Молекулярно-генетическое исследование гена лейцинбогатой киназы 2 (lrrk2) у лиц с болезнью паркинсона

Актуальность проблемы.

Болезнь Паркинсона (БП) — одно из наиболее распространенных нейродегенеративных заболеваний среднего и пожилого возраста, впервые была описана Джеймсом Паркинсоном в 1817 году как дрожательный паралич. БП является хронической неуклонно прогрессирующей болезнью, которая встречается во всех популяциях мира. Частота встречаемости данного заболевания среди лиц старше 65 лет составляет 1−3% (Mata et al., 2005; Zhu et al., 2006). Основным в клинике БП является следующий симптомокомплекс: повышенный тонус скелетной мускулатуры по экстрапирамидному типу, пониженная двигательная активность (брадикинезия), низкочастотный тремор покоя конечностей и других частей тела, постуральная неустойчивость. Диагноз БП может быть поставлен только при наличии не менее двух из указанных симптомов. Однако, клинический диагноз, даже при развернутой картине заболевания, находит нейрогистопатологическое подтверждение, приблизительно, в 75% случаев (Bennet et al., 1996; Bower et al., 2002).

Морфологическая картина при БП включает прогрессирующую гибель дофаминергических нейронов компактной части ЧС, что приводит к резкому снижению концентрации дофамина в полосатом теле, а также наличие внутриклеточных эозинофильных включений в сохраненных нейронах, получивших названия телец Леви.

Необходимо также отметить, что симптомокомплекс БП проявляется при гибели 80% дофаминергических нейронов ЧС мозга человека. Процесс нейродегенерации начинается задолго до дебюта заболевания, а когда оно становиться явным, патогенетическая терапия может быть уже не эффективной. В арсенале медицины существует метод диагностики, который позволяет поставить диагноз БП до появления клинических симптомов позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ). ПЭТ позволяет прижизненно изучать структурно-функциональное состояние церебральных нейротрансмиттерных структур. Широкое применение данного метода в клинической практике ограничено, так как ПЭТ относиться к дорогостоящим методам и в ряде случаев является не точным (Savitt et al., 2006). Таким образом, поиск маркеров БП, позволяющих проводить раннюю диагностику заболевания, а также при необходимости дифференциальную диагностику БП с другими неврологическими заболеваниями со сходными клиническими проявлениями — остается крайне актуальным.

Достижения молекулярной генетики последних лет позволили по-новому взглянуть на проблемы этиопатогенеза, нозологической принадлежности и диагностики БП. Хотя в большинстве случаев БП носит мультифакториальный характер, около 15% больных БП имеют семейную форму БП, когда заболевание имело место у нескольких родственников из одного или разных поколений (Gasser, 2007). Описаны семьи, где наследование заболевания происходит как по аутосомно-рецессивному, так и по аутосомно-доминантному типу.

За последние 11 лет описано одиннадцать генетических локусов, ответственных за развитие моногенных форм БП. В шести случаях удалось идентифицировать конкретные гены и провести детекцию мутаций у больных. Мутации в генах паркина (PARK2), PTEN-индуцированной киназы 1 (PINK1) и DJ-1 выявлены при аутосомно-рецессивной форме БП, и мутации в генах альфа-синуклеина (SNCA), убиквитин-С-концевой гидролазы LI (UCH-L1), лейцинбогатой киназы 2 (LRRK2) при аутосомно-доминантной форме заболевания (Dawson, 2007). ДНК-анализ в семьях с известной молекулярной природой БП может использоваться для доклинической диагностики данного заболевания, что позволит проводить у пациентов активное профилактическое лечение, своевременно начать адекватную симптоматическую терапию.

По существующим данным наиболее частым молекулярным дефектом, ответственным за развитие наследственной формы БП, являются мутации в гене лейцинбогатой киназы 2 (LRRK2, локус PARK8), кодирующем белок, названный дардарином (Gasser, 2007). Исследование мутаций гена LRRK2 и их изучение стало возможным после картирования хромосомного локуса PARK8 в 2002 году (Funayama et al., 2002). В 2004 году впервые обнаружена сегрегация мутаций в гене LRRK2 с БП в семьях (Paisan-Ruis et al., 2004; Zimpritch et al., 2004). В настоящее время у больных с аутосомно-доминантной формой БП, выявлен ряд аминокислотных замен в кодирующей области гена. В гене имеются мажорные мутации (G2019S, R1441C/G, Y1699C, I2020T), обнаруживаемые у больных БП в различных популяциях (Giasson, Van Deerlin, 2008). Наиболее распространенной из всех описанных в гене LRRK2 мутаций среди больных БП является мутация G2019S, которая встречается в европейских популяциях в 5−7% случаев семейной БП, но также была обнаружена в 0,6−1,6% спорадических случаев (Di Fonso et al., 2005; Gilks et al., 2005). В некоторых изолированных популяциях, например, среди арабов северной Африки и евреев-ашкенази, частота данной мутации среди семейных форм БП достигает 30−40% (Lesage et al., 2005; Ozelius et al., 2006). В то же время мутация G2019S не обнаружена в некоторых азиатских популяциях (Tan et al., 2005; Fung et al., 2006). Остальные мутации оказались менее распространенными, однако, в ряде случаев их частота показывала сильные межпопуляционные различия. Так, неожиданно высокая частота мутации R1441G (16,4% и 4% среди семейных и спорадических форм БП, соответственно) была обнаружена среди популяции басков в Испании (Simon-Sanchez et al., 2006).

