Антагонистические взаимодействия патогенного гриба и растения в инфекционной капле, связанные с активацией кислорода

Антагонистические взаимодействия растения с возбудителями болезней надземной части начинаются на его поверхности в инфекционной капле, то есть капле воды, содержащей инфекционное начало. Эта стадия заражения во многом определяет его дальнейшее течение и исход. Здесь микроорганизмы вступают в разнообразные отношения между собой и с растением-хозяином, в том числе и в биохимические, в которых важную роль играют противостоящие друг другу активные формы кислорода (АФК) и антиоксиданты., АФК растений при их избыточной продукции, называемой окислительным взрывом, являются частью механизма болезнеустойчивости. С одной стороны, они непосредственно токсичны для микроорганизмов, с другой — участвуют в иных защитных реакциях, в частности как сигнальные молекулы. Перечисленные факты общеизвестны и подтверждены множеством примеров. Однако некоторые аспекты взаимоотношений партнеров в инфекционной капле, в том числе, связанные с АФК и антиоксидантами, заслуживают более подробного изучения.

Это, например, влияние самой воды инфекционной капли на взаимоотношения растений с патогенами. Хорошо известно, что капельно-жидкая влага необходима для заражения надземной части растений большинством инфекционных болезней (Tapp, 1975), поэтому избыточное увлажнение способствует их распространению. Однако не исключено, что растения при частом поверхностном увлажнении могут адаптироваться, становясь, напротив, более устойчивыми. В литературе есть лишь косвенные указания на такую возможность. Например, что мучнистые росы более распространены и вредоносны на сухих территориях (Agrios, 1988). Если устойчивость, индуцированная водой, действительно, существует, то представляет интерес ее механизм, в том числе, участие в нем АФК.

Противоинфекционная роль АФК опосредована, в частности, элиситорами, индуцирующими окислительный взрыв и другие защитные реакции. Возможна и противоположная ситуация, когда АФК хозяина индуцируют выделение элисито-ров паразитом. Эта способность согласно гипотезе «двойной индукции» (Метлиц-кий и др., 1973) может быть проявлением болезнеустойчивости, поскольку диффундирующие элиситоры, по-видимому, раньше, чем связанные, индуцируют защитные реакции. Ранее показано, что споры гриба Magnaporthe grisea, возбудителя пирикуляриоза риса, под действием экзогенной перекиси водорода выделяют вещества, индуцирующие противоинфекционные реакции каллусов риса устойчивого сорта (Лапикова и др., 2000). Представляло интерес выяснить, происходит ли это с интактными растениями и как связано с их болезнеустойчивостью. Кроме того, поскольку споры и сами образуют АФК (Aver'yanov et al., 2007), следовало выяснить, как это явление влияет на выделение споровых элиситоров.

Антиоксиданты патогенных микроорганизмов, снижая концентрацию АФК, ослабляют АФК-зависимые защитные реакции растений и потому являются факторами патогенности (Аверьянов и др., 1981). Со своей стороны растения способны ингибировать некоторые другие факторы патогенности, например, литические ферменты (Дьяков и др., 2001). Не исключено, что такой антагонизм затрагивает и чужеродные антиоксиданты. Действительно, супероксиддисмутаза (СОД) после контакта с листьями риса перестает ослаблять супероксидзависимую фунгитоксич-ность их диффузатов, по-видимому, за счет выделения ингибитора СОД из листьев (Аверьянов, Лапикова, 1989). Возможный механизм этого явления следовало изучить.

В диссертации рассмотрены механизмы болезнеустойчивости, связанные с АФК, антиокислителями и элиситорами, взаимодействующие в инфекционной капле.

Объектами исследования были две патосистемы: пирикуляриоз риса, вызываемый грибом М. grisea, и оливковая пятнистость огурца, вызываемая грибом Cladosporium cucumerinum. Пирикуляриоз риса является сравнительно простой и широко используемой моделью инфекционных болезней. К тому же, рис одна из важнейших сельскохозяйственных культур, а пирикуляриоз — его самая вредоносная болезнь. Огурец — один из классических объектов для изучения системной индуцированной устойчивости. Следовательно, работа проведена на однодольном и двудольном растениях.

Цели и задачи исследований.

Целью работы было выяснение роли активных форм кислорода, антиокислительных ферментов и элиситоров на ранней стадии взаимодействия растений и патогенных грибов, а именно в инфекционной капле в связи с болезнеустойчивостью. В задачи работы входило:

1. Оценка влияния длительного поверхностного увлажнения листьев па локальную и системную болезнеустойчивость растений. Выяснение возможного участия АФК в этом явлении;

2. Выяснение возможности выделения элиситоров из грибных спор под действием АФК, добавленных извне или образованных самими спорами;

3. Исследование возможного влияния растений на чужеродные антиок-сиданты в связи с болезнеустойчивостью.

