Конструирование и внедрение в практику генодиагностической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы

Актуальность проблемы. В настоящее время сибирская язва продолжает представлять серьезную проблему для здравоохранения и сельского хозяйства многих стран мира, включая Россию. Вспышки сибирской язвы у сельскохозяйственных животных наносят значительный экономический ущерб и представляют собой реальную угрозу заболевания людей. На территории России учтено более 35 тыс. стационарно-неблагополучных пунктов, где существуют почвенные очаги, обусловливающие эпидемический потенциал инфекции [Онищенко Г. Г. с соавт., 1999; Черкасский Б. JI., 2002]. Определенную опасность заноса инфекции представляет расширение импорта сельскохозяйственной продукции из неблагополучных по сибирской язве стран [Абакаримов. С. Г. с соавт., 1997; Онищенко Г. Г. с соавт., 1999; Dragon D. С. et al., 1995; Xudong L. et al., 1995].

Заболевания людей сибирской язвой на территории Российской Федерации регистрируются постоянно. С 1990 по 2000 год средний уровень составил 40 случаев в год или 0,026 на 100 тыс. населения [Черкасский Б. Л., 2002]. При этом за период 1999;2003 г. было зарегистрировано 76 случаев заболевания людей сибирской язвой в 8 субъектах Российской Федерации [Онищенко Г. Г., 1999;2003 гг.], а за 9 месяцев 2004 года — 14 случаев [Здоровье населения и среда обитания, 2004].

По мнению ряда авторов эпидемиологическую обстановку в России по сибирской язве можно оценить как напряженную и не имеющую тенденции к стабилизации [Монисов А. Н. с соавт., 1997; Черкасский Б. Л., 2002]. Кроме того, Bacillus anthracis рассматривается в качестве одного из наиболее вероятных агентов бактериологического оружия и средств биологического терроризма, что подтвердили события в США в октябре-ноябре 2001 г. [Онищенко Г. Г. с соавт., 2000; Воробьев с соавт., 2002; Jernigan J.A. et al., 2002; Онищенко Г. Г., Дроздов И. Г., 2004].

В обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия по сибирской язве особая роль отводится качественной и своевременной диагностике. Традиционная схема лабораторного анализа с использованием биопробных животных и выделением чистой культуры занимает до 10 дней [Бургасов П. Н., Рожков Г. И.,.

1984; Маринин Л. И. с соавт., 1999]. Для обнаружения В. anlhracis используются экспресс-методы, включающие иммунологические и генодиагностические тесты. Общим для всех иммуносерологических методов, направленных на выявление сибиреязвенного микроба, является их недостаточная чувствительность, составляющая 1×104 — 1×106 м.к./мл [Буравцсва Н. П. с соавт., 1989; Абалакин В. А., 1990].

В последнее время достигнуты значительные успехи в области познания структуры и функций генетического аппарата сибиреязвенного микроба [Strettons S., Goodman А. F., 1998; Okinaka R. Т. et al., 1999; Dai L. et al., 1995; Guidi-Rontani C. et al., 1999; Qi Y. et al., 2001; Wilson W.J. et al., 2002]. Определена полная нуклеотидная последовательность двух собственных плазмид (pXOl и рХ02), проведена серия работ по генотипированию [Kaspar R.L. et al., 1987; Okinaka R.T. et al., 1999; Keim P. et al., 2000]. Это явилось предпосылкой разработки новых молекулярно-гепетических методов детекции и идентификации В. anthracis.

Из генодиагностических методов наиболее широкое распространение получила полимеразная цепная реакция (ПЦР), ставшая в последние годы стандартной лабораторной методикой, регламентированной МУ 1.3.-1794−03 «Организация и проведение генодиагностических исследований биологического материала, пищевых продуктов и объектов окружающей среды, зараженных бактериями I-II групп патогенности». ПЦР-анализ характеризуется высокой чувствительностью (100 — 1000 м.к./мл), специфичностью и быстротой выполнения анализа, а также возможностью выявлять микроорганизмы с измененным фенотипом. Специфичность ПЦР определяется подбором праймеров. В литературе описано достаточно много праймеров для амплификации разных областей генома сибиреязвенного микроба, что позволяет не только выявлять возбудителя сибирской язвы, но и дифференцировать штаммы по ряду признаков [Carl М. et al., 1992; Turnbull P.C. В. et al., 1991; Reif Т. С. et al., 1994; Fellows P. F., 1996; Bohm R. et al., 1998; Robertson D. L. et al., 1999; Qi Y. et al., 2001].

