Новые подходы к оценке функциональной активности лимфоцитов с помощью проточной лазерной цитометрии

ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Содержание

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
- 1. 1. Проточная цитометрия — современный инструмент лабораторных методов исследования
  - 1. 1. 1. История создания клеточных анализаторов
- 1. 1. , 2. Принципы работы проточного цитомепра
  - 1. 1. 3. Современные технологии, связанные с развитием проточной цитометрии
- 1. 2. Методы оценки цитотоксической активности лимфоцитов
  - 1. 2. 1. Виды цитотоксической активности лимфоцитов и подходы к ее измерению
  - 1. 2. 2. Традиционные методы оценки клеточной цитотоксичности, их характеристика
  - 1. 2. 3. Витальные флюоресцентные красители для проточной цитометрии
  - 1. 2. 4. Эволюция принципов оценки клеточной цитотоксичности с помощью проточной цитофлюориметрии
- 1. 3. Методы оценки пролиферативной активности лимфоцитов
  - 1. 3. 1. Обычные методы оценки пролиферативной активности лимфоцитов
  - 1. 3. 2. CFSE — новый подход к оценке клеточной пролиферации с помощью проточной цитометрии
    - 1. 3. 2. 1. Анализ двухкратного разведения CFSE — показателя деления клеток
    - 1. 3. 2. 2. Изучение взаимосвязи пролиферации и дифференцировки лимфоцитов in vitro с помощью CFSE-разведений
    - 1. 3. 2. 3. CFSE в изучении миграции и пролиферации лимфоцитов in vivo
ГЛАВА 2. Материалы и методы
- 2. 1. Характеристика обследованных групп населения.4S
- 2. 2. Реактивы и расходные материалы
- 2. 3. Растворы
- 2. 4. Стандартное оборудование
- 2. 5. Проточный цитофлюориметр, его характеристики и настройка
- 2. 6. Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение
- 3. 1. Разработка метода оценки функциональной активности NK-клеток периферической крови с использованием проточной цитофлюорометрии
  - 3. 1. 1. Выбор флюоресцентного красителя и мечение клеток-мишеней для оценки их киллинга NKклетками
  - 3. 1. 2. Отработка постановки цитотоксической реакции NK-клеток
  - 3. 1. 3. Двухцветный анализ функциональной активности NK-клеток на проточном цетгофлюориметре
  - 3. 1. 4. Корреляционный анализ цитометрическогои радиоактивного методов оценки функциональной активности NK-клеток
  - 3. 1. 5. Применение цитометрического метода анализа функциональной активности NK-клеток для изучения влияния на NK-активность введения препарата «Аллоферон»
  - 3. 1. 6. Применение цитометрического метода анализа функциональной активности NK-клеток для изучения NK-активности у больных ВИЧ-инфекцией, и больного с синдромом Чедиака-Хигаси
- 3. 2. Разработка метода оценки функциональной активности лимфоцитов периферической крови с использованием проточной лазерной цитометрии
  - 3. 2. 1. Выбор флюоресцентного красителя и мечение лимфоцитов для оценки их бласттрансформации и пролиферации
  - 3. 2. 2. Отработка постановки реакции бласттрансформации и анализ её на проточном цитометре
  - 3. 2. 3. Корреляция между цитометрическим и радиоактивным методами оценки бласттрансформации лимфоцитов
  - 3. 2. 4. Изучение влияния циклоспорина, А на функциональную активность лимфоцитов с помощью проточной лазерной цитометрии
  - 3. 2. 5. Применение цитометрического метода для оценки функциональной активности лимфоцитов у больных ВИЧ-инфекцией
ВЫВОДЫ

Новые подходы к оценке функциональной активности лимфоцитов с помощью проточной лазерной цитометрии (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Актуальность темы

диссертации.

Одной из важнейших задач клинической иммунологии является всесторонняя оценка иммунного статуса. Она включает в себя следующий комплекс основных тестов: оценка фагоцитоза, гуморального иммунитета и системы комплемента, иммунофенотипирование лимфоцитов, функциональнальная активность лимфоцитов и оценка интерферонового статуса. [12]. Оценка функциональной активности лимфоцитов имеет важное значение, так как часто при многих заболеваниях и вторичных иммунодефицитах наблюдается нормальное количественное содержание этих клеток, но их функции зачастую угнетены /увеличены/ в значительной степени, и это может являться определяющим звеном в патогенезе того или иного заболевания. Комплекс оценки функциональной активности лимфоцитов включает в себя измерение цитотоксической активности NK-клеток, пролиферативный ответ лимфоцитов на Ти В-митогены, определение Thl и Th2 клеток, определение количества синтезируемых цитокинов мононуклеарами периферической крови, апоптоз лимфоцитов при специфической и неспецифической стимуляции. Изменения функциональной активности лимфоцитов происходят при следующих состояниях:

— первичных иммунодефицитах, связанных с нарушениями клеточного иммунитета.

