауконитсодержащих пород выявлены и с определенной достоверностью оценены только в пределах европейской части страны (Северо-Западный, Центральный, Приволжский и Южный федеральные округа), а также на западе Уральского ФО. Глауконит Каринского месторождения Кунашакского района Челябинской области сертифицирован для использования в качестве кормовой добавки (до 30% рациона) для животных, поэтому исследование его сорбционных характеристик и разработка технологии капиллярно-химического обезвоживания на глауконите для получения биопрепаратов является актуальной задачей фармакологии и биотехнологии.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы и методы.

Работа выполнена в период с 2005 по 2010 годы на кафедре биотехнологии ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина».

Исследования структуры и сорбционных характеристик глауконита проводились в Уральской государственной академии ветеринарной медицины (г. Троицк), на базе ООО «Люцевита» и ООО «УралВетАгро» (г. Троицк). Исследование иммобилизации микроорганизмов на глауконите проводилось в филиале ФГУ «48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства Обороны Российской Федерации — Центр военно-технических проблем биологической защиты» (г. Екатеринбург) и в Лаборатории анатомии микроорганизмов ФГБУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н. Ф. Гамалеи (г. Москва). Исследование потенциальной канцерогенности глауконита проводилось в Лаборатории методов скрининга канцерогенов НИИ Канцерогенеза Онкологического научного центра им. Н. Н. Блохина РАМН. Испытания фазового, химического и примесного состава осуществлялись в Аналитическом сертификационном испытательном центре Всероссийского научно-исследовательского института минерального сырья имени Н. М. Федоровского (г. Москва). Оценка эффективности использования глауконита для снижения токсичности кормов проводилась на базе ООО «Биостарт» (г. Киров). Разработка. технологии производства биопрепаратов способом капиллярно-химического обезвоживания на глауконите проводилась в ООО «Лаборатория технологии оздоровительных препаратов» (г. Санкт-Петербург). Разработка рецептуры БКД «Баксин-вет» и оценка ее свойств проводились на базе ООО «Никофарм» (г. Москва).

Штаммы микроорганизмов.

В экспериментах по изучению мутагенной активности глауконита Каринского месторождения использовали штаммы Salmonella typhimurium ТА98 и Salmonella typhimurium ТА 100, полученные из коллекции и репродуцируемые в НИИ Канцерогенеза Онкологического научного центра им. Н. Н. Блохина РАМН.

В экспериментах по изучению иммобилизации бактерий на глауконите и токсичности глауконита Каринского месторождения по отношению к микроорганизмам использовали штамм Bacillus subtillis 3 и Escherichia coli Ml7, полученные в ООО «Лаборатория технологии оздоровительных препаратов» (г. Санкт-Петербург).

В экспериментах по изучению адсорбционной способности клеток микроорганизмов на разные минеральные сорбенты использовали штаммы Micrococcus varians PR69 и Micrococcus roseus УД6−4, Bacillus firmus S20 и Bacillus subtillis PR28, Rhodococcus erythropolis Кл1 и Rhodococcus ruber Кл4, полученные в филиале ФГУ «48 ЦНИИ МО РФ — ЦВТП БЗ» (г. Екатеринбург).

При оценке эффективности использования глауконита Каринского месторождения для снижения токсичности кормов использовали фунгальную биомассу, содержащую токсигенные штаммы грибов-продуцентов Fusarium. graminearum, F. sporotrichiella, F. poae и F. moniliforme с токсическими продуктами их жизнедеятельности, полученную в ООО «Биостарт» (г. Киров).

Для исследования процессов КХО на глауконите, а также разработки рецептуры получаемых методом КХО ветеринарных препаратов и кормовых добавок, использовали высушенную бактериальную массу выращенных в водно-минеральной питательной среде, инактивированных клеток.

Halobacterium halobium 353П — биопрепарат «Баксин-вет», полученный в ООО «Никофарм» (г.Москва).

Экспериментальные животные.