Однако этот эффективный метод индикации и диагностики сибирской язвы до недавнего времени не был внедрен в практику здравоохранения Российской Федерации из-за отсутствия стандартных алгоритмов ПЦР-анализа и тест-систем, прошедших государственную регистрацию.

Вышеуказанные обстоятельства делают актуальным создание и практическое внедрение тест-системы для детекции возбудителя сибирской язвы, разработки схем генодиагностического анализа при лабораторной диагностике сибирской язвы и индикации возбудителя инфекции в объектах окружающей среды.

Цель работы — конструирование тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы в биологическом материале и объектах окружающей среды методом полимеразной цепной реакции и внедрение препарата в практику здравоохранения.

Основные задачи исследования :

1. Провести анализ генома возбудителя сибирской язвы с целью выбора видоспецифичных праймеров. •.

2. Подобрать параметры ПЦР для детекции штаммов В. аЫкгасгя.

3. Сконструировать тест-систему для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы в биологическом материале и объектах окружающей среды методом ПЦР. Определить ее диагностическую ценность (чувствительность, специфичность, воспроизводимость результатов).

4. Разработать нормативную документацию на созданную тест-систему для выявления ДНК В. апгкгаЫв рХ01+ методом ПЦР. Представить разработанную тест-систему для проведения Государственных приемочных испытаний в ГИСК им. Л. А. Тарасевича.

5. Разработать универсальный способ подготовки проб, обеспечивающий инактивацию спорообразующей культуры и последующую очистку ДНК-мишени.

6. Разработать параметры ПЦР с праймерами, выбранными на основе плазмид (рХ01, рХ02) для детекции штаммов В. аШкгаЫя, с различным плазмидным профилем.

7. Провести апробацию тест-системы в очаге сибирской язвы при исследовании клинического материала и объектов окружающей среды.

Научная новизна работы. Впервые сконструирована тест-система для выявления В. аШИгаЫБ рХ01+ методом полимеразной цепной реакции. На основании проведенного анализа генома возбудителя сибирской язвы определены видоспецифичные фрагменты ДНК, соответствующие нуклеотидным последовательностям генов pag (плазмида pXOl) и сарВ (плазмида рХ02). На их основе подобраны олигонуклеотидные затравки для ПЦР, обеспечивающие эффективную амплификацию ДНК-мишеней. Определена диагностическая ценность разработанной тест-системы и показана возможность ее использования для исследования биологического материала (кровь, суспензии органов) и объектов1 окружающей среды (почва, смывы).

Разработан универсальный способ подготовки проб, обеспечивающий обеззараживание спорообразующей культуры и последующую экстракцию ДНК, показана его высокая эффективность при работе с различными объектами (кровь, суспензии органов, почва).

Продемонстрирована эффективность использования разработанной тест-системы для диагностики кожной формы сибирской язвы у людей, сельскохозяйственных животных, а также детекции В. anthracis в объектах окружающей среды при проведении эпидемиологического расследования вспышек инфекции в очаге сибирской язвы (Республика Мордовия, 1999 г.).

Показана возможность дифференциации штаммов В. anthracis по плазмидному профилю методом мультилокуснои ПЦР.

Практическая значимость работы. По результатам работы разработана нормативная документация (фармакопейная статья предприятия (ФСП), экспериментально-производственный регламент (ЭПР) и регламент производства (РП), инструкция по применению) на тест-систему для выявления ДНК В. anthracis рХ01+ методом ПЦР.

Разработанный способ подготовки проб для ПЦР-анализа при работе со спорообразующими штаммами сибирской язвы представлен в методических указаниях «Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями 1-IV группы патогенности, при работе методом ПЦР» .

Проведены Государственные приемочные испытания «Тест-системы для выявления ДНК Bacillus anthracis рХ01+ методом полимеразной цепной реакции». Результаты Государственных испытаний одобрены на Ученом Совете ГИСК им. JI. А.

