Механизм поступления цисплатина в клетки с участием системы транспорта меди

Актуальность исследования. Цисплатин и его аналоги — широко используемая в клинической практике группа противоопухолевых препаратов {Lippert, 1999). Их действие основано на повреждении ДНК, индуцированных им функциональных нарушениях, в конечном итоге, приводящих к апоптозу (Sedletska et al., 2005). Основное ограничение применения платиновых препаратов — высокая токсичность, а также тканеспецифическая и приобретенная устойчивость клеток опухолей. Устойчивость к цисплатину может обуславливаться несколькими механизмами — снижением импорта препарата, увеличением выведения, детоксикацией и повышением емкости репарационных систем. Критическим из этих уровней является поступление препарата в клетку.

Повышение эффективности применения этих препаратов ограничивается отсутствием удовлетворительных объяснений механизма импорта соединений платины в клетки. Цисплатин относится к малым полярным молекулам с большим дипольным моментом. В настоящее время наиболее известны три основных пути поступления этих веществ в клетку: пассивная диффузия, транспорт через транспортер органических катионов ОСТ2 и транспорт через высокоаффинный импортер меди CTR1 {Hall et al., 2008). Пассивная диффузия не может объяснить вариабельность динамики поступления платины в клетки разных тканей. Белок ОСТ2 транспортирует цисплатин, но он экспрессируется в очень ограниченном наборе клеток, что не позволяет считать ОСТ2 универсальным переносчиком цисплатина. В то же время CTR1 экспрессируется во всех клетках на всех этапах онтогенетического развития и исследованные опухоли демонстрируют его повышенную экспрессию (Gupta, Lutsenko, 2009). В 2002 г. впервые показано, что делеция CTR1 приводит к развитию устойчивости клеток к цисплатину (Ishida et al., 2002), а сверхэкспрессия CTR1 — к увеличению импорта платины (Beretta et al., 2004; Guo et al., 2004a). Это было показано в ряде лабораторий на различных объектах и в настоящее время парадигма транспорта цисплатина через CTR1 является общепринятой {Howell et al., 2010). Это обстоятельство привлекает внимание к белку CTR1, как центральному участнику переноса платиновых препаратов.

CTR1 представляет собой небольшой консервативный эукариотический белок, содержащий три трансмембранных домена и функционирующий в виде стабильного гомотримера. Основное место локализации CTR1 -плазматическая мембрана, его гидрофильный iV-конец обращен во внеклеточное пространство и содержит три потенциальных медьсвязывающих мотива {Klomp et al., 2002). Остается неясным, каким образом CTR1, высокоселективный по отношению к Cu (I) транспортный белок, может переносить платиновый комплекс с сильно отличающимися размерами и координационными свойствами. Также неясно, связана ли биологическая функция CTR1 — транспорт меди, с переносом цисплатина, и, если связана, то каким образом? Разработка модели переноса платинового комплекса через CTR1, установление связи между статусом меди и транспортом платины в клетку, а также поиск условий, при которых CTR1 эффективнее импортирует платиновый препарат, могут помочь в разработке новых терапевтических протоколов, характеризующихся меньшей токсичностью, большей эффективностью и специфичностью воздействия. Вышеизложенное определяет актуальность исследования, представленного в данной работе.

Цель работы — разработка и проверка концепции, объясняющей взаимосвязь статуса меди и CTR1-опосредованного транспорта цисплатина. Для достижения поставленной цели было намечено решение следующих задач:

1. Осуществить анализ структуры CTR1 в контексте функционирования купрофильного канала и его селективности по отношению к меди (1) и абиогенным субстратам (серебро и цисплатин).

2. Проверить на модельных системах in vitro взаимодействие координационных соединений платины с нуклеофильными группами белков и ДНК.

3. Оценить корреляцию между тканеспецифической экспрессией CTR1 и квазистационарным уровнем меди, накоплением серебра и поглощением платины.

4. Разработать и охарактеризовать модели млекопитающих с переключаемым статусом меди.

5. Проверить in vivo концепцию ко-транспорта меди и платины через CTR1, разработанную на основе строения медьсвязывающих доменов А^-конца.