— вторичных иммунодефицитах, связанных с нарушениями клеточного иммунитета, которые развиваются вследствие воздействия на организм какого-либо повреждающего фактора (ВИЧ-инфекция, острые и хронические вирусные инфекции, злокачественные заболевания и др.).

— физиологических иммунодефицитах, например, при старении, когда ослабление иммунитета затрагивает реакции, обусловленные Т-клетками, что служит одной из причин повышения частоты опухолей в старостиаутоиммунных заболеваниях.

Как правило, эти изменения, не являются основной причиной заболевания, но их анализ представляет определенный интерес для клинической иммунологии, так как позволяет оценить эффективность проводимого лечения и прогнозировать течение заболевания.

Функциональную активность лимфоцитов оценивают как их способность к пролиферации и бласттрансформации под влиянием митогенов. В России, результаты пролиферативного ответа лимфоцитов до последнего времени оценивались чаще всего с помощью микроскопического метода (морфологическая идентификация и подсчет процента бластов), либо с помощью включения радиоактивной метки (чаще всего это предшественник ДНК, 0-излучатель 3Н-тимидин[2]), либо с помощью МТТ-теста, основанного на изменении цвета связывающегося с клетками красителя 3-[4,5 диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенил 2-тетразолия из синего в желтый. Функциональную активность естественных (натуральных) киллерных клеток (NK) чаще всего оценивали так же в радиоактивных цитотоксических тестах, используя в качестве мишеней меченые 3Н-уридином или 51 Сг клетки культуры опухолевых миелобластов К-562, полученной из плеврального выпота больных хроническим эритромиелолейкозом. NK-клетки лизируют клеткимишени, и К-562 выделяют в среду культивирования радионуклид. По количеству высвободившейся из мишеней радиоактивной метки и определяют NK-активность (процент NK-активности). Эти традиционные методики имеют ряд недостатков, в случае микроскопического метода — это высокая субъективность оценки результата, в случае радиоактивных методовиспользование радиоактивного излучателя. Кроме того, классические радиоактивные тесты дают лишь косвенные данные о наличии (отсутствии) ответа.

С появлением проточной лазерной цитометрии (ТОЩ) более 20-ти лет назад значительно расширились возможности изучения всех показателей иммунного статуса. Методы изучения клеточного звена иммунной системы 8 с помощью проточной цитометрии имеют ряд неоценимых приемуществ: объективность, высокая скорость и точность анализа, простота постановки реакции, быстрое получение результата, безопасность. Существующие методы оценки функциональной активности лимфоцитов с использованием ПЛЦ обобщены в ряде обзоров (разделы 1.3.1−1.3.2).

В связи с этим целью работы явилась разработка цитометрических методов оценки цитотоксической акти «*'ости NK-клеток и пролиферативной активности лимфоцитов крови человека, пригодных для рутинных исследований в клинической лаборатории. Для проверки эффективности разработанных методов с перспективой их дальнейшего внедрения в лабораторную практику мы использовали три подхода: во-первых, сравнение новых методик с хорошо себя зарекомендовавшими старыми методами во-вторых, применение новых методик для детекции изменений функций лимфоцитов под воздействием иммунотропных веществ в-третьих, определение с помощью разработанных методов нарушения функциональной активности лимфоцитов у больных с первичными и вторичными иммунодефицитами.

Задачи исследования.

1. Разработать микрометод оценки цитотоксической активности NK-клеток с использованием проточной лазерной цитометрии.

2. Разработать метод оценки функциональной активности лимфоцитових способности к бласттрансформации и пролиферации под влиянием Т-клеточного митогена с использованием проточной лазерной цитометрии.

3. Провести корреляционный анализ между цитометрическими и классическими методами определения функциональной активности лимфоцитов.

4. Показать возможность изучения функциональной активности лимфоцитов с помощью цитометрической методики для оценки действия иммунотропных лекарственных препаратов на клетки иммунной системы.