В экспериментах по изучению и оценке токсических свойств и безвредности глауконита Каринского месторождения и БКД «Баксин-вет» ' были использованы 80 белых беспородных мышей, 120 крыс линии ВИСТАР и 90 беспородных кроликов.

В экспериментах по изучению и оценке влияния иммобилизованных на глауконите Каринского месторождения культур микроорганизмов на микробиоценоз кишечника животных были использованы 118 белых беспородных мышей.

При исследовании эффективности использования глауконита Каринского месторождения для снижения токсичности кормов были использованы 180 цыплят-бройлеров кросса «Кобб-500».

Материалы исследований.

В процессе работы было отобрано и исследовано:

• в экспериментах по изучению и оценке токсических свойств глауконита Каринского месторождения и БКД «Баксин-вет» — 90 проб крови кроликов, 200 проб внутренних органов (легкие, кишечник, печень, половые железы) — 120 крыс и 80 мышей — и 20 эмбрионов крыс;

• в экспериментах по изучению и оценке влияния иммобилизованных на глауконите Каринского месторождения культур микроорганизмов на микробиоценоз кишечника животных — 118 проб содержимого кишечника белых беспородных мышей;

• при исследовании эффективности использования глауконита • Каринского месторождения для снижения токсичности кормов — 36 проб содержимого кишечника, 72 пробы крови и 72 пробы дуоденального химуса цыплят-бройлеров.

Глауконит поступал из Каринского месторождения Челябинской области. Цеолиты Хотынецкого, Холинского и Шевартуинского месторождений и катионит КБ-4П-2 были получены для исследования в ООО «Люцевита», г. Троицк, Челябинской области.

В экспериментах по изучению мутагенной активности глауконита Каринского месторождения использовали стандартные мутагены — ацетиламинофлуорен (ААФ), бенз (а)пирен, нитрозогуанидин, 2,7-диамино- • 4,9-диокси-5,10-диоксо-4,5,9,10-тетрагидро-4,9-диазопирен (ДДДТДТТ) — и микросомальную активирующую смесь S9.

Для изучения эффективности использования природного глауконита Каринского месторождения для профилактики токсического действия компонентов кормосмеси при повышенном содержании в ней микотоксинов на организм цыплят-бройлеров использовали 4-дезоксиниваленол, Т-2-микотоксин и фумонизин В].

Для исследования структурно-текстурных характеристик глауконита Каринского месторождения использовали азот, метанол и смесь газов С1-С4. Кислотную активацию проводили соляной и серной кислотами.

Для исследования сорбции глауконитом молекул белковых веществ в качестве модельного белка использовали альбумин бычьей сыворотки. Для исследования взаимодействия глауконита Каринского месторождения с аминокислотами использовали растворы лизина и метионина. Исследования адсорбционной активности глауконита по отношению к различным физиологическим веществам проводили в бии поликомпонентных средах (в плазме крови, в панкреатическом соке).

Для исследования сорбции глауконитом биогенных катионов готовили растворы, используя соли NaCl, КС1, MgCl2, СаС12, NH4C1 марки ч.д.а.

Для выделения, идентификации и накопления чистых культур микроорганизмов использовали питательные среды: МПА, МПБ, МРС-2, среды Гаузе № 2, Эндо, Плоскирева, Блаурокка, Сабуро, Чапека, Клиглера, ,.

Олькельницкого, солевой агар, лактобакагар, висмут-сульфит агар, желточно-солевой агар, кровяной агар, гидролизат-молочную среду.

Технологическое оборудование.

Для исследования фазового, химического и примесного состава глауконита Каринского месторождения использовали фотометр КФК-2 («ЗОМЗ», Россия), фотометр плазменной ПФМ («ЗОМЗ», Россия), дифрактометр АДП-1 («Буревестник», Россия), спектрометр масс-спектральный с индуктивно-связанной плазмой Elan-6100 («Perkin Elmer», США).

Хроматографические исследования проводились на хроматографе Кристалл-200М.

