Получение и биологическая характеристика мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга человека и создание на их основе костных структур
Особую актуальность в настоящее время приобрели методы клеточной биологии, которые позволяют получать культуры стволовых клеток, обладающих уникальными свойствами. В настоящее время в ведущих научно-исследовательских институтах различных странах мира изучается множество аспектов проблемы, связанной с исследованием физиологии и особенностей локализации стволовых клеток человека и животных… Читать ещё >
Содержание
- СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
- 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
- 1. 1. Открытие стволовых клеток взрослого организма
- 1. 2. Строение костного мозга человека
- 1. 3. Методы выделения ММСК костного мозга
- 1. 4. Особенности морфологии и роста ММСК in vitro
- 1. 5. Экспрессия поверхностных маркеров
- 1. 6. Направленная дифференцировка ММСК
- 1. 7. Пластичность ММСК костного мозга
- 1. 8. Иммунологические свойства ММСК
- 1. 9. Возможности клинического применения ММСК на примере трансплантации биоматриксов костной ткани
Получение и биологическая характеристика мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга человека и создание на их основе костных структур (реферат, курсовая, диплом, контрольная)
Актуальность темы
Быстрое развитие естественных наук, в частности клеточной биологии за последние годы явилось результатом разработки новых современных подходов для лечения различных приобретенных и врожденных заболеваний человека и животных.
Особую актуальность в настоящее время приобрели методы клеточной биологии, которые позволяют получать культуры стволовых клеток, обладающих уникальными свойствами. В настоящее время в ведущих научно-исследовательских институтах различных странах мира изучается множество аспектов проблемы, связанной с исследованием физиологии и особенностей локализации стволовых клеток человека и животных. Изучение физиологических особенностей, функций и локализации в организме различных типов стволовых клеток помогает понять механизмы регенерации и поддержания организма. Знание механизмов возникновения различных заболеваний человека может быть использовано в различных областях медицины и ветеринарии [116].
Согласно общепринятому определению, стволовые клетки — это особая группа недифференцированных клеток организма, обладающих способностью к самовоспроизведению и к дифференцировке в специализированные ткани, кроме того, к основным свойствам стволовых клеток можно отнести значительный пролиферативный потенциал, позволяющий им многократно делиться и сохраняться как популяция в течение, как правило, всей жизни организма. В организме взрослого человека присутствуют несколько типов стволовых клеток, среди которых выделяют популяцию мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК). В настоящее время активно изучается возможность использования этих клеток в лечение многих приобретенных и наследственных заболеваний [143, 147].
Выделение, длительное культивирование, возможность направленной дифференцировки стволовых клеток представляет собой одно из перспективных направлений в клеточной биологии, регенеративной медицине и ветеринарии, поскольку позволяет создать биологические конструкции для заместительной терапии поврежденных органов и тканей.
Достижения мировой и отечественной клеточной инженерии показали, что открывается возможность массового получения «живых» тканей и органов, что позволит на порядок увеличить темпы регенерации повреждений организма.
В связи с этим, альтернативным и перспективным подходом является использование мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга человека в качестве источника получения тканей мезодермального происхождения.
В 60-х годах 20-го века удалось выделить клетки-предшественники костной ткани, обладающих способностью самоподдержания и дифференцировки в остеогенные, хондрогенные и адипогенные типы клеток. При этом исходным материалом служили клетки костного мозга мыши [9]. В настоящее время ведутся успешные попытки использования данного типа клеток для получения всех перечисленных типов тканей с использованием биодеградируемых носителей [24, 79].
Решение поставленных вопросов зависит от дальнейшего усовершенствования методов выделения, культивирования и дифференцировки in vitro.
Таким образом, изучение ММСК человека является актуальным для применения в ветеринарной и медицинской практике.
Цель и задачи исследований. Целью наших исследований явилось получение и биологическая характеристика мультипотентных мезенхимных стромальных клеток костного мозга человека, а также создание на их основе костных структур. Для решения поставленной цели были определены следующие задачи:
1. Оптимизировать способ разделения клеток в градиенте плотности фиколла с фенотипом подобным ММСК костного мозга и охарактеризовать их.
2. Разработать условия для длительного культивирования ММСК костного мозга.
3. Изучить потенции ММСК костного мозга к дифференцировке in vitro.
4. Оптимизировать известный способ загрузки клеток в пористый кальций-фосфатный матрикс для создания ТТКТ человека in vitro и охарактеризовать их.
5. Провести доклиническое изучение полученных костных трансплантатов на экспериментальных мышах и овцах.
Научная новизна. Впервые проведен сравнительный анализ методов выделения ММСК и предложен усовершенствованный метод. Для выделения популяции ММСК определен параметр центрифугирования Равный 3000 об/мин. Разработаны оптимальные условия для длительного культивирования ММСК костного мозга человека. Впервые в России проведен широкий анализ антигенов, характеризующих ММСК.
Впервые, с учетом морфологических особенностей клеток представлены данные об оптимальном соотношении количества клеток на объем матрикса с учетом пористости носителя. Впервые показана зависимость плотности заполнения матрикса на дифференцировку клеток. На основе гистологических и иммуногистохимических методов доказано, что в результате культивирования in vitro ММСК костного мозга в матриксе в дифференцировочной среде получены трехмерные структуры костной ткани. Показано, что при эктопическом введении полученных трансплантатов в организм мышей, они не являются токсичными и не проявляют свойств туморогенности.
Впервые в России проведены предклинические испытания по влиянию полученных костных трансплантатов на организм овцы при смоделированных костных травмах.
Практическая значимость. Разработанный способ выделения ММСК костного мозга используется для получения и наращивания клеточной массы для последующей криоконсервации и длительного хранения для клинических целей (клиника «Бьюти Плаза»).
Метод получения и наращивания ММСК животных используется на кафедре иммунологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ в научно-исследовательской работе и учебном процессе.
В ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН используются биотрансплантаты костной ткани для клинического изучения.
Апробация результатов диссертации. Основные результаты диссертационной работы доложены на международном симпозиуме и европейской научно-практической конференции (Германия, 2004) — международном симпозиуме по биологии клетки в культуре (Санкт-Петербург, 2004) — Российском симпозиуме «Лазерная медицина» (Москва,.
2004) — II Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005) — на 4-ом ежегодном съезде Европейского общества по тканевой инженерии (Германия, 2005) — международной конференции «Surface — Tissue Interaction» (Швейцария,.
2005) — Всемирной конференции по тканевой инженерии, 8-ом ежегодном съезде международного общества тканевой инженерии (Китай, 2006) — 3-ем Московском международном конгрессе «Биотехнология и медицина» (Москва, 2006) — VI съезде аллергологов и иммунологов СНГ, Российском Национальном конгрессе аллергологов и иммунологов, III Российской конференции по иммунотерапии (Москва, 2006) — на XI съезде международного общества по тканевой инженерии, европейском международном симпозиуме (Нидерланды, 2006).
На защиту выносятся следующие положения и результаты: 1. Усовершенствованный метод выделения ММСК костного мозга и их характеристика.
2. Условия длительного культивирования ММСК костного мозга.
3. Зависимость дифференцировки ММСК костного мозга в трехмерных пористых структурах от концентрации клеток.
4. Доклиническое изучение полученных биоимплантов в организме иммунодефицитных животных и мелкого рогатого скота in vivo.
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 4 статьи в научных журналах, 10 статей в сборниках научных трудов.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 133 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (163 источников, из которых 13 отечественных и 150 иностранных). Работа содержит 13 таблиц, 17 рисунков, 9 страниц приложений.