S. Апробировать разработанные методики на больных с нарушениями этого звена иммунной системы.

Научная новизна.

Впервые разработана оригинальная методика, позволяющая оценивать цитотоксическую активность NK клеток периферической крови человека, которые лидируют клетки-мишени, с использованием проточной лазерной цитометрии Основой для определения убитых в ходе реакции клеток К-562 явилось двойное флюоресцентное окрашивание. Окрашенные карбоксифлюоресцеиндиацетат-сукцинилмидил эфиром (КФСЭ) мишени (К-562) смешиваются с клетками-эффекторами (мононуклеарами периферической крови — МПК) и инкубируются несколько часов. Затем пробы окрашиваются йодистым пропидием (PI). Среди всех вовлеченных в реакцию клеток мишени определяют как включившие в себя КФСЭ (зеленое свеченге), а убитые киллерами среди них, включившие в себя как КФСЭ, так и PI (красно-зеленое свечение). По количеству убитых в ходе реакции мишеней и определяется цитотоксическая активность образца. Показана высокая степень корреляции нового метода с классическим радиоактивным тестом (коэффициент корреляции составил 0,75 при г<0,05).

С помощью цитометрического метода установлено влияние на цитотоксическую активность МПК здоровых доноров Аллоферонахимически чистого олигопептида из 13 L-аминокислот с цитокиноподобной активностью, в частности то, что он вызывает достоверное повышение цитотоксической активности NK-клеток здоровых доноров на 7 сутки после введения.

Эффективность разработанной методики подтверждает её клиническая значимость: достоверное снижение функций NK-клеток у обследованных больных ВИЧ-инфекцией и у ребенка с синдромом Чедиака-Хигаси.

Впервые модифицирован и адаптирован метод оценки функциональной активности лимфоцитов — их бласттрансформации и пролиферации с помощью проточной лазерной цитометрии. Сущность измерения пролиферативной активности заключается в том, что окрашенные КФСЭ клетки делятся под влиянием митогена, и из одной клетки с большей исходной интенсивностью свечения образуются две клетки, интенсивность свечения каждой из которых примерно в два раза ниже исходной, и так далее. С помощью цитометрического метода можно наглядно проследить за судьбой почти всех клеток, определить до 8 митозов в реакции и тем самым более тонко определить функциональное состояние лимфоцитарной системы. Предложены три параметра измерения активности вместо одного в радиоактивном методе, процент бласттрансформации, митотическая активность бластов и индекс деления Новая методика имеет высокую степень корреляции с радиоактивным методом. Коэффиценты корреляции по всем трем параметрам были высокими (0,72,0,75 и 0,73)при р<0,05.

С помощью цитометрической методики установлено значительное угнетение как бласттрансформации, так и дальнейшей пролиферации лимфоцитов здоровых доноров под влиянием циклоспорина, А — ингибитора синтеза ИЛ2. Цитометрический метод позволил более детально изучить влияние этого иммуносупрессора на поведение лимфоцитов: установлено, что его влияние является дозозависимым.

При помощи разработанной методики подтверждено достоверное снижение функций лимфоцитов больных ВИЧ-инфекцией — их способности отвечать активацией и пролиферацией на поликлональный Т-митоген-фитогемагглютинин.

Практическая значимость работы.

Методы оценки функциональной активности лимфоцитов разработаны в микроварианте, подтверждены классическими радиоактивными методами, набраны нормативные показатели, поэтому их можно использовать в рутинных исследованиях в любой иммунологической лаборатории при наличии проточного цитометра. Разработанные методики включены в методическое пособие для врачей-лаборантов «Применение лазерной цитометрии для оценки функциональной активности иммунной системы человека».

Основные положения, выносимые на защиту.

Двойная метка (КФСЭ/PI) для клеток-мишеней К-562 является оптимальной в щггометрической методике оценки функциональной активности NK-клеток — их способности убивать мишени в 4-х часовом цитопгоксическом тесте.

Использование меченых 5-, 6-карбоксифлуоресцеиндиацетат-сукцинилмидил эфиром клеток линии К-562 позволяет более точно, быстро и эффективно оценивать цитотоксическую активность NK-клеток, фиксировать эффекты влияния иммунотропных веществ на изучаемый параметр и исследовать NK-активность при различных патологиях с нарушениями данного звена.