Текстурные характеристики глауконита исследовались на приборе ASAP-2200 фирмы «Micromeritics» и гелиевом пикнометре АссиРус 1340 фирмы «SY-LAB Gerate». Исследования капиллярно-пористой структуры проводили на ртутной порометрической установке П-ЗМ. Для определения истинной плотности глауконита использовали гелиевый пикнометр Ultrafoam 1200 (Quantachrome).

Адсорбция паров воды и метанола изучалась на высоковакуумной, микровесовой установке Мак-Бена.

Угол естественного относа измерялся на приборе УТВ-ЗМ. Для определения сорбционной влажности (гигроскопичности) использовали анализатор влажности (влагомер) HG63 (Mettler Toledo).

Гематологические исследования проводили с использованием капилляра Панченкова, камеры Горяева, гемометра Сали и биохимические анализаторы Синхрон 4 и Hitachi.

Для проведения гистологических исследований использовали гистологический процессор ТВ S-120, заливочный модуль «Микром», микротом «Olympus» и покрасчике Shandon.

Динамику изменения плотности клеток в культуральной жидкости при адсорбции микроорганизмов на природные минеральные сорбенты контролировали на концентрационном фотоэлектрическом колориметре КФК-2МП и КФК-56 («ЗОМЗ», Россия). Размеры клеток определяли с помощью окулярного микрометра MOB-1−15, используя микроскоп PZO SK19 Биолам Р-16 (коэффициент пересчета -0,067).

Для электронной микроскопии объектов использовали растровый ионно-электронный микроскоп Quanta 200 3D (FEI Company, USA) с напылительной установкой SPI-MODULE Sputter Coater (SPI Supplies, USA).

Методы исследования.

Для математического планирования описания процесса КХО на примере культуральной биологической жидкости, расчета закономерностей установления равновесия в системе «обезвоживаемый материал-обезвоживатель), учета результатов исследования сорбционных характеристик глауконита и разработке параметров контроля качества получаемой готовой формы использовались уравнения ТОЗМ, Дубинина, Радушкевича, Генри, Пуайзеля, Вашбурна, Фрейндлиха и Ленгмюра и их производные. /3, 10, 28, 32, 33, 79. 80, 90, 111, 113, 159, 183/.

Определение фазового состава проводилось методом внутреннего стандарта в соответствии с Методическими указаниями «Рентгенографический количественный фазовый анализ с использованием метода внутреннего стандарта». /143/ Для определения химического состава глауконита использовали масс-спектральный анализ с индуктивно-связанной, плазмой.

Содержание токсичных элементов в глауконите Каринского месторождения проводили в соответствии с ГОСТ 30 178–96, ГОСТ 51 766–01, ГОСТ 26 927–86.

Количество радионуклидов определяли по МУК 2.6.1.1 194−03.

Определение содержания бенз (а)пирена осуществляли методом хроматографии в тонком слое алюминия: Содержание летучих N-нитрозаминов определяли с использованием термоэнергетического анализатора и эталоннов исследуемых соединений.

Изучение способности глауконита Каринского месторождения индуцировать генные мутации на индикаторных микроорганизмах • проводилось в тесте Эймса (Salmonella/микросомы) в соответствии с Международным стандартом ISO 10 993−3:1992, «Руководством по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных химических веществ» (ВОЗ, Женева, 1989г) и «Методическими рекомендациями по оценке мутагенности новых лекарственных средств», утвержденных Фармакологическим комитетом Минздраза СССР 15.01.1988 г. /18, 193/.

Оценку суммарного содержания канцерогенов в глауконите Каринского месторождения проводили в соответствии с СанПин 2.3.2.1078−01 инд. 1.10.6.

Исследования капиллярно-пористой структуры и показатели адсорбционной способности глауконита Каринского месторождения проводили по стандартным адсорбционным и ртутно-порометрическим методикам, описанным Дубининым М. М. и др. авторами. /38, 69, 89, 133, 151, 172, 174/.

Определение суммарного объема пор осуществляли по ускоренному методу влагоемкости образцов, в соответствии с ГОСТ 26 898–86.