4. ВЫВОДЫ.
1. Оптимизирован способ разделения клеток в градиентах плотности фиколла. Нанесение разбавленного в 4 раза в ФБС костного мозга на фиколл и осаждение высокоскоростным центрифугированием (950 g, 30 мин.) позволяет получить из костного мозга популяцию клеток с фенотипом ММСК, свободную от примеси клеток крови.
2. Показано, что ММСК костного мозга имеют фибробластоподобную морфологию, обладают высокой адгезивной и клонообразующей способностью. Клетки имеют диплоидный кариотип, который сохраняется на протяжении длительного культивирования (70 цитогенераций).
3. Установлено, что ММСК костного мозга положительно окрашивались AT к CD 44 — 99,7%, CD 54 — 69,0%, CD 71 — 86,4%, CD 73 -100,0%, CD 90 — 99,9%, CD105 — 100,0%, CD 166 — 99,9%, HLA ABC -100,0%. Они умеренно позитивны по аб интегрину (CD49d), но высоко позитивны по другим интегринам, таким как (31интегрин (CD29), а 1,2,4 интегринам (CD49a, CD49b). Клетки были отрицательны по маркерам, свойственным ранним гематопоэтическим стволовым клеткам — по сиаламуцину (CD 34), CD 133 и маркеру более поздних форм этих клетокобщему для лейкоцитов антигену (CD 45), маркеру эндотелиальным клеток CD31 — 0,1%, а также CD117 — 2,9%, HLA DR, DP, DQ. Культура клеток была отрицательной (2,2%) при окраске AT к Stro-1, экспрессия которого характерна для стромальных клеток.
4. Использование коллагена (конц. 10мг/см) в качестве матрикса и добавление в ростовую среду фактора роста фибробластов (конечная концентрация Юнг/мл) способствуют поддержанию недифференцированного фенотипа ММСК костного мозга при длительном культивировании (более 15 пассажей).
5. Установлено, что при культивировании в адипогенной среде в присутствии индукторов (инсулин, дексаметазон, IBMX), в остеогенной дексаметазон, Р-глицерофосфат, аскорбат-2-фосфат), хондрогенной (HSA, дексаметазон, аскорбат-2-фосфат, ITS, линолиевой кислоты, TGF-Pi) была показана дифференцировка в данных направления с эффективностью 30%, 90% и 70% соответственно. В реакции ОТ-ПЦР выявлена экспрессия основных маркеров остеогенеза — остеопонтина, остеокальцина, костного сиалопротеина II типа на 14 сутки культивирования в остеогенной средепосле культивирования в хондрогенной среде ранний маркер хондрогенезааггрекан, был выявлен на 2-й неделе индукции, коллаген II типа — на 3-ей неделе хондродифференцировки.
6. Выявлено влияние концентрации клеток на дифференцировку ММСК костного мозга в трехмерных носителях, представленных порообразными (размер пор 200−400 мкм) кальций-фосфатными матриксами. Загрузка клеток в концентрации 3×107 клеток на 1 см³ является оптимальной для равномерного заполнения пор матрикса и дифференцировки ММСК в направлении остеогенеза.
7. Анализ ТТКТ, имплантированных эктопически в организм 16 мышам показал, что полученные структуры не оказывают токсического влияния на организм животных и не туморогенны.
8. Предварительные данные, проведенные на поголовье из 9 овец при моделировании перелома плюсневой кости размером 3,5 и переносе полученных нами трансплантантов показали, что они влияют на активность остеогенеза и состояние белкового обмена. ТТКТ не оказывают токсического и туморогенного действия на организм овцы, а также не вызывают иммунного отторжения ТТКТ на основе ксеногенных ММСК костного мозга.
5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ИССЛЕДОВАНИЙ.
1. Разработаны и утверждены Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития (per. удостоверение №ФС-2006/266-у) методические рекомендации «Получение мезенхимальных стволовых клеток из костного мозга взрослого человека», в которых изложен метод получения ММСК КМ, приведены показания, противопоказания и материально-техническое обеспечение технологии, позволяющие рационализировать метод получения данных клеток.
2. Данный способ выделения используется для получения и наращивания клеточной массы для последующей криоконсервации и длительного хранения в клинике «Бьюти Плаза» (по лицензии Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития на применение новых клеточных технологий в здравоохранении № 77−01−343 от 11.08.2005 г.).
3. Метод получения ТТКТ на основе ММСК КМ человека и животных используется в ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН для контроля полученных биоимплантов (договор № 12/2005 от 16.09.2005 г.) и в ФГОУ ВПО МГАВМиБ для замещения костных дефектов у животных.
4. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе в ФГОУ ВПО МГАВМиБ для студентов факультета медицинской ветеринарии.
6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ.
1. Рекомендовать метод выделения ММСК КМ для выделения и наращивания необходимого количества клеток для банкирования медицинским и ветеринарным учреждениям с целью сохранения клеточного материала для дальнейшего использования.
2. Рекомендовать отработанные технологические параметры по получению ТТКТ на основе ММСК КМ для дальнейших экспериментов с целью разработки метода замещения поврежденной костной ткани для ускорения процесса регенерации у человека и животных.
3. Рекомендовать использовать в учебном процессе на базе высших учебных заведений, при изучении дисциплин «Иммунология», «Биотехнология», «Хирургия».
1.10.
Заключение
.
В настоящее время выделены различные типы стволовых клеток взрослого организма — гемопоэтические (предшественники клеток крови), нейрональные (предшественники клеток нервной ткани), мезенхимные (клетки, способные дифференцироваться в клетки тканей мезенхимного происхождения, а также других зародышевых листков), эпидермальные и др. Стволовые клетки в организме занимают определенные ниши, в которых сохраняются в течение всей жизни. Особенностью стволовых клеток взрослого организма является способность реагировать на сигналы при различных повреждениях тканей или органов, активироваться и замещать поврежденные или погибшие клетки. Однако ресурсы стволовых клеток с возрастом сокращается. Так постепенно начинаются процессы старения, как отдельных органов, так и всего организма в целом. Организм становится подверженным к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды, и, как следствие, повышается риск возникновения различного рода заболеваний.
В современной медицине и ветеринарии широко используются новые подходы в лечении различных заболеваний человека, в том числе нарушения нормального гемопоэза, повреждения покровных тканей, нарушения структуры и функций опорно-двигательного аппарата и др. Это новое направление, которое изучает вопросы восстановления/замены поврежденных тканей и органов.
Ввиду активного и подвижного образа жизни человека и животных, наиболее подверженным к повреждениям является опорно-двигательный аппарат, в частности костная ткань. Данные разработки позволяют усовершенствовать процесс восстановления тканей, тем самым резко сократить реабилитационный период после травм, а также компенсировать костные дефекты у человека и животных.
Достаточно полно изучены восстановительные процессы костной ткани после механического повреждения кости (различные типы переломов). Регенерационный остеогенез протекает в результате активации процессов, характерных для физиологической регенерации костной ткани. В образовании костного регенерата участвуют детерминированные остеогенные элементы, являющиеся потомками мультипотентных мезенхимных стромальных клеток. Существует несколько типов костных имплантов, например, остеоимпланты на основе гидроксиапатита и/или фосфата кальция в оптимальном соотношении. Пористая структура подобного остеоимпланта, облегчает врастание внутрь новосформированной кости. Однако отсутствие дополнительной индукции остеообразования ограничивает их использование для серьезных повреждений.