6. Исследовать влияние статуса меди на рост опухолей в различных моделях.

Научная новизна полученных результатов. На основе филогенетического и статистического анализа последовательностей белков семейства CTR1, извлеченных из открытых баз данных, молекулярного моделирования и расчета взаимной ориентации доменов создана структурно-функциональная модель гомотримера CTR1 млекопитающих. С учетом результатов анализа медьсвязывающих сайтов с точки зрения концепций координационной химии предложена модель, устанавливающая механизм транспорта цисплатина через CTR1 и его связь с импортом меди. В физико-химических экспериментах, использовавших вновь полученные смешаннолигандные соединения платины и различные классы природных нуклеофилов, подтверждены выводы теоретического анализа и показано, что связывание цисплатина с остатками метионина приводит к быстрому исчезновению его характеристических ДНК-связывающих свойств. На разработанной и охарактеризованной модели лабораторных грызунов с дефицитом церулоплазмин-ассоциированной меди подтверждено, что CTR1 может осуществлять Cu-опосредованный импорт платины, и изменение статуса меди влияет на фармакокинетику цисплатина у грызунов. Продемонстрировано, что снижение показателей статуса меди может подавлять скорость роста ксенотрансплантатных опухолей.

Научно-практическое значение полученных результатов состоит в том, что они открывают перспективу для оптимизации протоколов применения противоопухолевого препарата цисплатина в клинике на основе рационального понимания механизма его транспорта. Полученные результаты расширяют представления о транспорте меди, серебра и платины в организме млекопитающих, а также углубляют знания о механизмах, лежащих в основе нарушения метаболизма меди, ведущих к развитию медь-ассоциипованных болезней. Применение разработанных физико-химических моделей позволит изучить тонкие аспекты механизмов взаимодействия платиновых комплексов с биомолекулами. Использование модели животных с изменяемым статусом меди является перспективным для исследования роли меди в возникновении и развитии опухолей, а также их восприимчивости к терапии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Строение медьсвязывающих сайтов CTR1 обеспечивает селективное связывание и транслокацию меди (1), серебра и платины, что является причиной связи метаболизма меди и чувствительности клеток к цисплатину. Ведущую роль в связывании платины принадлежит метиониновым кластерам внеклеточного^{-концевого} домена.

2. Метионин и другие серосодержащие лиганды снижают ДНК-связывающие свойства цисплатина in vitro за счет лабилизации координационной сферы и потери исходных лигандов препарата.

3. Экспрессия гена CTR1 носит тканеспецифический характер, зависит от уровня внутриклеточной меди и коррелирует с текущей потребностью клеток в меди.

4. У лабораторных грызунов снижение показателей статуса меди может быть достигнуто с помощью Ag-диеты, которая вызывает снижение содержания меди, ассоциированной с церулоплазмином в крови. Однократное введение сульфата меди долгосрочно восстанавливает показатели статуса меди.

5. Статус меди, скорость роста опухолей и перенос цисплатина в клетки связаны между собой.

Медь в состояниях окисления Cu (I) и Cu (II) обнаруживается в составе всех живых организмов. Сочетание окислительно-восстановительных, координационных и каталитических свойств ионов меди делает их незаменимыми кофакторами купроэнзимов. У всех аэробных организмов купроэнзимы участвуют в дыхании (цитохром-с-оксидаза) и защите от супероксид-анионов (Cu/Zn-супероксиддисмутаза). У млекопитающих купроэнзимы участвуют в транспорте железа, синтезе коллагена, меланина, предшественников нейропептидов и др. (Prohaska, 2008). Однако в неконтролируемом молекулярном окружении ионы меди способны инициировать образование свободных радикалов, которые действуют на клетку наподобие ионизирующей радиации, а также вызывают катализ прочих нежелательных реакций {Harris, Gitlin 1996; Linder, 2001). Связывание ионов меди из окружающей среды, их безопасный перенос к формирующимся купроэнзимам и выведение меди осуществляет метаболическая система меди (МСМ). В результате исследований последних лет сформировалась концепция организации МСМ, принципы построения которой одинаковы у всех живых организмов (Kim, 2008; Kaplan, Lutsenko, 2009). МСМ включает в себя интегральные белки плазматической мембраны, транспортирующие медь в клетку и из клеткицитозольные и ассоциированные с мембраной шапероны, которые переносят медь в активные центры ферментов, и внеклеточные транспортеры ионов меди (Рис. 1). При этом ионы меди передаются из одного металлсвязывающего сайта в другой сайт при непосредственном контакте белков МСМ (Band et al. 2010). Внутри клетки медь транспортируется в восстановленном состоянии Cu (I), в то время как в межклеточных жидкостях она находится преимущественно в окисленном состоянии Cu (II). У многоклеточных животных существует также развитая внеклеточная система гомеостаза меди, обеспечивающая транспорт и регулирование уровня меди в межклеточных жидкостях (Linder, 1998). Поэтому в клетке и межклеточных жидкостях нет токсичных «свободных» ионов меди, то есть ионов меди со случайным лигандным окружением.