Научная новизна исследований.

1. Впервые описана болезнеустойчивость растений, двудольного (огурец) и однодольного (рис), индуцированная длительным поверхностным увлажнением их надземной части до заражения. В первом случае устойчивость проявлялась и локально, и системно, а во втором — только локально. На рисе возникновению устойчивости предшествовало и могло быть ее причиной увеличение образования супероксидного радикала (0{) листьями, но не токсичности их выделений. По-видимому, 02″ участвовал в механизме устойчивости как сигнальная молекула. Предполагается, что капельно-жидкая влага вымывает из клеточных стенок растения элиситоры, которые индуцируют окислительный взрыв и последующие проти-воинфекционные реакции.

2. Обнаружена элиситорная активность экзометаболитов спор М. grisea, проявлявшаяся на интактных растениях риса устойчивого, но не восприимчивого сорта. Она была следствием образования АФК спорами и усиливалась в присутствии экзогенной Н202- Для элиситорной активности был необходим одновременный контакт листьев с низкои высокомолекулярными экзометаболитами спор.

3. Описанная ранее (Аверьянов, Лапикова, 1989) потеря способности чужеродной медь-цинковой СОД после контакта с листьями риса детоксицировать 02~ подтверждена на том же и выявлена на других устойчивых сортах, а также в искусственной 02″ -генерирующей системе. Представлены данные, согласно которым экзогенный фермент, а именно ион меди его активного центра, может индуцировать выделение листом соответствующего ингибитора, и что этим ингибитором может быть салициловая кислота.

Практическая значимость работы.

Работа является фундаментальной, но указывает возможные направления прикладных разработок. Так, при опрыскивании надземных частей растений следует учитывать, что вода, содержащаяся в агрохимических препаратах, может повышать фоновую продукцию АФК растениями, и тем влиять на эффект действующего вещества, которое, в свою очередь, может влиять на эффект воды.

Полученные данные, связанные с элиситорами, могут стать основой для поиска маркеров и создания индукторов устойчивости. В первом случае — это различие реакций восприимчивого и устойчивого сортов риса на обработку грибными элиситорами и увлажнение. Во втором случае новыми индукторами устойчивости могут быть препараты, содержащие природные элиситоры или их синтетические аналоги, или вещества, индуцирующие или повышающие природную элиситорную активность. В частности, возможно выявление химических и физических факторов, стимулирующих выделение элиситоров грибными спорами, не повреждая их непосредственно и не влияя на растения. При этом показано, что действие элиситоров разной природы на устойчивые и восприимчивые сорта может отличаться.

Средствами защиты растений, вероятно, могут быть также экзогенные ингибиторы антиоксидантов патогена или вещества, активирующие синтез или выделение аналогичных ингибиторов растением. Антиокислительные ферменты животных часто используются как инструменты исследования растений. Следует учитывать возможное изменение свойств таких ферментов при контакте с растительными тканями, способное искажать результаты.

Экспериментальные данные и теоретические обобщения диссертации могут быть использованы в курсах лекций для биологических факультетов.

Апробация работы и публикации результатов исследований.

Материалы диссертации были представлены: на 15-м FESPB (Federation of European Societies of Plant Biology) Конгрессе 17−21 июля 2006, Лион, Францияна Международном симпозиуме «Non-specific innate and acquired plant resistance», 31 августа — 3 сентября 2006, Будапешт, Венгрияна 15-м International Reinhardsbrunn Symposium «Modern Fungicides and Antifimmgal Compounds», 6−10 мая 2007, Фрид-рихрода, Германияна SFFR Plant Oxygen Group Meeting «ROS in Plants. Reactive Oxygen and Nitrogen Species in Plants», Гент, Бельгия, 12−14 сентября, 2007; на 9ом International Congress of Plant Pathology, 24−29 августа, 2008; на SFFR Plant Oxygen Group Meeting on Reactive Oxygen and Nitrogen Species «Plant ROS 2009», 8−10 июля, 2009, Хельсинки, Финляндияна Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс», 9−12 ноября 2010, Москва.

По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Работа была частью российско-американского проекта № 2682р «Проокси-дантное / антиоксидантное состояние инфекционной капли в связи с болезнеустойчивостью растений» Международного научно-технического центра. Основные положения диссертациии изложены в квартальных и годовых отчетах по проекту и обсуждались с американским коллаборатором С.Дж. Бейкером (лаборатория молекулярной патологии растений, служба сельскохозяйственных исследований Департамент сельского хозяйства США, Белтсвилл, Мериленд, США).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Длительный поверхностный контакт листьев с небольшим объемом воды индуцирует локальную и системную устойчивость огурца к последующему заражению оливковой пятнистостью, а также локальную устойчивость риса к последующему заражению пирикуляриозом. Это может быть адаптацией растений к повышенному риску заражения в условиях повышенного увлажнения.