В настоящее время разработаны разнообразные подходы для лечения повреждений опорных тканей с применением аутои аллогенных мультипотентных мезенхимных стромальных клеток. Трансплантация аллогенных ММСК сопряжена с низкой иммунной реакцией. Низкая антигенная активность ММСК связана с отсутствием экспрессии белков комплекса гистосовместимости и наличием целого ряда иммуносупрессорных белков. В частности, для усиления эффективности.
РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА керамических имплантов, в них внедряют ММСК, и затем направляют в остеодифференцировку в условиях in vitro.
Таким образом, разработка биоимплантов костной ткани на основе мультипотентных мезенхимных стромальных клеток в сочетании с подходящим бионосителем является перспективным направлением в современной медицине и ветеринарии. г.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Материалы и методы исследований.
Работа выполнена в период с 2003 по 2007 год на кафедре иммунологии и кафедре хирургии ФГОУ ВПО МГАВМиБ и лаборатории тканевой инженерии ООО «Институт стволовой клетки», ГУ РОНЦ им. Н. И. Блохина РАМН и ИБХ им. Ю. А. Овчинникова и М. М. Шемякина РАН.
2.1.1. Культуральная посуда.
Для сбора костного мозга человека использовали одноразовые пробирки с напылением из LiHe, объемом 9 мл, изготовленных фирмой Sarshtatd, Германия. Выделение ММСК костного мозга, центрифугирование клеточных суспензий проводили в стерильных центрифужных пробирках объемом 15 и 50 мл фирмы Corning-Costar, США.
Культивирование ММСК костного мозга осуществляли в пластиковых вентилированных флаконах площадью 75 см и 150 см, 6-ти и 24-х луночных планшетах, чашках Петри 60 мм и 100 мм, Corning-Costar, США.
Криоконсервирование МСК из костного мозга человека производили в в пластиковых криопробирках объемом 2мл фирмы Corning-Costar, США.
Для различных манипуляций с клетками и приготовления растворов и сред использовали пастеровские пипетки объемом 5, 10, 25 и 50мл Costar-Corning, США.
Все расходные материалы одноразового использования.
2.1.2. Приборы и оборудование.
Манипуляции с клетками производили в ламинарных боксах II класс защиты подающих вертикальный стерильный поток воздуха, производства фирмы HetoHolten, Дания. Бокс оборудовали сенсорной установкой подачи газа Integra Biosciences, СШАавтоматическими дозаторами жидкости.
Eppendorf, Германия. Культивирование клеток проводили в инкубаторе Sanyo, Япония, обеспечивающим влажность воздуха, температурный режим (+37°С) и содержание СО2 (5%) в воздухе. Центрифугирование клеточных суспензий осуществляли в центрифуге Eppendorf, Германия. Все растворы, среды, реактивы хранили при оптимальной температуре в холодильнике Sanyo, Япония. Микроскопирование культур клеток производили под инвертированным микроскопом Olympus, Германия. Просмотр и микрофотографирование нативных и окрашенных препаратов осуществляли на инвертированном микроскопе с флуоресцентной насадкой и подогреваемым предметным столиком Leica, Германия, оборудованном цифровой фотокамерой Leica, Германия. Взвешивание реагентов производили на электронных весах Mettler Toledo, Германия. Все работы с вредными веществами проводились в вытяжном шкафу Labconco, США. Для получения дистиллированной, сверхчистой деионизированной и апирогенной воды применяли установку MilliPore, Германия. Растворы стерилизовали путем пропускания их через фильтры фирмы Corning-Costar, США, с диаметром пор 0,22 мкм с использованием перистальтического насоса Millipore, Германия.
Кратковременное хранение ММСК костного мозга осуществляли в низкотемпературном холодильнике New Brunswick, Англия. С целью длительного хранения использовали сосуд Дюара с жидким азотом New Brunswick, Англия.
Анализ поверхностных клеточных маркеров проводили на лазерном проточном цитофлуориметре Cytomics® FC500 (Beckman Coulter, США), оборудованном аргоновым лазером CYONICS (Uniphase, США) с длинной волны возбуждения 488 нм и мощностью луча 15 мВт. Распределение ДНК по фазам клеточного цикла и количество клеток находящихся в состоянии спонтанного апоптоза определяли по распределению клеток, окрашенных иодитом пропидия, в логарифмическом канале флуоресценции с использованием барьерных фильтров 488ВК, 488ВР и 625ВР. Для удаления из анализа агрегатов клеток в программу вводили логические ограничения.
Полученные гистограммы подвергали математической обработке с использованием программ СХР v. 2.1 (Beckman-Coulter, США) и MultiCycIe (Phoenix Flow Systems, США).
Гистологический анализ, полученных образцов костной ткани проводили с помощью установки для проводки и парафинизации гистологических образцов Leica, Германия, установки для депарафинизации и автоматической покраски гистологических срезов Leica, Германия, программируемого микротома Leica, Германия.
2.1.3. Специальные среды и растворы.
ММСК костного мозга культивировали в жидкой среде DMEM-LG (среда Игла в модификации Дюльбекко), с низким содержанием глюкозы (1 г/л) (Gibco, США), дополненной 10%-ми сыворотки плода коров (СПКfetal bovine serum, FBS) (HyClone Perbio, Бельгия), однократным раствором незаменимых аминокислот (Gibco, США) и антибиотиками (Gibco, США). Конечная концентрация стрептомицина была 100 мкг/мл, а пенициллина 100 Ед./мл.
Фосфатно-солевой буфер Дюльбекко без ионов Са2+ и Mg2+ (ФБСDulbecco's Phosphate Buffered Saline, DPBSGibco, США) использовали для разбавления полученного костного мозга, для промывки клеточных культур перед трипсинизацией, а также для промывания культур клеток при окрашивании их антителами.
Перед посевом, после выделения, клетки помещали в буфер, лизирующий эритроциты (155 mM NH4C1,10 mM КНСОз, 0, lmM Na2EDTA).
Для криоконсервации ММСК из костного мозга человека в качестве криопротектора использовали диметилсульфоксид (DMSO, Sigma, США). В состав криозащитной среды входили: 10% DMSO, 20% FBS, 70% DMEM-LG.
Для направленной дифференцировки in vitro использовались следующие добавки к основной питательной среде: дексаметазон (KRKA, Slovenia), аскорбат-2-фосфат, аскорбиновая кислота, р-глицерофосфат (Sigma, USA), TGF-pi (Transforming Growth Factor — betal) (BD Bioscience, Germany), ITS (lg/L инсулина, 0,67 mg/L селена, 0,55g/L трансферрина) (Gibco, USA), линолиевая кислота (Sigma, USA), HSA (Биомед, Россия), IGF-1 (Insulin-like Growth Factor -1) (BD Bioscience, Germany).
Окраска на специфические антитела проводилась с использованием коммерческого набора DAB-kit (Chemicon, США). 1% раствор параформальдегида (Sigma, USA) в 0.85% NaCl (Baxter, Germany).
Для получения трехмерных трансплантатов костной ткани в качестве матрикса использовали 3D Са-Р Scaffold (BD Bioscience, Germany) и Skelite (Millenium Biologix Inc., Канада) и ММСК костного мозга человека.
При анализе поверхностных маркеров ММСК использовали следующие антитела: mouse anti-human CD10, 13, 25, 29, 31, 34, 44, 45, 49а, 49b, 49d, 49f, 54, 71, 73, 90, 105, 106, 117, 120a, 124, 166, HLA-ABC, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR-II, goat anti-mouse FITC-conjugated (BD Bioscience, Germany), а также CD133, STRO-1 (Chemicon, USA), IB 10 (Sigma, Germany).