Тарасевича (протокол № 8 от 25.05.98 г.). Получено разрешение комитета МИБП иа внедрение «Тест-системы для выявления ДНК В. anthracis рХ01+ методом полимеразной цепной реакции» в практику здравоохранения (протокол № 3 от 18.06.98 г.). ФСП на препарат (№ 42−20 178 501) прошла экспертизу в Фармакологическом Комитете Российской Федерации и утверждена 12.11.2001 г., утверждены ЭПР № 560−00 и РП № 1504−04. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 4.01.2004 г. утверждена инструкция по применению «Тест-системы для выявления ДНК Bacillus anthracis рХ01+ методом полимеразной цепной реакции» .

Сконструированы и депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» монои бесплазмидные варианты вирулентных штаммов В: anthracis 81/1 и М28, использованы при проведении Государственных приемочных испытаний.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Праймеры на основе нуклеотидной последовательности гена pag плазмиды pXOl обеспечивают видоспецифическую детекцию штаммов Bacillus anthracis методом ПЦР.

2. Сконструированная тест-система для выявления ДНК Bacillus anthracis рХ01+ методом ПЦР характеризуется чувствительностью — 10 — 1000 м. к./мл, специфичностью — 100%, позволяет обнаружить ДНК возбудителя сибирской язвы в биологическом материале и объектах окружающей среды.

3. Способ подготовки проб, включающий этап инактивации спорообразующей культуры и последующую экстракцию ДНК с использованием в качестве лизирующего агента гуанидинтиоцианата, обеспечивает обеззараживание исследуемого материала и не влияет на чувствительность ПЦР-анализа.

4. Метод ПЦР эффективен для лабораторной диагностики сибирской язвы у людей и сельскохозяйственных животных, индикации В. anthracis в объектах окружающей среды, а также при эпидемиологическом расследовании вспышек инфекции.

5. Разработанный вариант ПЦР с праймерами на основе репликонов рХ01 и рХ02 позволяет дифференцировать атипичные по плазмидному профилю штаммы В. аМкгаш .

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Российских научных конференциях «Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций» (Волгоград, 1992) и «Актуальные вопросы дезинфекции, стерилизации, дезинсекции, дератизации» (Москва, 1992) — Межгосударственной научно-практической конференции «Актуальные вопросы чумы и других инфекционных заболеваний», посвященной 100-летию открытия возбудителя чумы (Ставрополь, 1994) — научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России (Саратов, 1997) — Юбилейной научной конференции «Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария», посвященной 70-летию НИИ микробиологии Минобороны России (Киров, 1998) — Международной научно-практической конференции «Проблемы санитарно-эпидемиологической охраны территории СНГ» (Саратов, 1998) — на 3-ей Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика в современной медицине» (Москва, 2000) — 1-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генная диагностика особо опасных инфекций» (Саратов, 2000) — итоговых научных конференциях РосНИПЧИ «Микроб» — 4-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2002) — 4-ой Межгосударственной научно-практической конференции «Современные технологии в диагностике особо опасных болезней» (Саратов, 2003).

Публикации. Основное содержание работы отражено в 23 научных публикациях.

Структура и объём диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Общий объем диссертации 160 страниц. Текст иллюстрирован 11 таблицами и 17 рисунками.

ВЫВОДЫ.

1. На основании анализа генома возбудителя сибирской язвы подобраны праймеры, соответствующие нуклеотидной последовательности гена pag (плазмида pXOl), кодирующего протективный антиген сибиреязвенного токсина, которые обеспечивают специфичную амплификацию ДНК сибиреязвенного микроба.

2. Разработаны оптимальные параметры реакции амплификации нуклеиновых кислот: состав реакционной смеси, температура и продолжительность циклов ПЦР, обеспечивающие специфичную детекцию штаммов Bacillus anthracis-, сконструирована тест-система для выявления ДНК В. anthracis рХ01+ методом ПЦР в биологическом? материале и объектах окружающей среды.