2. Повышению болезнеустойчивости, вызванному водой, предшествует увеличение продукции АФК листьями. Предполагается, что причиной этого явления служит вымывание эндогенных элиситоров из растительных клеток, а следствием — повышение болезнеустойчивости.

3. Диффузат спор возбудителя пирикуляриоза, проросших в Н202 нетоксичной концентрации, стимулирует такие защитные реакции, как окислительный взрыв и затем некротизацию у устойчивого, но не восприимчивого сорта риса. Элиситорные свойства такого диффузата спор проявляются при одновременном контакте его высокои низкомолекулярных компонентов с листом. Предполагается, что выделение элиситоров паразита под действием АФК хозяина является одним из механизмов болезнеустойчивости.

4. Диффузаты спор, проросших в отсутствие экзогенной Н202, тоже обладают элиситорной активностью, но меньшей. Для этой активности необходимо образование 02~ и Н202 прорастающими спорами. Предполагается, что в неблагоприятных условиях как активация кислорода, так и выделение элиситоров спорами увеличиваются, способствуя болезнеустойчивости растений.

5. Чужеродная медь-цинковая СОД теряет детоксицирующие свойства при контакте с листьями риса, возможно, из-за ингибитора, выход которого индуцируется ионами меди активного центра фермента. Ингибитором может быть салициловая кислота или сходное соединение. Предполагается, что антиокислительные ферменты патогена также ин-гибируются растением, что тоже может быть одним из механизмов болезнеустойчивости.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов, методов и результатов исследований, выводов, заключения и списка литературы. Материал изложен на 146 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц и 41 рисунок. Список использованной литературы включает 188 работ, из которых 115 на английском языке.

выводы.

1. Однодневный поверхностный контакт листьев с небольшим объемом воды до заражения индуцирует локальную и системную устойчивость огурца к оливковой пятнистости и локальную устойчивость риса к пирикуляриозу. Это может быть адаптацией к условиям повышенного увлажнения, благоприятным для инфекции.

2. У риса этой реакции предшествует и является возможной ее причиной увеличение продукции 02″ листьями. Вероятно, оно является следствием вымывания элиситоров из контактирующих с водой тканей растения.

3. Диффузат спор М. grisea стимулирует продукцию 02″ и некротизацию листьев устойчивого сорта риса. Этой элиситорной активности нет, если споры прорастали в растворах СОД или катал азы. Нетоксичная концентрация Н202, напротив, стимулирует ее. В элиситорной активности диффузата спор одновременно участвуют его высокои низкомолекулярные компоненты. Следовательно, собственные АФК прорастающих спор, а, возможно, и АФК хозяина способствуют выходу грибных элиситоров. Предполагается, что это один из механизмов несовместимости.

4. Чужеродная CuZn-СОД теряет детоксицирующие свойства на листьях риса или в диффузатах таких листьев, ранее контактировавших с ферментом. Предполагается, что растения выделяют ингибитор СОД и, возможно, других антиокислительных ферментов патогена.

5. Салициловая кислота подавляет детоксицирующие свойства CuZn-СОД в диффузатах листьев и каллусов риса. Не исключено, что она (или родственное соединение) является ингибитором СОД, выходящим из листьев. Индуктором его выхода могут быть ионы меди активного центра фермента.

6. Таким образом, антагонизм растения и патогена в инфекционной капле, осуществляется, в частности, через взаимодействия АФК, элиситоров и ан-тиоксидантов, а также, возможно, и других веществ, влияющих на эти взаимодействия.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Aver’yanov A.A., Pasechnik T.D., Lapikova V.P., Romanova T.S., Gaivoron-skaya L.M., Abramova O.S., Kuznetsov V.V., Baker J.C. (2006) Prooxi-dant/antioxidant early interactions of rice plant with blast fungus. In: XV FESPB Congress. July 17−21. Lyon-France, Lyon, p. 141.

2. Aver’yanov A.A., Lapikova V.P., Pasechnik T.D., Romanova T.S., Gaivoron-skaya L.M., Abramova O.S., Baker J.C. (2006) ROS and antioxidants in the infection droplet as related to rice blast resistance. In: Non-specific innate and acquired plant resistance. August 31- September 3, 2006. Budapest, Hungary, Budapest, p. 17.