О — ката.

Рис. 1. Обобщенная схема метаболической системы меди (МСМ) клеток позвоночных животных. Заштрихованными фигурами изображены медьтранспортные белки (CTR1, CTR2 — высокои низкоаффинные транспортеры меди, АТР7А, АТР7Вмедьтранспортные АТРазы Менкеса и Вильсона, АТОХ1, CCS, СОХ 17 — Си (1)-шапероны), темно-серыми — купроэнзимы (СОХ — цитохром-с-оксидаза, SOD — Cu/Zn-супероксиддисмутаза), светло-серым — известные медьсвязывающие молекулы, роль которых в МСМ точно не установлена (GSH — глутатион, МТметаллотионеин, COMMD1 — белок COMMD1/MURR1). Пунктирной линией изображены гипотетические участники и пути МСМ, молекулярная природа которых на данный момент не установлена. Путь обеспечения медью СОХ показан упрощенно.

За последнее время накоплено много фактов, свидетельствующих о том, что медь, помимо каталитической функции, выполняет важную роль в сигналинге (Mufti et al., 2007). Так, внутриклеточный Си (Н)-связывающий белок COMMD1 связан с регуляцией клеточного цискла и апоптоза, через модулирование связывания Х-сцепленного ингибитора апоптоза с каспазами (Burstein et al, 2004). К тому же медь участвует в регуляции активности транскрипционного фактора HIFI, контролирующего гены, ответственные за перепрограммирование энергетического метаболизма (эффект Варбурга) при.

— Си (.

— Си (опухолевой трансформации (Martin et al., 2005; Zhivotovsky, Orrenius, 2009). Наконец, ионы меди необходимы для неоваскуляризации (Lowndes, Harris, 2005),.

У млекопитающих врожденные и приобретенные нарушения метаболизма меди приводят к дефициту или к избытку меди в клетках. При этом дефицит меди может развиться на фоне избытка меди, если она не может быть вовлечена в метаболизм. В результате развиваются тяжелые формы анемии, дефекты сосудов, гипопигментация волос, изменения структуры костной ткани, нарушения деятельности ЦНС, нарушение обмена липидов, синтеза пептидных гормонов, болезни Менкеса и Вильсонас нарушениями метаболизма меди ассоциированы болезнь Альцгеймера, прионная болезнь, амиотрофический латеральный склероз, рак, остеопороз и др. (Gagelli et al., 2006; Mason, 1979; Menkes et al., 1962; Owen, 1981).

Дополнительный интерес к метаболической системе меди обусловлен тем, что ряд медьтранспортных белков способен связывать противоопухолевые препараты на основе платины, а изменение экспрессии соответствующих генов приводит к изменению чувствительности клеток к препаратам (Ishida et al., 2002; Abada, Howell, 2010). Платиновые препаратыцисплатин и его аналоги — группа высокоэффективных антинеопластических средств, широко используемых в клинической практике, к которым с момента их внедрения сохраняется высокий интерес (Рис. 2).