3. Разработана нормативная документация на тест-систему для выявления ДНК В. anthracis рХ01+ методом ПЦР: фармакопейная статья предприятия, эксперементально-производственный регламент, регламент производства и инструкция по применению.

4. Проведенные Государственные комиссионные испытания подтвердили диагностическую ценность тест-системы для выявления ДНК В. anthracis рХ01+ методом ПЦР: чувствительность — 10−1000 м.к./мл при исследовании чистых культур В. anthracis-, 100−1000 м.к./мл при анализе биологического материала и объектов окружающей среды, искусственно инфицированных В. anthracis-, специфичность составила 100%- воспроизводимость результатов ПЦР — 95%.

6. Разработаны параметры мультилокусной ПЦР для одновременной детекции фрагментов ДНК двух плазмид В. anthracis гена pag плазмиды pXOl и гена сарВ плазмиды рХ02. Применение данной модификации ПЦР-анализа дает возможность одновременной детекции и характеристики по признакам вирулентности штаммов сибиреязвенного микроба.

7. Впервые тест-система для выявления ДНК В. anthracis рХ01+ методом ПЦР была исиользована в очаге сибирской язвы для экспресс-диагностики инфекции у людей и сельскохозяйственных животных, а также при индикации возбудителя сибирской язвы в объектах окружающей среды (Республика Мордовия, 1999 г.) — доказана эффективность использования ПЦР-анализа для решения задач эпидемиологического расследования случаев сибирской язвыпоказана возможность применения ПЦР для диагностики кожной формы сибирской язвы при исследовании клинических образцов: содержимого карбункулов и струпов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сибирская язва представляет серь1зную проблему для здравоохранения и сельского хозяйства многих стран мира, включая Россию. Эпидемиологическую обстановку в России многие авторы оценивают как напряженную и не имеющую тенденции к стабилизации [Монисов А.Н. с соавт., 1997; Черкасский Б. Л., 2002]. Анализ штаммов В. anthracis различного происхождения с помощью молекулярно-генетических методов показал, что осложнения вызывают культуры, содержащие две высокомолекулярные плазмиды pXOl и рХ02, кодирующие основные факторы вирулентности — синтез трехкомпонеитиого экзотоксина и капсулы [Uchida J. et al., 1985; Lepplas S., 1991; 1995]. Плазмид с электрофоретической подвижностью характерной для pXOl и рХ02 у близкородственных бацилл не обнаружено [Ахмедзянов Ю. А. с соавт., 1989; Little S. F. et al., 1984]. ПроведШ полный ДНК-секвснс плазмид pXOl и рХ02. [Kaspar R.L. et al., 1987; Okinaka R. Т. et al., 1999]. Содержание ГЦ пар этих плазмид (33%) сходно с таковыми на хромосоме.

Достигнуты значительные успехи в области познания структуры и функций генетического аппарата сибиреязвенного микроба. [Okinaka R.T. et al., 1999; Qi Y. et al., 2001; Wilson W.J. et al., 2002].

Главные достижения последних лет в разработке способов обнаружения микроорганизмов обусловлены успехами молекулярной биологии и созданием диагностических методов, основанных на анализе генома [Tenover F.С., 1998; Кутырев В. В., Куличепко А. Н. и др., 2000]. Из генодиагностических методов наиболее широкое распространение получила полимеразная цепная реакция, ставшая в последние годы стандартной лабораторной методикой. В основу данной работы положена разработка h внедрение в практику здравоохранения тест-системы для выявления возбудителя сибирской язвы в биологическом материале и объектах окружающей среды.

Поиск уникальных ДНК-матриц вели на основе нуклеотидных последовательностей генов В. anthracis, кодирующих основные факторы вирулентности. Проанализировав отечественную и зарубежную литературу, используя компьютерную базу данных Jen Bank и программу Jene Ranner, нами был подобран ряд праймеров для детекции плазмид вирулентности сибиреязвенного микроба. Проведенные исследования позволили выбрать для создания тест-системы праймеры ВА1-ВА2 (внешние), фланкирующие участок гена pag, локализованного на плазмиде pXOl, размером 409 п.н. и ВАЗ-ВА4 (внутренние), приводящие к амплификации фрагмента ДНК, размером 154 п.н. Праймеры обладали специфической комлементарностью с pag-геном В. anthracis и отсутствием таковой с В. cereus, В. subtilis e Е. coli.