Кодирующая область гена LRRK2 содержит 51 экзон (2527 аминокислот). Несмотря на большую протяженность гена, в ряде популяций был определен полный спектр мутаций среди больных БП (Mata et al., 2005; Di Fonzo et al., 2006; Paisan-Ruiz et al., 2008). Определение популяционной специфичности мутаций является необходимым условием для проведения молекулярной диагностики заболевания и внедрения методов ДНК-диагностики в клиническую практику. Разработка молекулярных методов диагностики БП остается особенно актуальной в силу отсутствия широкодоступных диагностических маркеров, позволяющих осуществлять диагностику заболевания на ранних стадиях БП. До настоящего времени в России спектр мутаций в гене LRRK2 среди больных БП остается неизвестным.

Изложенные выше данные явились основанием для проведения настоящего исследования.

Цель исследования:

Выявление мутаций в гене лейцинбогатой киназы 2 {LRRK2) у лиц с БП и сопоставление клинического течения заболевания у больных БП, имеющих мутации в гене LRRK2, и пациентов с БП отличной этиологии.

Задачи исследования:

1. Сопоставление клинического течения БП в зависимости от пола пациентов, возраста начала заболевания и наличия у них семейного анамнеза.

2. Разработка молекулярно-генетических методов идентификации мажорных мутаций (G2019S, R1441C/G/H, I2020T, 12 012Т) в гене LRRK2 и их скрининг в группе пациентов с БП и в контрольной группе.

3. Поиск мутаций в кодирующей области гена LRRK2 у пациентов с семейной формой БП.

4. Разработка методов идентификации выявленных мутации на основе метода ПЦР с последующим рестрикционным анализом и их скрининг в группе пациентов со спорадической формой БП и в контрольной группе.

5. Молекулярно-генетическое и неврологическое обследование семей пробандов с выявленными мутациями в гене LRRK2, а также сопоставление клинического течения БП, обусловленной известным молекулярным дефектом в гене LRRK2 и БП отличной этиологии.

Научная новизна:

Впервые в России проведено определение спектра мутаций в гене LRRK2 у больных с БП. У больных с семейной формой БП выявлены мутации G2019S и V1613A. Мутация V1613A в гене LRRK2 описана впервые в мире. У больных со спорадической формой БП впервые в России выявлены мутации G2019S и R1441C. Впервые в России проведено сопоставление течения заболевания у больных с выявленными мутациями в гене LRRK2 с больными БП отличной этиологии. Впервые в мире среди больных с БП, обусловленной мутацией G2019S, отмечено преобладание побочных эффектов от терапии JI-ДОФА-содержащими препаратами. Разработаны простые методы идентификации мутаций (G2019S, R1441C/G/H, I2020T, 12 012 Т, VI613А) в гене LRRK2 на основе ПЦР и рестрикционного анализа.

Практическая значимость работы:

В данной работе охарактеризован спектр мутаций в гене LRRK2 среди больных БП Северо-Западного региона России. Разработанные нами методы экспресс-тестирования мутаций в гене LRRK2 могут быть использованы в клинической практике при выявлении наследственных форм БП, обусловленных мутациями в гене LRRK2. Это позволит проводить ДНК-диагностику членов семей больных БП, обусловленной мутациями в этом гене, и осуществлять постановку на учет к невропатологу носителей мутаций до начала проявления клинических симптомов заболевания. Такой подход может способствовать повышению эффективности лечения БП.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В клинической картине БП выявлено преобладание определенных симптомов заболевания у пациентов в зависимости от пола, возраста начала заболевания и наличия семейного анамнеза.

2. Среди больных семейной формой БП Санкт-Петербурга выявлено пять семей, в которых развитие БП обусловлено ранее описанной мутацией G2019S в гене LRRK2. В трех случаях из пяти клиническое течение БП в этих семьях не отличалось от классической БП.

3. Впервые обнаружена новая мутация VI61 ЗА, приводящая к развитию семейной формы БП с преобладающим тремором.

4. У больных со спорадической формой БП выявлены ранее известные мутации в гене LRRK2: G2019S и R1441C.