При анализе дифференцированных клеток использовали следующие антитела: остеопонтин, остеокальцин (R&D, США), коллаген I и X типов, аггрекан (Chemicon, США).
2.1.4. Методы исследований Выделение ММСК костного мозга человека.
Костный мозг 20 здоровых доноров был получен в клинике «Бьюти Плаза», методом пунктирования гребня подвздошной кости. ММСК КМ получали методом центрифугирования в градиенте плотности фиколла в течение 30 мин., с последующими промывками в ФБС и лизированием в специальном буфере. Полученную популяцию клеток переносили в культуральный матрас из расчета 1 млн. клеток на 1 см².
Длительное культивирование клеток проводили путем периодического пассирования. Снятие клеток с субстрата осуществлялось с помощью 0,05%-ного раствора трипсина-ЭДТА в течение 5−6 мин. (Gibco, США) по мере формирования полного монослоя.
Тест на жизнеспособность проводили после ферментативного снятия клеток с культурального флакона. Клетки суспендировали в физиологическом растворе, помещали в ч. Петри для окраски, добавляли эквивалентный объем 4% раствора трипанового синего, время экспозиции 5 минут. 10 мкл полученной клеточной суспензии после окраски переносили в камеру Горяева и производили оценку сразу после ферментативной обработки клеток. В пяти больших квадратах камеры подсчитывали количество окрашенных (погибших) клеток путем прямого микроскопического наблюдения. Процент жизнеспособности клеток в суспензии определяли по стандартной формуле: п (кол-во окраш. клеток в 5-ти кв.) витальность (%) =-х 100%.
N (общее кол-во клеток в 5-ти кв.).
Морфологические особенности ММСК костного мозга в культуре.
Характеристику ММСК проводили визуально, с помощью фазово-контрастной микроскопии на инвертированном микроскопе Leica DMIRB. В качестве основных критериев использовали размер и форму клеток, ядерно-цитоплазматическое соотношение, гомогенность цитоплазмы и наличие ядрышек в ядре.
Митотический индекс (интенсивность митотического размножения клеток в культуре, МИ) для каждой популяции клеток рассчитывали в фазе логарифмического роста как соотношение числа митозов к общему количеству подсчитанных клеток (не менее 1000), умноженное на 1000 (в %о).
МИ=(количество митозов/общее количество клеток) ¦ 100%о.
Время генерации (удвоения), интервал между следующими друг за другом делениями клеток проводили путем подсчета количества клеток в десяти выбранных и отмеченных квадратах (2×2 мм) культуральной чашки через 18, 24, 36, 48 и 60 часов. Время удвоения было рассчитано относительно первой точки подсчета (18 часов). л.
Через 7 дней после посева клеток (500 клеток/см) проводился анализ на клоногенность. Клетки фиксировали и окрашивали по Гимза. Образование колоний ММСК оценивали с помощью микроскопа.
Анализ ММСК костного мозга в динамике культивирования in vitro.
Изучение клеточных популяций проводили путем анализа клеток в фазе логарифмического роста, окрашенных иодитом пропидия, по пяти клеточным культурам.
Клетки фиксировали 70%-м этанолом, промывали в ФБС и ресуспендировали в ФБС с добавлением 40 мкг/мл иодита пропидия (Calbiochem, США), инкубировали 1 час и анализировали методом проточной цитометрии.
Для кариологического анализа клеток раннего и позднего пассажей к клеткам на стадии логарифмического роста добавляли раствор колхицина (0.1 мг/мл) в стерильной дистиллированной воде и инкубировали 2ч. Затем клетки промывали DMEM-LG и снимали 0,05% раствора трипсина, промывали и растворяли в 0,56% раствора КС1 и инкубировали 15 минут. Затем клетки отмывали и фиксировали в метаноле: ледяной уксусной кислоте = 3:1, отмывали и снова фиксировали клетки течение 30 минут. 60−70мкл клеточной суспензии наносили по каплям на влажное холодное стекло, поджигали в пламени горелки, затем досушивали в верхней части пламени. Для окраски для G-бэндинга на стекло наносили 0.25% раствор трипсина, выдерживали 30 секунд, промывали дистиллированной водой и окрашивали по Гимза.
Кариологический анализ препаратов выполнен совместно с лабораторией общей цитогенетики МГНЦ РАМН.
Подбор условий для длительного культивирования ММСК костного мозга.
Начиная с 1 -го пассажа, анализировалось влияние подложек, ростовых факторов и их сочетаний, при добавлении в среду для культивирования на морфологию и длительность культивирования ММСК из костного мозга человека. Для этого проводился эксперимент по схеме представленной в таблице 2.
Список литературы
- Баринов С.М. Биокерамика на основе фосфатов кальция / С. М. Баринов, B.C. Комлев. М.: Наука. — 2005. — С. 98−180.
- Дерхо М.А. Особенности реакции красной крови при травмах трубчатых костей / М. А. Дерхо, С. Ю. Концевая // Ветеринарная клиника. -2004.-№ 1.-С. 18−20.
- Дерхо М.А. Некоторые стороны фосфорно-кальциевого обмена у собак на разных стадиях остеогенеза / М. А. Дерхо, С. Ю. Концевая // Ветеринарная клиника. 2004. — № 4. — С. 18−20.
- Кавалерский Г. М. Травматология и ортопедия / Г. М. Кавалерский, JI.JI. Силин, А. В. Гаркави и др. М.: Академия. — 2005. — 624 с.
- Кузнецов C.JI. Гистология, цитология и эмбриология / C.JI. Кузнецов, Н. Н. Мушкамбаров // М.: МИА. 2003. — 544 с.
- Покровский А.А. Биохимические методы исследования в клинике / А. А. Покровский. М: Наука. — 1969. — 200 с.
- Тепляшин А.С. Характеристика мезенхимальных стволовых клеток человека, выделенных из костного мозга и жировой ткани /А.С. Тепляшин, С. В. Коржикова, С. З. Шарифуллина, Н. Н. Чупикова и др. //Цитология. 2005. -Т. 47.-№ 2.-С. 130−135.
- Фриденштейн А.Я. Клетки-предшественники для остеогенной и кроветворной тканей. Анализ гетеротопных трансплантатов косного мозга / А. Я. Фриденштейн, К. В. Петракова, А. И. Куралесова, Г. П. Фролова // Цитология. 1968. — № 5. с. 557−567.
- Фриденштейн А .Я. Остеогенные клетки-предшественники костного мозга радиохимер. Анализ методом гетеротопной трансплантации / А .Я. Фриденштейн, А. И. Куралесова // Онтогенез. 1971. — № 2(5). — С. 458−465.
- Фриденштейн А.Я. Индукция костной ткани и остеогенные клетки-предшественники / А. Я. Фриденштейн, К. С. Лалыкина // М.: Медицина. -1973.
- Чайлахян Р.К. Клонообразование в монослойных культурах костного мозга / Р. К. Чайлахян, А. Я. Фриденштейн, А. В. Васильев // Бюлл. эксп. биол. мед.- 1970.-№ 2.-С. 94−96.
- Чайлахян Р.К. Перенос костномозгового микроокружения клонами стромальных механоцитов / Р. К. Чайлахян, Ю. В. Герасимов, А. Я. Фриденштейн // Бюлл. эксп. биол. мед. 1978. — № 2. — С. 705−707.
- Arinzeh T.L. Allogeneic mesenchymal stem cells regenerate bone in a critical-sized canine segmental defect / T.L. Arinzeh, S.J. Peter, M.P. Archambault et al. // J Bone Joint Surg Am. 2003. — № 85 (10). — P. 1927−1935.