Использование меченых 5-, 6-карбоксифлуоресцеиндиацетат-сукцинилмидил эфиром мононуклеаров периферической крови позволяет точно и эффективно исследовать их способность отвечать бласттрансформацией и пролиферацией на митоген. Применение проточной лазерной цитометрии позволяет всесторонне оценивать, во-первых, степень влияния различных иммунотропных веществ на функциональную активность лимфоцитов, во-вторых, изучать более тонкие механизмы функционирования лимфоцитов при различных иммунопатологиях.

выводы.

1. Разработан метод оценки функциональной активности NK-клеток, основанный на двойном флюоресцентном окрашивании (карбоксифлюоресцеин-пропидиума иодид). Метод высоко коррелирует с радиометрическим классическим тестом с включением ДНК-предшественника Н-уридина (г=0,75).

2. Показана высокая эффективность цитометрического метода как для оценки влияния иммунотропных препаратов на функциональную активность NK клеток, тал и для оценки иммунного статуса у больных с первичными и вторичными иммунодефицитами.

3. Апробирован и модифицирован метод оценки функциональной активности лимфоцитов, основанный на двойном разведении карбоксифлюоресцеина при каждом клеточном делении. Предложены три параметра измерения активности: процент бласттрансформации, митотическая активность бластов и индекс деления. Метод высоко коррелирует с радиометрическим классическим тестом.

4. Показана эффеетивносгь применения цитометрической методики для детального изучения воздействия на пролиферацию лимфоцитов циклоспорина, А — ингибитора активности Т-клеток: продемонстрировано, что данный иммуносупрессор угнетает процент бласттрансформации, митотическую активность бластов и индекс деления лимфоцитов здоровых доноров, и его влияние является дозозависимым.

5. На модели ВИЧ-больных показана высокая информативность по сравнению с радиометрическим тестом цитометрического метода оценки бласттрансформации и пролиферации лимфоцитов, позволяющего получить более подробную информацию о состоянии данного звена иммунитета.

Заключение

Адаптирован метод оценки функциональной активности лимфоцитов — их способности к бластгрансформации и пролиферации в ответ на поликлональный Т-митоген — ФГА с помощью проточной цитометрии. Метод основан на уменьшении флуоресценции окрашенных карбоксифлюоресцеином клеток при делении, когда из одной клетки с исходной большой интенсивностью свечения образуются две клетки, интенсивность каждой из которых примерно в два раза меньше.

Цитометрической методика достоверно коррелирует с классическим радиометрическим тестом на включение 3Н-тимидин-1. Набраны показатели для контрольной группы доноров. Определены оптимальное время реакции и концентрация митогена. При помощи разработанной методики продемонстрирована её клиническая и диагностическая значимость: достоверное снижение способности лимфоцитов больных ВИЧ-инфекцией отвечать активацией на ФГА. Функциональная активность лимфоцитов по.

83 данным реакции РБТЛ с ФГА при нормальном количественном содержании Т-хелперов достоверно коррелирует со степенью тяжести заболевания и поэтому может быть использована как прогностический маркер СПИДа, в частности, низкий ответ лимфоцитов на ФГА подтверждаяет прогрессирование течения инфекции.

Цитометрический метод зафиксировал значительное снижение ответа лимфоцитов при воздействии агента, блокирующего образование ИЛ 2 -циклоспорина А.