3. Aver’yanov A.A., Romanova T.S., Pasechnik T.D., Lapikova V.P., Baker J.C.

2007) Water droplets on rice leaves induce resistance to blast. In: 15th International Reinhardsbrunn Symposium «Modern Fungicides and Antifungal Compounds. May 06−10, 2007. Friedrichroda — Germany», Friedrichroda, p. 122.

4. Aver’yanov A.A., Romanova T.S., Pasechnik T.D., Lapikova V.P., Gaivoron-skaya L.M., Baker C.J. (2007) Alien enzymatic antioxidants can lose their protective potential in contact with rice leaves. In: International Symposium «ROS in Plants. Signalling &. Metabolism, Oxidative stress, Antioxidants «. September 1214, 2007, Ghent, Belgium, Ghent, p.57.

5. Aver’yanov A.A., Romanova T.S., Pasechnik T.D., Lapikova V.P., Baker C.J.

2008) How could water droplets on rice leaves reduce severity of rice blast infection? In: Modern Fungicides and Antifungal Compounds V., Dehne H.W., Deising H., Gisi U., Kuck K.H., Russell P.E., Lyr H. (eds.) Alton, UK: BCPC, p. 52.

6. Aver’yanov A.A., Pasechnik T.D., Lapikova V.P., Romanova T.S., Gaivoron-skaya L.M., Abramova O.S., Kuznetsov VI.V., Baker C.J. (2008) Early pro- / antioxidative interplay between host and parasite. In: 9th International Congress of Plant Pathology (ICPP 2008). August 24−29, 2008. Torino, Italy, Pisa: EDIZIONI ETS, S2.211−212.

7. Романова T.C., Аверьянов A.A., Пасечник Т. Д., Лапикова В. П., Бейкер К.Дж. (2009) Устойчивость риса к пирикуляриозу, вызванная поверхностным увлажнением листьев перед заражением. Физиология растений, 56, 431−436.

8. Romanova T.S., Aver’yanov А.А., Pasechnik T.D., Lapikova V.P., Baker C.J.

2009) Contact of blast spores to ROS and rice leaves to water may elicit ROS-dependent plant defense responses. In: A SFRR Plant Oxygen Group Meeting on Reactive Oxygen and Nitrogen Species «Plant ROS 2009». July 8−10, '2009. Finland, Helsinki, p. 114.

9. Aver’yanov A.A., Romanova T.S., Pasechnik T.D., Lapikova V.P., Abramova O.S., Gaivoronskaya L.M., Baker C.J. (2009) Proand antioxidant activiting fungal spores as related to plant disease resistance. In: A SFRR Plant Oxygen Group Meeting on Reactive Oxygen and Nitrogen Species «Plant ROS 2009». July 8−10, 2009. Finland, Helsinki, p. 97.

10. Захаренкова T.C., Аверьянов A.A., Пасечник Т. Д., Лапикова В. П., Бейкер К.Дж. (2010) Выделение элиситоров спорами возбудителя пирику-ляриоза риса под влиянием активных форм кислорода. Физиология растений, 57, 615−619.

11. Захаренкова Т. С., Аверьянов А. А., Пасечник Т. Д., Лапикова В. П., Бейкер К.Дж. (2010) Капли влаги на листьях как фактор устойчивости к инфекциям. В сб.: Всероссийский симпозиум «РАСТЕНИЕ И СТРЕСС». 9−12 ноября, Москва, Москва, с 155−156.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В работе рассмотрены некоторые новые аспекты химических антагонистических взаимодействий патогенного гриба и растения на ранней стадии заражения (рис. 5.6). Чтобы воспроизвести естественные условия, опыты проводили на полностью интактных растениях без применения раневой инокуляции и смачивателей.

Установлено, что во взаимодействиях хозяина и патогена помимо их экзоме-таболитов участвует вода инфекционной капли. Она, благоприятствуя развитию патогена, одновременно может индуцировать болезнеустойчивость, предположительно^ участием АФК. Возможно, это связано с эндогенными элиситорами растений, освобождаемыми водой.

Увеличение продукции АФК в инфекционной капле, как растением, так и патогеном, по-видимому, способно активировать выход элиситоров из его спор, что стимулирует образование АФК еще сильнее. Это, в свою очередь, приводит к подавлению развития паразита активными формами кислорода и другим защитным реакциям.

При любом участии АФК в противоинфекционных реакциях растения антиокислители паразита, очевидно, являются факторами патогенности. Не исключено, что антагонизм со стороны растения выражается в ингибировании антиокислительных ферментов патогена, и это является одним из проявлений болезнеустойчивости.

Существенно, что вышеописанные процессы происходят на самой ранней стадии болезни и могут быть критичны для ее дальнейшего развития.

Рис. 5.6. Проокислитель-ные/ антиокислительные взаимодействия растения и патогена в инфекционной капле. г.