- Arinzeh T.L. A comparative study of biphasic calcium phosphate ceramics for human mesenchymal stem-cell-induced bone formation / T.L. Arinzeh, T. Tran, J. McAlary et al. // Biomaterials. 2005. — № 26 (17). — P. 3631−3638.
- Aust L. Yield of human adipose-derived adult stem cells from liposuction aspirates / L. Aust, B. Delvin, S. Foster et al. // Cytotherapy. 2004. — № 6. — P. 714.
- Awad H.A. Autologous mesenchymal stem cell-mediated repair of tendon / H.A. Awad, D.L. Butler, G.P. Boivin et al. // Tissue Eng. 1999. — № 5. — P. 267 277.
- Badylak S.F. The extracellular matrix as ascaffold for tissue reconstruction / S.F. Badylak // Cell&Developmental Biology. 2002. — № 13. — P. 377−383.
- Bartholomew A. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo / A. Bartholomew, C. Sturgeon, M. Siatskas et al. // Exp Hematol. 2002. — № 30. — P. 42−48.
- Bianchi G. Ex vivo enrichment of mesenchymal cell progenitors by fibroblast growth factor 2 / G. Bianchi, A. Banfi, M. Mastrogiacomo et al. // Exp cell res. 2003. — № 287. — P. 98−105.
- Bianco P. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications / P. Bianco, M. Riminucci, S. Gronthos et al. // Stem Cells. 2001. -№ 19.-P. 180−192.
- Bjornson C.R. Turning brain into blood: a hematopoietic fate adopted by adult neural stem cells in vivo / C.R. Bjornson, R.L. Rietze, B.A. Reynolds et al. // Science. 1999. — № 283. — P. 534−537.
- Bruder S.P. Bone regeneration by implantation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells / S.P. Bruder, A.A. Kurth, M. Shea et al. // J Orthop Res. 1998. — № 16 (2).-P. 155−162.
- Cancedda R. Tissue engineering and cell therapy of cartilage and bone / R. Cancedda, B. Dozin, P. Giannoni et al. // Matrix Biology. 2003. — № 22. — P. 8191.
- Cancedda R. Cell therapy for bone deseasera rewiew of current status / R. Cancedda, G. Bianchi, R. Quarto // Stem cells. 2003. — № 21. — P. 610−619.
- Castro-Malaspina H. Characterization of human bone marrow fibroblast colony-forming cells (CFU-F) and their progeny / H. Castro-Malaspina, R.E. Gay, G. Resnick et al. // Blood. 1980. — № 56. — P. 289−301.
- Castro-Malaspina H. Human bone marrow fibroblast colony-forming units (CFU-F) / H. Castro-Malaspina, W. Ebell, S. Wang // Prog Clin. Biol. Res. 1984. — № 154. — P. 209−236.
- Chamberlain J.R. Gene targeting in stem cells from individuals with osteogenesis imperfecta / J.R. Chamberlain, U. Schwarze, P.R. Wang et al. // Science. 2004. — № 303. — P. 1198−1201.
- Chaudhary L.R. Differential growth factor control of bone formation through osteoprogenitor differentiation / L.R. Chaudhary, A.M. Hofmeister, K.A. Hruska // Bone. 2004. — № 34. — P. 402−411.
- Clarce D. Differentiation potential of adult stem cells / D. Clarce, J. Frisen // Current Opin. In Genet. And Develop. 2001. — № 11. — P. 575−580.
- Collotta F. Rapid killing of actinomycin D-treated tumor cells by human mononuclear cells. Effectors belong to the monocyte-macrophage lineage / F. Colotta, G. Peri, A. Villa et al. //.J Immunol. 1984. — № 132(2). — P. 936−44.
- Colter D.C. Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow / D.C. Colter, R. Class, C.M. DiGirolamo et al. // PNAS. 2000. — № 97. — P. 3213−3218.
- Colter D.C. Identification of subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells / D.C. Colter, I. Sekiya, D.J. Proctop // PNAS. 2001. — № 98. — P.7841−7845.
- Conget P. A. Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells / P.A. Conget, J.J. Minguell // J. Cell Physiol. -1999.-№ 181.-P. 67−73.
- Cousin B. Reconstitution of lethally irradiated mice by cells isolated from adipose tissue / B. Cousin, M. Andre, E. Arnaud et al. // Biochemical and Biophysical Research Communications. -2003. № 301. — P. 1016−1022.
- Danet G.H. Dissociation between stem cell phenotype and NOD/SCID repopulating activity in human peripheral blood CD34(+) cells after ex vivo expansion / G.H. Danet, H.W. Lee, J.L. Luongo et al. // Exp Hematol. 2001. — № 29(12).-P. 1465−1473.
- Deans R.J. Mesenchymal stem cells: Biology and potential clinical uses / R.J. Deans, A.B. Moseley // Exp. Hematology. 2000. — № 28. — P. 875−884.
- Dejbakhsh-Jones S. Extrathymic maturation of alpha beta T cells from hemopoietic stem cells / S. Dejbakhsh-Jones, Jerabek L., I.L. Weissman et al. // J Immunol. 1995. — № 155. — P. 3338−3344.
- Dennis J. A quadripotential mesenchymal progenitor cell isolated from the marrow of am adult mouse / J. Dennis, A. Merriam, A. Awadallah et al. // J bone miner res. 1999. — № 14. — P. 700−709.
- De Ugarte D.A. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow / D.A. De Ugarte, Z.C. Alfonso, P.A. Zuk et al.// Imm. letters. 2003. — № 89. — P. 267−270.
- De Ugarte D.A. Comparison of multi-lineage cells from human adipose tissue and bone marrow / D.A. De Ugarte, K. Morizono, A. Elbarbary et al. // Cells Tissues Organs. 2003. — № 174. — P. 101−109.
- Devine S. M. Mesenchymal stem cells distribute to a wide range of tissues following systemic infusion into nonhuman primates / S.M. Devine, C. Cobbs, M. Jennings et al. // Blood. 2003. — № 101 (8). — P. 2999−3001.
- Di Nicola M. Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli / M. Di Nicola C. Carlo-Stella, M. Magni et al.// Blood. 2002. — № 99. — P. 3838−3843.
- Djouad F. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells favors tumor growth in allogeneic animals / F. Djouad, P. Plence, C. Bony et al. // Blood. 2003. — № 102. — P. 3837−3844.
- Ferrari G. Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors / G. Ferrari, G. Cussella-De Angelis, M. Coletta et al. // Science. -1998.-№ 279.-P. 1528−1530.
- Ferari S.L. A role for N-cadherin in the development of the differetiared osteoblastic phenotype / S.L. Ferari, K. Traianedes, M. Thorne // J bone miner res / 2000.-№ 15.-P. 198−208.
- Fridenshtein A.J. Precursors for fibroblasts in different populations of hematopoietic cells as detected by the in vitro colony assay method / A.J. Fridenshtein, U.F. Deriglazova, N.N. Kulagina et al. // Exp. Hematol. 1974. — № 2.- P. 83−92.
- Friedenstein A.J. Radiosensitivity and postirradiation changes of bone marrow clonogenic stromal mechanocytes / A.J. Friedenstein, N.V. Latzinik, Y.F. Gorskaya et al. // International Radiobiol. 1981. — № 3(5). — P. 537−546.
- Fridenstein A.J. Marrow microenviroment transfer by geterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges / A.J. Fridenstein, N.W. Latzinik, A.G. Grosheva et al. // Exp. Hematol. 1982. — № 10. -P. 217−227.