Показать весь текст

Список литературы

Арцимович Н. Г. Галушина Т. С. Естественные киллеры и их гипотетическая роль в патогенезе синдрома хронической усталости. // Иммунология -№ 6 -2001 с. 4−6.
Иммунологические методы под. ред. Г. Фримеля -М — Медицина -с. 294−302.
Леви Д. А. Вирус иммунодефицита человека. Патогенез инфекции и возможности контроля. Иммунология. 1990, 4, 14−20.
Лимфоциты. Методы. Под ред. Дж. Клауса.-М.-Мир-1990 с.299−303.
Кулаков В. В. Дис.. докт. мед. наук. М., 1998
Кулаков В. В., Воробьёва Н. В., Пинегин Б. В. // Иммунология -1995, — № 4.-С. 31−34.
Кулаков В. В., Пинегин Б. В. // Иммунология.-1995 № 5.-С. 44- 46.
Пальцев М. А., Иванов А. А. Межклеточные взаимодействия М -Медицина — 1995 — с.92−97.
Ройт А., Бростофф Д., Дейл Д. Иммунология -М.-Мир с.179−181.
Саидов М.З., Пинегин Б. В. // Лабораторное дело 1991 — № 3 — с. 5660.
Хаитов Р. М., Пинегин Б. В. Оценка иммунного статуса человека в норме и при патологии // Иммунология 2001 — с.4−6.
Хаитов РМ, Игнатьева ГА. СПИД. М. Изд. «Народная академия культуры и общечеловеческих ценностей». 1992.
Хаитов P.M., Пинегин Б. В., Истамов Х. И. Экологическая иммунология М — ВНИРО — 1995.
Ярилин А. А. Основы иммунологии -М -Медицина 1999 -с.136−144.
Angulo R., Fulcher DA. Measurement of Candida- Specific Blastogenesis: Comparison of Carboxyfluorescein Succinimidyl Es-er Labelling of T Cells, Thymidine Incorporation and CD69 Expression // Cytometry 1998 — 34 — p. 143−151.
Biseili R. et al. Multiparametric flow cytometric analysis of the kinetics of surface molecule expression after polyclonal activation of human peripheral blood T lymphocytes. // Scand. J. Immunol. 1992 -35 — p.439−447.
Bloom B. R. Et al. Dissotiation of MIF production and cell proliferetion // J. Immunol. 1972 — 109 — p. 1395−1398.
Boutonnat J. et al. PKH26 probe in the study of the proliferation of chemoresistant leukemic sublines. //Anticancer Res. 1998 — 18 -p.4243−4251.
Brooks A G. et al. Natural killer cell recognition of HLA class I molecules // Rev Immunogenet 2000 — 2(3) — p.433−448.
Chang L. et al. Rapid flow cytometric assay for the assessment of natural killer cell activity // J Immunol Methods 1993 — 166 — p.45.
Cook E.B. et al. Simultaneous measurement of six cytokines in a single sample of human tears using microparticle-based flow cytometry allergies vs. non-allergics // Journal of Immunological Methods 2001 -254 — pl09-l 18.
Crouch S. et al. The use of ATP bioluminescence as a measure of proliferation and cytotoxicity // J Immunol Methods 1993 — 160 — p.81−88.
Deenick E.K. et al. Switching to IgG3, IgG2b and IgA is division-linked and independent revealing a stochastic framework for dascribing differentiation // J Immunol. in press.
Fazekas de St Groth B. et al. Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester and the virgin lymphocyte: A marriage made in heaven // Immunology and Cell Biology 1999 — 77 — p.530−538.
Flieger D. et al. A novel non-radioactive cellular cytotoxicity test based on the differential assessment of living and killed target and effector cells // J Immunol Methods 1995 — 180 — p. 1.
Fulcher D.A., Wong S.W.J. Carboxyfluorescein succinimidyl ester-based proliferative assays for assesment of T cell function in the diagnostic laboratory // Immunology and Cell Biology 1999 — 77 — p.559−564.
Fulton R.J. et al. Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system // Clin Chem 1997 — 43 — p. 1749−1756.
Geha R. S., et al. Responses of human thymus-derived (T) and non-thymus-derived (B) lymphocytes to mitogenic stimulation // Nature -1972−240-p. 198−200.
Gett A.V., Hodgkin P.D. Cell division regulates the T cell cytokine repertoire revealing a mechanism underlying immune class regulation // Proct Nat Acad Sci USA 1998 — 95 — p.9488−9493.
Hasbold J. et al. Quantitative analysis of lymphocyte differentiation and proliferation in vitro using carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester 11 Immunology and Cell Biology 1999 — 77 — p.516−522.
Hasbold J., Hong JS-Y et al. Integrating signals from INF-y and DL-4 by B-cells: Positive and negative effects on CD40 ligand-inducedproliferation, survival and division-linked isotype switching to IgGl, IgE and IgG2a // J Immunol in press.
Hasbold J., Lyons A.B. et al. Cell division number regulates IgGl and IgE switching of В cells following stimulation by CD40 ligand and IL-4 // Eur J Immunol 1998 — 28 — p. 1040−1051.