5. В группе больных с БП, обусловленной мутациями в гене LRRK2, наблюдается повышенная частота побочных эффектов при применении JI-ДОФА-содержащих препаратов.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации:

Неврологический осмотр пациентов с БП и забор венозной крови выполнены автором лично. Разработка методов ПЦР и рестрикционного анализа, скрининг мутаций в группе пациентов с БП и в контрольной группе проведены автором лично. Автор провел статистический анализ всех полученных данных и сформулировал выводы. Описание собственных исследований, анализ и обсуждение результатов выполнены автором самостоятельно.

Апробация работы:

Предложенные к защите результаты были доложены на II международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения», Санкт-Петербург, СПбГМУ имени акад. И. П. Павлова (2007), научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины», СПбМАПО (2007), конференции «Фундаментальные науки-медицине», РАН, Москва (2006), 11 международной пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология наука XXI века», Москва (2007), I национальном конгрессе (с международным участием) по болезни Паркинсона и расстройствам движения, Москва (2008).

Публикации:

Результаты диссертационной работы отражены в 11 печатных работах соискателя, в том числе опубликовано 5 статей, 3 в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата медицинских наук.

Внедрение результатов работы в клиническую практику:

Методы ДНК-диагностики, разработанные на основе ПЦР с последующим рестрикционным анализом, внедрены в работе СПбГМУ имени акад. И. П. Павлова для диагностики семейных форм БП, обусловленной мутациями в гене LRRK2.

Структура и объем диссертации

:

Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы (96 наименования). Работа изложена на 101 страницах машинописного текста, иллюстрирована 12 таблицами, 17 рисунками и фотографиями.

выводы.

1. В клинической картине заболевания треморная форма БП преобладает у женщин по сравнению с мужчинами (р=0,007) и при семейной форме БП по сравнению со спорадической (р=0,009). Акинетико-ригидно-треморная форма преобладает у мужчин (р=0,003). Ригидно-треморная форма достоверно чаще встречается в спорадических случаях с началом заболевания после 50 лет по сравнению с семейной формой БП с началом заболевания после 50 лет (р=0,04).

2. Разработаны методы идентификации мутаций G2019S, R1441C/G/H, I2020T, 12 012 Т, VI61 ЗА на основе ПЦР и рестрикционного анализа.

3. При скрининге мутаций G2019S, R1441C/G/H, I2020T и 12 012 Т среди 278 больных БП выявлены: пять носителей мутации G2019S (5,9%- 5/85) среди семейных случаев БП, один носитель мутации G2019S (0,5%- 1/189) и один носитель мутации R1441C (0,5%- 1/189) среди спорадических случаев заболевания. Мутации R1441G/H, I2020T и 12 012 Т среди больных БП в Санкт-Петербурге не выявлены.

4. Впервые выявлена мутация V1613A. Разработан простой метод ее идентификации на основе ПЦР и рестрикционного анализа. Данная мутация выявлена в одном семейном случае (1,2%- 1/85) и не встречалась в контроле.

5. Охарактеризован спектр мутаций гена LRRK2 у больных с семейными формами БП в Санкт-Петербурге. Частота мутаций в гене LRRK2 среди семейных форм БП составила 7%.

6. Клиническое течение БП, обусловленной мутацией G2019S в большинстве случаев не отличалось от идиопатической БП, в то время как больные с мутацией V1613A имели БП с преобладающим тремором. Течение заболевания среди лиц со спорадической формой БП, обусловленной мутациями G2019S и R1441C, не отличалось от идиопатической БП.

7. Выявлена повышенная частота побочных эффектов при терапии Л-ДОФА-содержащими препаратами у больных БП, обусловленной мутациями в гене LRRK2 (р=0.002).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

1. Полученные данные позволяют предположить, что при проведении молекулярной диагностики БП в Северо-Западном регионе России прежде всего следует проводить скрининг мутации G2019S. При этом целесообразно проводить скрининг этой мутации в первую очередь у больных с семейной формой БП.

2. Разработанный нами простой и быстрый метод идентификации мутации G2019S может быть широко использован в лаборатории ДНК-диагностики.

3. При ведении пациентов с БП, обусловленной наличием мутации G2019S, применение JI-ДОФА-содержащих препаратов, по-видимому, должно быть осторожным (небольшими дозами) с применением «лекарственных каникул», поскольку нами показана повышенная частота развития побочных эффектов от Л-ДОФА-содержащих препаратов в данной группе больных.

4. Особое внимание обращает тот факт, что мутации в гене LRRK2 обнаружены у пациентов БП с преобладающим тремором. Учитывая полученные данные, можно рекомендовать медицинскому сообществу быть более внимательным к «стертым» формам тремора, а так же при постановке диагноза пациенту с единственным симптомом — тремором, не исключать возможность наличия БП.