- Friedenstein A.J. Osteogenic stem cells in bone marrow / A.J. Friedenstein, J.N.M. Heersche, J.A. Kanis // Bone and mineral research. 1990. — № 24. — P. 32 -37.
- Friedenstein A.J. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs / A.J. Friedenstein, U. Gorskaja, N.N. Kulagina // Exp. Hematol. 1976. — № 4. — P. 267−274.
- Gao J. Tissue-engeneered fabrication of an osteochondral composite graft using rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells / J. Gao, J.E. Dennis, L.A. Solchaga // Tissue Eng. 2001. — № 7 (4). — P. 363−367.
- Grinnemo K. Xenoreactivity and engraftment of human mesenchymal stem cells transplanted into infarcted rat myocardium / K. Grinnemo, A. Mansson, G. Dellgren et al. // J Thorac Cardiovasc Surg. 2004. — № 127. — P. 1293−1300.
- Gronthos S. The STRO-1+ fraction of adult human bone marrow contains the osteogenic precursors / S. Gronthos, S.E. Graves, S. Ohta et al. // Blood. -1994.-№ 84.-P. 4164−4173.
- Gronthos S. Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells / S. Gronthos, D.M. Franklin, H.A. Leddy et al. // J. Cell Physiol. 2001. — № 189. — P. 54−63.
- Gronthos S. Integrin-mediated Interactions Between Human Bone Marrow Stromal Precursor Cells and the Extracellular Matrix / S. Gronthos, P.J. Simmons, S.E. Graves et al. // Bone. 2001. — № 28 (2). — P. 174−181.
- Gronthos S. Molecular and cellular characterisation of highly purified stromal stem cells derived from human bone marrow / S. Gronthos, A.C. Zannettino, S.J. Hay et al. // J. Cell Sci.- 2003. № 116. — P. 827−1835.
- Grundel, R. E. Autogeneic bone marrow and porous biphasic calcium phosphate ceramic for segmental bone defects in the canine ulna / R. E. Grundel, M. W. Chapman, T. Yee et al. // Clin. Orthop. Rel. Res. 1991. — № 266. — P. 244 258.
- Gumbiner B.M. Cell adhesion: the molecular basis of tissue architecture and morphogenesis / B.M. Gumbiner // Cell. 1996. — № 84. — P. 345−357.
- Harada S. Control of osteoblast function and regulation of bone mass / S. Harada, G.A. Rodan //Nature. 2003. — № 423. — P. 349−355.
- Haynesworth S.E. Cell surface antigens on human marrow-derived mesenchymal cells are detected by monoclonal antibodies / S.E. Haynesworth, M.A. Baber, A.I. Caplan // Bone. 1992. — № 13. — P. 69−80.
- Heynesworth S.E. Characterization of cells with osteogenic potential from the human bone marrow / S.E. Heynesworth, J. Goshima, V. M. Goldberg et al. // Bone. 1995,-№ 13.-P. 81−95.
- Horwitz E.M. Clarification of the nomenclature for MSC: the International Society for Cellular Therapy position statement / E.M. Horwitz, K. Le Blanc, M. Dominici et al. // Cytotherapy. 2005. — № 7 (5). — P. 393−395.
- Hughes F.J. Effects of growth factors and cytokines on osteoblast differentiation / F.J. Hughes, W. Turner, G. Belibasakis et al. // Periodontology 2000. 2006. — № 41. — P. 48−72.
- Hung S.-C. Isolation and characterization of size-sieved stem cells from human bone marrow / S.-C. Hung, N.-J. Chen, S.-L. Hsieh et al. //Stem Cells.2002.-№ 20.-P. 249−258.
- Ianus A. In vivo derivation of glucose-competent pancreatic endocrine cells from bone marrow without evidence of cell fusion / A. Ianus, G.G. Holz, N.D. Theise et al. // J. Clin. Invest. 2003. — № 111 (6). — P. 843−850.
- Ishikawa F. Transplanted human cord blood cells give rise to hepatocytes in engrafted mice / F. Ishikawa, C. J. Drake, S. Yang et al. // Ann. N. Y. Acad. Sci.2003.-№ 996.-P. 174−185.
- Jiang Y. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow / Jiang Y., Jahagirdar B.N., Reinhardt R.L. et al. // Nature. 2002. — № 418. -P. 41−49.
- Jorgensen С. Engineering mesenchymal stem cells for immunotherapy / C. Jorgensen, F. Djouad, F. Apparailly et al. // Gene Therapy. 2003. — № 10. — P. 928−931.
- Kadiyala S. Culture expandedcanine mesenchymal stem cells possess osteochondrogenic potential in vivo and in vitro / S. Kadiyala, R. Young, M. Thiede et al. // Cell transplant. 1997. — № 6. — P. 125−134.
- Kahn A. Age-related bone loss: A hypothesis and initial assessment in mice / A. Kahn, R. Gibbons, S. Perkins // Clin. Orthop. Rel. Res. 1995. — № 313. — P. 69−75.
- Kan I. Integral Therapeutic Potential of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells / I. Kan, E. Melamed, D. Offen // Current Drug Targets. 2005. — № 6. — P. 31−41.
- Kassem M. Mesenchymal stem cells: biological characteristics and potential clinical applications / M. Kassem // Cloning Stem Cells. 2004. — № 6(4). — P. 369−374.
- Katz A.J. Cell surface and transcriptional characterization of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells / A.J. Katz, A. Tholpady, S.S. Tholpady et al. // Stem Cells. 2005. — № 23. — P. 412−423.
- Klees R.F. Laminin-5 induces osteogenic gene expression in human mesenchymal stem cells through an ERC-dependent pathway / Klees R.F., Salasznyk R.M., Kingsley K. et al. // Mol biol cell. 2005. — № 16. — P. 881−890.
- Коп E. Autologous bone marrow stromal cells loaded onto porous hydroxyapatite ceramic accelerate bone repair in critical-size defects of sheep long bones / E. Kon, A. Muraglia, A. Corsi et al. // J Biomed Mater Res. 2000. — № 49(3).-P. 328−337.
- Kopen G.C. Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiateinto astrocytes after injection into neonatal mouse brains / G.C. Kopen, D.J. Prockop, D.G. Phinney // PNAS. 1999. — № 96. -P. 10 711−10 716.
- Korbling M. Adult stem cells for tissue repair a new therapeutic concept / M. Korbling, Z. Estrov // N. Engl. J. Med. — 2003. — № 349 (6). — P. 570−582.
- Krampera M. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide / M. Krampera, S. Glennie, J. Dyson et al. // Blood. 2003. — № 101. — P. 3722−3729.
- Kuznetsov S.A. Single-colony derived strains of human marrow stromal fibroblasts form bone after transplantation in vivo / S.A. Kuznetsov, P.H. Krebsbach, K.J. Satomura et al. / Bone Miner. Res. 1997. — № 12. — P. 1335−1347.
- Lane J.M. Orthopedic application of BMP-2 in fracture healing / J.M. Lane, A. Yasko, E. Tomin // Bone Morphogenic Proteins. 1994. — № 5. — 8−11.
- Lange C. High-potential of human mesenchymal stem cells / Lange C., Schroeder J., Lioznov M.V.et al. // Stem Cells And Development. 2005. — № 14. -P. 70−80.
- Laurencin C.T. Tissue Engineering: Orthopedic Application / C.T. Laurencin, A.M.A. Ambrosio, M.D. Borden et al. // Annu. Rev. Biomed. Eng. -1999.-№ l.-P. 19−46.
- Le Blanc K. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells / K. Le Blanc, C. Tammik, K. Rosendahl et al. // Exp Hematol. 2003. — № 31. — P. 890−896.