Для характеристики текстурных параметров (удельная поверхность, объемы и диаметры пор, распределение пор по размерам) глауконита использовался метод БЭТ, основанный на низкотемпературной адсорбции азота, и гелиевой пикнометрии в соответствии с MP. 1.2.2566−09.

Плотность глауконита определяли методом пикнометрии.

Для проведения исследований с модифицированным глауконитом Каринского месторождения проводилась кислотная активация — в режиме кипения, с варьированием соотношения природный сорбент: раствор кислоты от 1:1 до 1:10. Для выбора наиболее оптимального реагента были апробированы соляная и серная кислоты. Время обработки задавалось от 1 до 5 часов. Кипение обеспечивало хорошее перемешивание всех компонентов смеси. Сразу же после обработки кислотой сорбент промывался водой до нейтральной реакции промывных вод. Далее сорбент сушился сначала на водяной бане до воздушно-сухого состояния, а затем в сушильном шкафу при температуре в течение 2-х часов.

К настоящему времени в литературе /79, 87, 100/ описаны решения задач динамики сорбции, охватывающие как однокомпонентные, так и многокомпонентные системы, полученные как на базе дифференциальных уравнении, так и на основе послойной модели для различных видов изотермы, кинетических механизмов, начальных и граничных условий. Поэтому при моделировании ионообменных процессов на глауконите исходили из существующих в теории динамики сорбции (ионного обмена) представлений и решений.

В основу выбора модели сорбции на глауконите ионов металлов были положены принципы, изложенные Дерягиным Б. В. и другими авторами. /63, 64/.

Для изучения ионообменного равновесия глауконита с растворами, содержащими систему ионов, его навеска в 1 г помещалась в колонку, имеющую пористую перегородку и кран, и через слой глауконита фильтровался соответствующий солевой раствор до равенства концентраций ' на входе и выходе из колонки. Насыщенные таким образом навески глауконита промывали небольшим объемом спирта, а затем элюировали сорбированные ионы 0,5н раствором НС1 в мерные колбы емкостью 1л, в полученном элюате определяли содержание сорбированных ионов. Для приготовления растворов использовали соли NaCl, КС1, MgCl2″ СаС12, NH4CI марки чда.

Для составления матриц математического планирования экспериметров по изучению адсорбционной и десорбционной способности глауконита и по ионам марганца, калия, фосфора и азота был использован метод крутого восхождения. /28/.

Исследования взаимодействия глауконита с растворами аминокислот • проводили с помощью нингидриновой реакции и спектрофотометрического анализа. Глауконит Каринского месторождения, измельченный до 1−100 мкм, последовательно обрабатывался раствором аминокислот, насыщенным раствором хлорида кадмия и 10 мл 1%-ного раствора нингидрина в ацетате для образования комплекса, окрашенного в красный цвет. Затем образец выдерживался несколько минут в нагретой до 70 °C водяной бане и высушивался при комнатной температуре, после чего снимали спектры поглощения адсорбированного красителя.

Исследования сорбционных свойств глауконита по отношению к макромолекулам белковых веществ проводились в динамическом режиме на глауканитовых колонках. В качестве белкового компонента был выбран альбумин бычьей сыворотки (с молекулярной массой 68000D) и исследована адсорбция его из 10%-го водно-спиртового раствора, при концентрации альбумина 100 мг/л, природным глауконитом. Основные параметры проведения адсорбции: скорость пропускания раствора 3 мл/мин., глауконит трех фракций 50−100, 100−200 и 200−500 мкм размеров частиц. Для установления механизма адсорбции сывороточного альбумина, использовали предварительно активированные сорбенты — природный глауконит и глауконит, обработанный 0,5н НС1. Предварительную активацию проводили пропусканием через сорбент сухого воздуха при 350 °C в течении 3 часов. Для определения механизма сорбции и продолжительности работы сорбента при непрерывной подаче белкового компонента, через каждые 50 мл подачи. вещества определяли остаточное количество альбумина в растворе, до установления равновесия системы.