В серии экспериментов установлен оптимальный состав реакционной смеси и программа амплификации. На основании результатов, полученных при разработке стандартных параметров реакций, нами была сконструирована ПЦР тест-система для выявления ДНК В. anthracis рХ01+, состоящая из 8 компонентов: праймеры ВА1-ВА2 и ВАЗ-ВА4 — водные растворыTaq-полимераза — термостабильная ДНК-полимеразадНТФ — водный раствор дезоксинуклеозидтрифосфатовК — водный раствор ДНК В. anthracis СТИ-1 в концентрации 1нг/мкл- 10ХБ — 10-кратный буферный растворMg С12 — 2,5 мМ раствор магния хлоридамасло вазелиновое стерильноевода деионизоваиная стерильная.

Определение диагностической ценности разработанной ПЦР гест-системы осуществляли в процессе комиссионных испытаний на базах специализированных лабораторий ГИСК им. JI.A. Тарасевича (чистые культуры), Волгоградского НИПЧИ (объекты окружающей среды), ГНЦПМ (Оболенск) (биологический материал). Исследования проводили по программе, утвержденной комитетом МИБП (протокол № 3 от 17.03.98 г.), на чистых культурах В. anthracis с различной генетической характеристикой (рХОГ рХ02± рХ01+ рХ02″ - pXOl" рХ02± pXOl" рХ02″), В. cereus, В. subtilis, В. megaterium, В. thuringiensis, Е. coliв биологическом материале (кровь, органы животных) и объектах окружающей среды (почва), искусственно инфицированных возбудителем сибирской язвы или гетерологичными микроорганизмами. В качестве методов сравнения применяли бактериологический анализ и люминесцентную микроскопию.

В результате комиссионной проверки показан ряд положительных свойств ПЦРтест-системы для выявления В. anthracis рХ01+:

• продолжительность метода составляла 6 ч против 24 ч. при бактериологическом исследовании;

• на результаты анализа не влияет присутствие посторонней микрофлоры, которая при бактериологическом исследовании затрудняет получение чистой культуры.

Диагностический препарат обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

С помощью разработанной ПЦР тест-системы выявлено 100% проб биологического материала, содержащего В. аШНгасгз, в концентрации 1×103 м.к./мл и 100% проб из объектов окружающей среды (почва, смывы), искусственно инфицированных В. апЛгаЫя, в концентрации 8,2×10 м.к./мл. Специфичность тест-системы при исследовании проб, искусственно иифицированных В. апЛгаЫя и гетерогенными микроорганизмами, составила 100%. Воспроизводимость метода ПЦР -95%.

На основании результатов комиссионных испытаний получено разрешение комитета МИБП на внедрение «Тест-системы для выявления ДНК В. агйкгаш рХ01+ методом полимеразной цепной реакции» в практику здравоохранения (протокол № 3 от 18.06.98 г.).

Одним из этапов нашей работы было определение возможных путей совершенствования ПЦР-анализа для выявления В. агйкгаш. В последнее время для идентификации возбудителей инфекционных болезней начали применять мультиплексную ПЦР, которая позволяет проводить быстрый многофакторный анализ образца одновременно по нескольким параметрам. В случае с В. апЖгаЫз мультиплексная ПЦР позволит детектировать штаммы с измененным плазмидным профилем, и уже на этапе индикации возбудителя сибирской язвы проводить первичный анализ патогенноети выделенных штаммов, не увеличивая продолжительности анализа.

В качестве ДНК-мишени нами были выбраны структурные гены pag и еарВ. Ген pag расположен на плазмиде pXOl, а ген сарВ на плазмиде рХ02. Наличие у штамма двух плазмид свидетельствует о патогенноети культуры. В результате проведенного анализа были отобраны две пары праймеров PAI-PA2 и CAI-CA2, обеспечивающую специфичную амплификацию участка размеров 214 п.н. (pag гена) и участка размером 104 п.н. (сарВ гена) соответственно.

В ходе серии экспериментов установлен оптимальный состав реакционной смеси и программа амплификации. Чувствительность реакции составила 100 м.к./мл.