- Le Blanc K. Mesenchymal stem cells inhibit the expression of CD25 (interleukin-2 receptor) and CD38 on phytohaemagglutinin-activated lymphocytes
- К. Le Blanc, I. Rasmusson, C. Gotherstrom et al. // Scand J Immunol. 2004. -№ 60.-P. 307−315.
- Le Blanc K. Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells / K. Le Blanc, I. Rasmusson, B. Sundberg et al. // Lancet. 2004. — № 363. — P. 1439−1441.
- LeBoy P. S. Dexamethasone induction of osteoblast mRNAs in rat marrow stromal cell cultures / P. S. LeBoy, J. Beresford, С.J. Devlin et al. // Cell Physiol. -1991.-№ 146.-P. 370−378.
- Lendeckel S. Autologous stem cells (adipose) and fibrin glue used to treat widespread traumatic calvarial defects: case report / S. Lendeckel, A. Jodicke, P.J. Christophis et al. // Craniomaxillofac. Surg. 2004. — № 32. — P. 370−373.
- Liechty K. Human mesenchymal stem cells engraft and demonstrate site-specific differentiation after in utero transplantation in sheep / K. Liechty, T.C. MacKenzie, A.F. Shaaban et al. //Nat Med. 2000. — № 11. — P. 1282−1286.
- Lucas P.A. Isolation of putative mesenchymal stem cells from embryonic and adult skeletal muscle / P.A. Lucas, A.F. Calcutt, D.J. Mulvaney et al. // In Vitro Cell Biol. 1992. — № 28. — P. 154−156.
- Majumdar M.K. Isolation, characterization, and chondrogenic potential of human bone marrow-derived multipotential stromal cells / M.K. Majumdar, V. Banks, D.P. Peluso //J. Cell. Physiol. 2000. — № 185. — P. 98−106.
- Mastrogiacomo M. Tissue engineering of bone: search for a better scaffold / M Mastrogiacomo, A. Muraglia, V. Komlev et al. // Orthod Craniofacial Res. 2005. — № 8. — P. 277−284.
- Maximov A.A. Der Lymphozyt als gemeinsame Stammcelle der verchidenen Blutelemente in der embrionalen Entwicklung und im postfetalen Leben den Slugetiere. 1909.
- Meisel R. Human bone marrow stromal cells inhibit allogeneic T-cell responses by indoleamine 2,3-dioxygenase-mediated tryptophan degradation / R. Meisel, A. Zibert, M. Laryea et al. // Blood. 2004. -№ 103. — P. 4619−4621.
- Muller-Sieburg C.E. The stromal cells' guide to the stem cells universe / C.E. Muller-Sieburg, E. Derugina // Stem cells. 1995. — № 13(5). — P. 477−486.
- Minguell J. Mesenchymal stem cells / J. Minguell, A. Erices, P. Conget // Exp Biol Med. 2001. — № 226 (6). — P. 507−520.
- Muraglia A. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model / A. Muraglia, R. Cancedda, R. Quarto //J Cell Sci. 2000. — № 113. — P. 1161−1166.
- Niemeyer P. Allogenic transplantation of human mesenchymal stem cells for tissue engineering purposes: an in vitro study / P. Niemeyer, A. Seckinger, H.G. Simank et al. // Orthopade. 2004. — № 33 (12). — P. 1346−1353.
- Newsome P. N. Human cord blood-derived cells can differentiate into hepatocytes in yhe mouse liver with no evidence of cell fusion / P.N. Newsome, I. Johannessen, S. Boyle et al. // Gastroenterology. 2003. — № 124 (7). — P. 18 911 900.
- Ohgushi H. Stem cell technology and bioceramics: from cell to gene engineering / H. Ohgushi, A.I. Caplan // J. Biomed. Mater.Res. 1999. — № 48. -P. 913−927.
- Olsen B.R. Bone development / B.R. Olsen, A.M. Reginato, W. Wang // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2000. — № 16. — P. 191−220.
- Owen M. Marrow stromal stem cells / M. Owen // J Cell Sci. 1988. -№ 10.-P. 63−76.
- Pereira R.F. Cultured adherent cells from bone marrow can serve as long-lasting precursor cells for bone, cartilage, and lung in irradiated mice / R.F. Pereira, K.W. Halford, M.D. O’Hara et al. // PNAS. 1995. — № 92. — P. 48 574 861.
- Pereira R. F. Marrow stromal cells as a source of progenitor cells for nonhematopoietic tissues in transgenic mice with a phenotype of osteogenesisimperfecta / R.F. Pereira, M.D. O’Hara, A.V. Laptev et al. // PNAS. 1998. — № 95.-P. 1142−1147.
- Petite H. Tissue-engineered bone regeneration / H. Petite, V. Viateau, W. Bensaid et al. // Nat. Biotechnol. 2000. — № 18. — P. 959−963.
- Phinney D.G. Donor variation in the growth properties and osteogenic potential of human marrow stromal cells / D.G. Phinney, G. Kopen, W. Righter // J. Cell. Biochemistry. 1999. — № 75. — P. 424−436.
- Pittenger M.F. Multilineage Potential of adult human mesenchymal stem cells / M.F. Pittenger, A.M. Mackay, S.C. Beck // Science. 1999. — № 284(2). — P. 143−147.
- Presnell S.C. Stem cells in adult tissues / S.C. Presnell, B. Petersen, Heidaran M. // Cell and developmental biology. 2002. — № 13. — P. 369−376.
- Prockop D. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues / D. Prockop // Science. 1997. — № 276. — P. 71−74.
- Qi H. Identification of genes responsible for osteoblast differentiation from human mesodermal progenitor cells / H. Qi, D. Aguiar, S. Williams et al. // PNAS. 2003. — № 100. — P. 3305−3310.
- Quarto R. Bone progenitor cell deficits and the age-associated decline in bone repair capacity / R. Quarto, D. Thomas, T. Liang // Calcif. Tissue Int. -1995.-№ 56.-P. 123−129.
- Quirici N. Isolation of bone marrow mesenchymal stem cells by anti-nerve growth factor receptor antibodies / N. Quirici, D. Soligo, P. Bossolasco // Exp Hematol. -2002. № 30. — P. 783−791.
- Rasmusson I. Mesenchymal stem cells inhibit the formation of cytotoxic T lymphocytes, but not activated cytotoxic T lymphocytes or natural killer cells / I. Rasmusson, O. Ringden, B. Sundberg et al. // Transplantation. -2003.-№ 76.-P. 1208−1213.
- Reyes M. Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells / M. Reyes, T. Lund, T. Lenvik et al. // Blood. 2001. — № 98. — P.2615−2625.
- Reyes M. Turning marrow into brain: generation of glial and neuronal cells from adult bone marrow mesenchymal stem cells / M. Reyes, C.M. Verfaillie // Blood. 1999. — № 94 (10). — P.377.
- Reyes M. Characterization of multipotent adult progenitor cells, a subpopulation of mesenchymal stem cells / M. Reyes, C.M. Verfaillie // Ann. N. Y. Acad. Sci. -2001. № 938. — P. 231−233.
- Roelen B.A. Controlling mesenchymal stem cell differentiation by TGFbeta family members / B.A. Roelen, P. Dijke // J Orthop. Sci. 2003. — № 8. -P. 740−748.
- Saito T. Xenotransplant cardiac chimera: immune tolerance of adult stem cells / T. Saito, J.Q. Kuang, B. Bittira et al. // Ann. Thorac Surg. 2002. — № 74. — P. 19−24.