Исследования адсорбционной активности глауконита по отношению к различным физиологическим веществам проводили в бии. поликомпонентных средах (в плазме крови, в панкреатическом соке) при соотношении раствора и глауконита 10:0,3. Смесь помещали в термостат с температурой воздуха 30 °C, где осуществляли инкубацию проб при постоянном перемешивании. Через каждые 20 мин с момента добавления сорбента до 120 мин инкубации отбирали пробы среды и определяли содержание исследуемых ингредиентов в супернатанте после 30-минутного центрифугирования.

Величину адсорбции белковых веществ определяли по измерению концентрации их в растворе методом Лоури.

Сорбционную способность клеток микроорганизмов на природные минеральные носители определяли методом Г. Н. Никовской и др. /117/. Концентрацию клеток в растворе определяли путем детекции оптической плотности суспензии на фотоколориметре в стандартных кюветах, при длине волны 670 нм. Определение числа иммобилизованных клеток проводилось по оптической плотности раствора.

Исследование влияния природных цеолитов на морфолого-культуральные и физиолого-биохимические свойства B. subtillis 3 и Escherichia coli Ml7 проводили по стандартным методикам (Нетрусов А.И. и др., 2005; Нецепляев С. В. и др., 1990; Панкратов А. Я. и др., 1975).

Динамику изменения плотности клеток в культуральной жидкости контролировали по величине оптической плотности при 590 нм на концентрационном фотоэлектрическом колориметре. Размеры клеток определяли путем микроскопирования. Подвижность клеток определяли окрашиванием жгутиков по Леффлеру.

Исследование строения природных минеральных сорбентов и иммобилизованных клеточных препаратов после фиксации в парах 10% раствора нейтрального формалина и напыления образцов золотом (толщина слоя 2нм) проводилось методом сканирующей электронной микроскопии в режимах низкого вакуума (напряжение — 1 OkV, давление в камере — 80 Ра) и высокого вакуума (напряжение — 5kV, давление в камере от 2,37Е-3 Ра до 6Д0Е-3 Ра). /102/.

Исследования влияния глауконита на физиологические показатели организма животных проводили по стандартным методикам, описанным • Покровским А. А. и др. в /136, 162/.

Исследование токсических свойств глауконита и БКД «Баксин-вет» проводили по методу Спирмена-Кербера на беспородных белых мышах с массой 20−24 г, на крысах линии ВИСТАР с исходной массой 145−150 г, беспородных кроликах массой 300 г. по ГОСТ 12.1.007−76 и в соотвествии с методиками, описанными Саноцким И. В. и др. /148/.

Макроскопическое исследование внутренних органов мышей и крыс и микроскопическое — печени, селезенки, кишечника, половых желез, эмбрионов — определяли по методам, описанным Раскиным Г. И. и Левинсоном Л. Б. /141/. Для проведения гистологических исследований отобранный материал фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина. После фиксации образцы промывали водой, обезвоживали в спиртах возрастающей крепости в гистологическом процессоре TBS-120 и заливали в парафин в заливочном модуле «Микром». Серийные срезы ткани делали на микротоме «Olympus», окрашивали гематоксилином и эозином Эрлиха в покрасчике Shandon.

Исследование крови животных проводили общепринятыми в гематологии методами: СОЭ — по Панченкому, подсчет форменных элементов осуществляли с помощью камеры Горяева, уровень гемоглобина определяли в гемометре Сали. Содержание белка в сыворотке крови определяли стандартным методом по биуретовой реакции с регистрацией окрашивания при 540 нм с помощью набора реактивов АОЗТ «Диаком-Синтэко». Содержание глюкозы в сыворотке крови определяли глюкозооксидантным методом при помощи набора реактивов «Новоглюк» (МНПО «Биостар»). рН определяли потенциометрицеским методом.

Биохимические исследования проводили на биохимических анализаторах с использованием реактивов фирм Beckmann и Humatron.