В естественных оптимальных условиях МСМ высоко селективны по отношению к меди: белки МСМ надежно отличают ионы меди от других сходных по координационным свойствам биогенных ионов — Zn (II), Fe (II). Однако координационные соединения платины — ксенобиотики, не встречающиеся в естественных условиях, и поэтому не могли быть учтены эволюцией. По этой причине клетки не имеют специфических путей транспорта платиновых комплексов и защиты от них.

3000 2500 -2000 -1500 -1000 500.

Г^КГ^ООООООООООСПСПа)СГ)СТ)ОООООтcr>cncna)CDaiCT)cna)cna)cna)000 ooo.

T-r-T-r-T-T-T-T-T-T-T-T-T-(NCMCMCMCNOJ.

Рис. 2. Число публикаций, содержащих термин «cisplatin» (или основные синонимические названия цисплатина) в реферативной базе данных NCBI Medline (www.ncbi.nlm.nih.gov/medline) по состоянию на конец августа 2011 г.

В этом контексте представляет большой интерес установление причин, обуславливающих неожиданную специфичность белков МСМ к цисплатину, и исследование взаимосвязи транспорта меди и платиновых препаратов. Рациональных гипотез, надежно объясняющих соотношения «структура-биологическая активность» для координационных соединений платины до сих пор не предложено: новые платиновые цитостатики получают преимущественно путем комбинаторного синтеза и скрининга (Са1атИ, 2006). Белки МСМ могут быть важным недостающим элементом в моделях метаболизма платины. Поэтому исследование молекулярных механизмов, обуславливающих взаимосвязь транспорта меди и цисплатина, может в перспективе содействовать обнаружению новых препаратов или увеличению эффективности уже существующих препаратов за счет оптимизации протоколов их применения.

При исследовании метаболизма меди и его связи с транспортом цисплатина большую роль может сыграть использование другого неспецифического абиогенного субстрата МСМ — ионов серебра А§-(1). Серебро (1) по химическим свойствам схоже с медью (1) (см. главу 1), по этой причине многие медьтранспортные белки не могут надежно различить Си (1) и.

Ag (I) (Bertinato et al., 2010; Hanson et al., 2001). В то же время, хотя ионы серебра транспортируются в организме млекопитающих (Sugawara, Sugawara, 2000) и вызывают изменения уровня внеклеточной меди (Pribyl et al., 1980), для млекопитающих серебро малотоксично. Вероятно, механизм обеспечения ключевых медьсодержащих белков ионами меди значительно более специфичен к меди, чем медьтранспортные белки. Это создает возможности селективного воздействия на некоторые пути метаболизма меди, сопровождающегося острыми токсическими нарушениями функционирования организма.

В данной работе были проведены объединенные исследования транспорта абиогенных субстратов медьтранспортной системы — цисплатина и ионов серебра. С помощью молекулярного моделирования и кинетического эксперимента проанализированы предпосылки связывания меди, цисплатина и серебра с белком CTR1, обеспечивающим импорт меди в клетку, и, по-видимому, являющимся узловой точкой взаимодействия транспорта меди и цисплатина. Исследованы изменения в метаболизме меди у лабораторных грызунов, получающих с пищей ионы серебра. Охарактеризованная животная модель была использована для выяснения того, как изменения метаболизма меди, индуцированные серебром, влияют на транспорт цисплатина и опухолевый рост.

Результаты исследования систем [?-Ме1+ДНК]+цисплатин приведены в табл. 3.4. При высоких, по сравнению с числом потенциальных сайтов взаимодействия с ДНК, концентрациях платины, наличие Met в смеси практически не оказывает влияния на платинирование ДНК (табл. 3.4). В то же время при «низких» концентрациях цисплатина (которые еще очень велики по сравнению с реально действующим in vivo, см., например, рис. 5.5), добавление L-Met ослабляет спектральные изменения в ДНК, как абсолютные (w2/wi), так и соответствующие нарушению двойной спирали (ГК-2 при 275 нм). Обращает внимание то, что эффективная константа скорости спектральных изменений увеличивается в присутствии больших концентраций метионина. Это соответствует имеющимся в литературе сведениям, согласно которым в тройной системе образуются преимущественно смешанные (5'-Met, iV7-G)-KOMnneKCbi (Bamham et al. 1996; Kleine et al., 2003).