- Sandhu J. S. Human hematopoiesis in SCID mice implanted with human adult cancellous bone / J.S. Sandhu, B.R. Clark, E.L. Boynton et al. // Blood. 1996. — № 88. — P. 1973−1982.
- Schridde H. Die Entwickelungsgeschichte des menschlichen Speisrwhnenepitheles und ihre Bedeutung fur die Metaplaselehre / H. Schridde // Weis.: Verlag von J. F Bergmann- 1907.
- Schwartz R. E. Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocyte-like cells / R.E. Schwartz, M. Reyes, L. Koodie et al. // JCI. 2002. — № 109 (10). — P. 1291−1302.
- Sekiya I. Expansion of human adult stem cells from bone marrow stroma: conditions that maximize the yields of early progenitors and evaluate their quality /1. Sekiya, B.L. Larson, J.R. Smith et al. // Stem cells. 2002. — № 20. — P. 530−541.
- Sharma B. Engineering Structurally Organized Cartilage and Bone Tissues / B. Sharma, J.H. Elisseeff // Annals of Biomedical Engineering. 2004. -№ 32(1).-P. 148−159.
- Short B. Mesenchymal stem cells / B. Short, N. Brouard, T. Occhiodoro-Scott et al. // Arch Med Res. 2003. — № 34(6). — P. 565−571.
- Simmons P.J. Identification of stromal cell precursor in human bone marrow by novel monoclonal antibody Stro-1 / P.J. Simmons, B. Torok-Storb // Blood. 1991. — № 78. — P. 55−62.
- Simmons P.J. CD34 expression by stromal precursors in normal human adult bone marrow / P.J. Simmons, B. Torok-Storb // Blood. 1991. — № 78. — P. 2848−2853.
- Song L. Transdiiferentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from bone marrow / Song L., Tuan R. // FASEB J. 2004. — № 18. -P. 980−982.
- Spees J. L. Differentiation, cell fusion, and nuclear fusion during ex vivo repair of epitelium by human stem cells from bone marrow storma // J.L. Spees, S.D. Olson, J. Ylostalo et al. // PNAS. 2003. — № 100 (5). — P. 2397−2402.
- Stain J.P.Cell-cell interactions in regulating osteogenesis and osteoblast function / J.P. Stain, R. Civitelli // Defects Research. 2005. — № 75. -P. 72−80.
- Stevenson S. The effect of osteogenin (a bone morphogenic protein) on the formation of bone in orthotopic segmental defects in rats / S. Stevenson, N. Cunningham, J. Toth et al. / J. Bone Joint Surg. 1994. — № 76(11). — P. 16 761 687.
- Suva D. Non-hematopoietic human bone marrow contains long-lasting, pluripotential mesenchymal stem cells / D. Suva, G. Garavaglia, J.J. Menetrey // Cell Physiol. 2004. — № 198. — P. 110−118.
- Teplyashin A.S. Formation of human three-dimensional transplants of bone tissue / A.S. Teplyashin, N.I. Chupikova, S.V. Korjikova et al. // 4th Annual Meeting of the European Tissue Engineering Society Munich: Etes. — 2005. — P. XC.
- Terada N. Bone marrow cells adopt the phenotype of other cells by spontaneous cell fusion / N. Terada, T. Hamazaki, M. Oka et al. // Nature. 2002. -№ 416.-P. 542−545.
- Tocci A. Mesenchymal stem cell: use and perspectives / A. Tocci, L. Forte // Hematol. J. 2003. — № 4. — P. 92−96.
- Toma J.G. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin / J.G. Toma, M. Akhavan, K.J. Fernandes et al. // Nat. Cell Biol. -2001.-№ 3.-P. 778−784.
- Tse W. Suppression of allogeneic T-cell proliferation by human marrow stromal cells: implications in transplantation / W. Tse, J.D. Pendleton, W.M. Beyer et al. // Transplantation. 2003. — № 75. — P. 389−397.
- Tuan R.S. Adult mesenchymal stem cells and cell-based tissue engineering / R.S. Tuan, G. Boland, R. Tuli // Arthritis Res. Ther. 2003. — № 5. -P. 32−45.
- Verfaillie C.M. Stem cells: hype and reality / C.M. Verfaillie, M.F. Pera, P.M. Lansdorp // Hematology. 2002. — P. 369−391.
- Vleminckx K. Cadherins and tissue formation: integrating adhesion and signaling / K. Vleminckx, R. Kemler // Bioessays. 1999. — № 21. — P. 211 220.
- Yang J-W. Evalution of human MSCs cell cycle, viability and differentiation in micromass / J-W. Yang, N. Isla, C. Huselstein et al. // Biorheology. 2006. — № 43. — P. 489−496.
- Yoon Y.S. Clonally expanded novel multipotent stem cells from human bone marrow regenerate myocardium after myocardial infarction / Y.S. Yoon, A. Wecker, LJ. Heyd et al. // Clin. Invest. 2005. — № 115. — P. 326−338.
- Young H.E. Mesenchymal stem cells reside within the connective tissues of many organs / H.E. Young, M.L. Mancini, M.L. Wright et al. // Dev. Dyn. 1995. — № 202. — P. 137−144.
- Young H.E. Human pluripotent and progenitor cells display cell surface claster differentiation markers CD 10, CD13, CD56 and MHC class I / H.E. Young, T.A. Steele., R.A. Bray et al. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1999. — № 221.-P. 63−71.
- Wang X. Cell fusion is a principal source of bone-marrow-derived hepatocytes / X. Wang, H. Willenbring, Y. Akkari et al. // Nature. 2003. — № 422 (6934).-P. 897−901.
- Werntz J.R.Qualitative and quantitative analysis of orthotopic bone regeneration by marrow / J.R. Werntz, J.M. Lane, A.H. Burstein et al. // J. Orthop. Res.-1996.-№ 14.-P. 85−93.
- Wolff D. Histomorphometric analysis of the repair of a segmental diaphyseal defect with ceramic and titanium fibermetal implants: Effects of bone marrow / D. Wolff, V.M. Goldberg, S. Stevenson // J. Orthop. Res. 1994. — № 12. — P. 439−446.
- Wozney J.M. Novel regulators of bone formation: Molecular clones and activities / J.M. Wozney, V. Rosen, A.J. Celeste // Science. 1988. — № 242. -P. 1528−1534.
- Zeille G. Intracytoplasmic immunofluorescence in multiple myeloma / G. Zeille // Cytometry. 1980. — № 1(1). — P. 37−41.
- Zhang Z.-X. Cytogenetic analysis of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells passaged in vitro / Z.-X. Zhang, L.-X. Guan, K. Zhang et al. // Cell Biology International. 2007. — № 1. — P. 1−4.
- Zohar B.R. Characterization of stromal progenitor cells enriched by flow cytometry / B.R. Zohar, J. Sodek, C.A.G. McCulloch // Blood. 1997. — № 90.-P. 3471−3481.
- Zuk P.A. Human adipose tissue is source of multipotent stem cells / P.A. Zuk, M. Zhu, P. Ashjian et al. // Molecular Biology of the Cell. 2002. — № 13.-P. 4279−4295.
- Zvaifler NJ. Mesenchymal precursor cells in the blood of normal individuals / N.J. Zvaifler, L. Marinova-Mutafchieva, G. Adams // Arthritis Res. -2000. № 2. — P. 477−488.
- Zvi N.A. The manipulated mesenchymal stem cells in regenerated skeletal tissues / A.N. Zvi, D. Robinson, S. Horowitz et al. // Cell Transplant. -1998. -№ 7(1). -P. 63−70.