Исследования влияния культур микроорганизмов, иммобилизованных на глауконите Каринского месторождения на микробиоценоз кишечника животных проводили на беспородных белых мышах массой 20−24 г. из которых по принципу аналогов было сформировано 3 группы (1 контрольная и 2 опытные) по 36 голов в каждой. Животным опытных групп ежедневно в течение 15 дней в скармливаемый общевиварный рацион вводили — 0,5 г глауконита Каринского месторождения (опытной группе I) и 0,5 г глауконита Каринского месторождения с иммобилизованной на нем культурой В.

•у subtillis 3 с концентрацией 10 (опытной группе II). Животным контрольной группы скармливали общевиварный рацион без добавок. До начала исследования, а также на 3 и 9 дни проведения опыта и через 5 дней после его окончания проводили бактериологические исследования содержимого кишечника экспериментальных животных, в сравнении с контрольными ' животными. Для выполнения запланированного объема ' анализов мышей декапитировали по 6 голов из каждой группы. Образцы кишечного содержимого брали во время убоя.

Бактериологические исследования осуществляли по методикам, описанным Блохиной И. Н. и др. /24/ и Ворониным Е. С. и др. /39/.

Для приготовления серии последовательных разведений исследуемого материала производили взвешивания 1 г исследуемого материала кишечного содержимого и его разведение в 10 мл физиологического раствора.

Подготовленные исходные материалы кишечного содержимого последовательно разводили в десятикратном объеме физиологического раствора до 7 разведения. Отбор проб осуществляли автоматическими пипетками фирмы «GILSON». До высева автоклавированные и разлитые в • чашки Петри плотные питательные среды подсушивали в сухо-жаровом шкафу при температуре 27 С в течение 1 часа. Высев каждой пробы на плотную питательныю среду осуществляли в объеме 0,1 мл на 10 чашек Петри. Материал растирали шпателем Дригальского — «сплошным газоном». Обработанные чашки Петри с пробами помещали в термостат на 24−48 часов о при температуре 37,2 С. Оценку результатов высева проб на плотные питательные среды проводили после появления учитываемых колониеобразующих единиц (КОЕ) по всей площади поверхности чашки Петри. Подсчет КОЕ и их дифференциацию проводили с учетом особенностей культуральных свойств микроорганизмов (форма, цвет колонии и т. п.). Изучение и идентификацию выделенных микроорганизмов проводили с использованием серологических, биохимических методов, включающих применение систем индикаторных бумажных (СИБ № 2).

Для исследования эффективности использования глауконита Каринского месторождения для снижения токсичности кормов было сформировано по принципу аналогов 6 групп цыплят-бройлеров (2 контрольные и 4 опытные) по 30 голов в каждой. Кормление птицы осуществляли вволю (ad libitum) сухими сбалансированными комбикормами с параметрами питательности, соответствующими рекомендуемым нормам кормления ВНИТИП (2003 г). До 5-дневного возраста цыплята всех групп получали «нулевой» рацион, с 6-дневного — опытные кормосмеси. Условия содержания птицы соответствовали принятым зоогигиеническим параметрам. '.

Продолжительность опыта составила 5 недель (35 дней).

Для изучения влияния глауконита на физиологические показатели • организма птицы были выделены 4 группы-аналогов. Первая контрольная группа получала основной рацион, свободный от микотоксинов (ОР[). Птице.

2-й опытной группы вводили минеральную добавку в количестве 2% от массы сухого вещества комбикорма (98% OPj + 2% глауконита). Цыплята из.

3-й группы получали 4% глауконита в основном рационе (96% OPi + 4% глауконита). Во все опытные группы глауконит с размерами частиц 1−2 мм равномерно включали в комбикорма на ранней стадии их приготовления I методом ступенчатого смешивания.

Бройлеры второй контрольной группы (группа 4) получали сбалансированный рацион (ОРг), но с содержанием микотоксинов в корме, вызывающим снижение продуктивности птицы: 4-дезоксиниваленол [ДОН] - 4,6-мг/кг [3,0 ПДК], Т-2-микотоксин — 0,34 мг/кг [4,5 ПДК] и фумонизин В] — 14,3 мг/кг [2,9 ПДК] — указанные уровни и виды вторичных метаболитов микромицетов наиболее часто обнаруживаются в условиях большинства птицеводческих хозяйств России.