Сконструированная мультиплексная ПЦР тест-система была нами протестирована с би-, монои бесплазмидными штаммами В. anthracis. В качестве отрицательного контроля использовали микроорганизмы близкородственных видов: В. cereus и В. subtilis.

В результате проведения ПЦР наблюдали при электрофоретическом разделении фрагментов, полученных после амплификации ДНК биплазмидных штаммов В. anthracis, две дискретные полосы, по величине пробега соответствующие молекулам ДНК размером 214 и 104 п.н., что свидетельствовало о наличии pXOl и рХ02. При ПЦР анализе моноплазмидных штаммов возбудителей сибирской язвы осуществлялся синтез только одного фрагмента размером 214 п.н. у штаммов рХ01+ и 104 п.н. при тестировании культур рХ02+. У всех проверенных штаммов ложноотрицательных результатов не было зарегистрировано. У культур близкородственных сапрофитов, а также бесплазмидных штаммов штаммов В. anthracis реакции амплификации зарегистрировано не было.

Таким образом, нами разработана мультиплексная ПЦР тест-система для выявления ДНК В. anthracis (рХ01+, рХ02+), позволяющая с высокой л специфичностью (100%) и чувствительностью (1×10 м.к./мл) детектировать штаммы В. anthracis.

Полученные результаты по конструированию мультиплексной ПЦР тест-системы позволяют отметить большие перспективы использованной технологии в диагностике сибирской язвы, значительное снижение трудоемкости исследования при внедрении их в практику. .

Важным этапом наших исследований на модели возбудителя сибирской язвы была разработка оптимального способа обеззараживания культуры сибиреязвенного микроба, который с одной стороны обеспечивал бы полную инактивацию спор В. anthracis, а с другой не оказывал отрицательного влияния на ДНК-матрицу и на ферментативную полимеразную реакцию. Анализ полученных данных позволил нам предложить новую схему обработки материала, содержащего спорообразующую культуру В. anthracis, соответствующую СП 1.3.1285−03 Санитарные правила «Безопасность работы с микроорганизмами I-П групп патогенности (опасности)» .

Показана высокая эффективность двух использованных подходов подготовки проб к исследованию.

Результаты использованы при составлении методических указаний МУ 3.5.5,1034−01 «Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV группы патогенности, при работе методом ПЦР.

Разработанная тест-система для выявления ДНК В. anthracis рХ01+, использована в очаге сибирской язвы. С помощью этого препарата в 1999 году проведены исследования в очаге сибирской язвы в Республике Мордовия, где в селе Русское Байманово Рузаевского района были зарегистрированы групповые заболевания сибирской язвой людей и сельскохозяйственных животных.

Нами методом ПЦР с использованием разработанной тест-системы было проанализировано 14 клинических проб от леченных антибиотиком в течение 5−6 дней больных людей и находившихся в стадии выздоровления, а также 38 проб объектов окружающей среды. Проведенные исследования позволили подтвердить методом ПЦР у 4 из 6 больных клинический диагноз сибирской язвы, в то время как после лечения больных людей антибиотиками обнаружить возбудителя бактериологическими методами не представлялось возможным.

В материале от двух павших коров при ПЦР-анализе обнаружена ДНК возбудителя сибирской язвы, что подтвердили и результаты бактериологического исследования. Из 38 проб объектов окружающей среды в 20 методом ПЦР обнаружен В. аМНгасгз. Полученные результаты позволили быстро установить вероятный источник инфицирования животных. При целенаправленном отборе проб с мест определенных после проведения ПЦР во всех случаях бактериологическими методами выделен возбудитель сибирской язвы.

Таким образом, применение нового методического подхода — ПЦР-анализа с разработанной ПЦР тест-системой для выявления ДНК В. аЫЬгас18 рХ01+, оказалось максимально оперативным и результативным, что позволило в течение двух дней установить механизм эпизоотии и локализовать очаг сибирской язвы.

Разработанная ПЦР тест-система обладает необходимой надежностью, специфичностью и может быть использована как эффективный тест для индикации и экспресс-диагностики сибирской язвы при работе в очагах инфекций.