Микотоксины вводили в комбикорм в виде фунгальной биомассы на основе зерна кукурузы, содержащего токсигенные штаммы четырех культур грибов-продуцентов с токсическими продуктами их жизнедеятельности, а также путём включения в кормосмесь выделенных и очищенных в лабораторных условиях экстрактов соответствующих микотоксинов. Кроме указанных продуцентов рацион подопытной птицы не содержал фоновых количеств каких-либо иных ксенобиотиков. С целью изучения эффективности использования изучаемой добавки, при выраженном течении токсикоза, в рацион цыплят 5-й опытной группы вводили 2% глауконита, по аналогии с первым опытом, а для изучения повышения эффективности использования изучаемой добавки, уровень включения сорбента в рацион подопытным цыплятам из 6-й группы увеличивали до 4% от массы сухого вещества корма (96% ОР2 + 4% глауконита).

В конце периода выращивания для изучения переваримости и использования питательных веществ рациона, а также установления экскреции микотоксинов и витаминов, проводили балансовые опыты. Для этого в 5-недельном возрасте отбирали по 3 головы (с?) цыплят-бройлеров из каждой группы. Балансовый опыт был разделен на два периода: предварительный длился 5 дней, учётный — 3 дня. В опыте индивидуально по каждой птице учитывали: количество и химический состав потреблённого корма и выделенного помёта.

По окончании научно-производственного опыта проводили физиолого-биохимические исследования. Для выполнения запланированного объема анализов птицу декапитировали в 36-дневном возрасте по 6 голов (3 $+3(3*) из ' каждой группы. Образцы крови, химуса и 12-перстной кишки брали во время убоя птицы.

Исследование переваримости питательных веществ рационов проводили по общепринятым методикам /96/.

Содержание азота в содержимом химуса цыплят-бройлеров определяли определяли методом Кьельдаля.

Содержание каротиноидов в БКД «Баксин-вет» проводили в • соответствии с ГОСТ 13 406.17−95.

Угол естественного откоса измерялся в соответствии с ГОСТ 28 254–89 и ГОСТ 27 802–93 (ISO 902−76).

Для определения сроков годности и условий хранения БКД-БАКСИН использовали метод «ускоренного старения» в соответствии с «Временной инструкцией по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода „ускоренного старения“ при повышенной температуре. И-42−2-82. Министерство здравоохранения СССР. Министерство медицинской промышленности. 1983 г.» и «Методами контроля бактериологических питательных сред. Методические указания. Мук 4.2.2316−08 (утв. Роспотребнадзором 18.01.2008)» /41, 42/.

Образцы из одной партии БКД «Баксин-вет» выдерживались как при стандартных условиях хранения (Т=20°С) с определением действительных значений контролируемых показателей через три месяца в течение гарантийного срока хранения (два года), так и в условиях опыта по ускоренному старению при трех температурах, °С: 30, 50 и 80 непрерывно через каждые 30 суток в течение всего заданного срока и дополнительно за 10 суток до окончания эксперимента соответственно в термостате.

Пересчет срока экспериментального хранения (годности) на срок хранения (годности) при стандартных условиях (давление 101, 325 кПа, температура 20 град. С, относительная влажность воздуха 60%) проводят по следующему уравнению: д—2Q.

С = К X С3= 2 10 X с3,.

9) где К — коэффициент соответствия срока экспериментального хранения при повышенной температуре сроку хранения при стандартной температуре, равной 20 °C;

2 — принятое значение температурного коэффициента скорости химических реакций;

Тэ — температура экспериментального хранения, °С;

Сэ — срок экспериментального храненияС — срок хранения (годности) при стандартных условиях.

Экспериментальные данные обрабатывали методом корреляционного, ' вариационного и факторного статистического анализа с использованием пакета компьютерных программ «STATISTIC А», с помощью метода множественных сравнений Даннета (1978) /189/ и оценкой результатов по Ашмарину И. П. и Воробьеву А. А. (1962). /14/.