Hatam L. et al. Flow cytometric analysis of natural killer cell function as a clinical assay // Cytometry 1994 — 16 — p.59.
Haugland R.P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals Sixth Edition — Molecular Probes — 1996 — p. 491.
Hodgkin P.D., Lee J-H., Lyons A.B. B-cell differentiation and isotype switching is related to division cycle number // J. Exp. Med. 1996 -184 — p.277−281.
Hoffmann B, Lindhart BO, Gerstoff J et al. Lymphocyte transformation response to pokeweed mitogen as predictive marker for the development AIDS and AIDS related symptom in homosexual men with HIV antibodies. // Br.Med.J. 1987, 295, 293−297.
Hoffmann B, Jakobsen KD, Odum N et al. HIV-induced immunodeficiency. //J.Immunol. 1989, 143, 1874−1880.
Honig M.G., Hume R.I. Dil and DiO: versatile fluorescent days for neuronal labeling and pathway tracing // Trends Neurosci 1989 — 12 -p.333−341.
Jaroszeski M. J., Radcliff G. Fundamentals of Flow Cytometry // Molecular Biotechnology 1999 — 11 — p.37−53.
Jewettt A., Bonavida B. Target-induced inactivation and cell death by apoptosis in a subset of human NK cells // J Immunol 1996 — 156 -p.907.
Johann S. et al. A versatile flow cytometry-based assay for the determination of short- and long-term natural killer cell activity // J Immunol Methods 1995 — 185 — p.209.
Kashii Y. Et al. Constitutive exspression and role of the TNF family ligands in apoptotic killing of tumor cells by human NK cells // J Immunol. 1999 — 163 — p.5358.
Keast D., Bartholomaeus W. N. A micromethod for stimulation of lymphocytes by PHA // Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci. 1972 — 50 -p.603−609.
Kimberley M.G. et al. A fluorescence NK assay using flow cytometry // J Immunol Methods 1986 — 86 — p.7.
King M.A. Detection of dead cells and measurement of cell killing by flow cytometry // Journal of Immunological Methods 2000 — 243 -p. 155−166.
King M.A. et al. Flow cytomrtric analysis of cell killing by the jumper and venom peptide pilosulin I // Cytometry 1998 — 32 — p.268.
Lazda V., Baram P.,/Participation of different cell populations in antigen-and mitogen induced lymphocyte proliferation // J. of Imminology.-1974.-Vol. 112.-Р, — 1705−1717.
Lecoeur H. et al. A novel flow cytometric assay for quantitation and multiparamertic characterization of cell-mediated cytotoxicity // Journal of Immunological Methods 2001 — 253 — p.177−187.
Lees J.E., Hales J.M. Imaging and quantitative analysis of tritium-labelled cells in lymphocyte proliferation assays using microchannel plate detectors originally developed for X-ray astronomy // Journal of Immunological Methods 2001 — 247 — p. 95−102.
Lyons A.B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution // Journal of Immunological Methods 2000 — 243 — p. 147−154.
Lyons A.B. Divided we stand: Tracking cell proliferation with carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester // Immunology and Cell Biology 1999 — 77 — p.509−515.
Lyons A.B., Parish C.R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry // Journal of Immunological Methods 1994 — 171 — p. 131 137.
Maecker H.T. et al. Use of overlapping peptide mixtures as antigens for cytokine flow cytometry // Journal of Immunological Methods 2001 -255 — p.27−40.
Mattis A. et al. Analyzing cytotoxic T lymphocyte activity: a simple and reliable flow cytometry-based assay // Journal of Immunological Methods 1997 — 204 — p. 135−142.
McGinnes К. Et al. A fluorescence NK assay using flow cytometry // J Immunol Methods 1986 — 86 — p. 7.
Mintern J. et al. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester to determine the site, duration and cell type responsible for antigen presentation in vivo // Immunology and Cell Biology 1999 — 77 -p.539−543.
Noguchi P., Johnson J. В., at al.,/Measurement of DNA synthesis by flow cytometry/ Cytometry.-1981.-Vol. 1.-P.-390.
Nordon R E. et al. Analysis of growth kinetics by division tracking // Immunology and Cell Biology 1999 — 77 — p.523−529.
O’Brien J et al. Investigation of the alamar blue (resazurin) fluorescent dye for the assessment of mammalian cell cytotoxicity // Eur J Biochem -2000−267-p.5421−5426.
O’Callaghan C.A. Molecular basis of human natural killer cell recognition of HLA-E (human leucocyte antigen-E) and its relevance to clearance of pathogen-infected and tumor cells // Clin Sci (Colch) 2000 -Jul 99(1) — p.9−17.
Papa S. et al. Natural killer function in flow cytometry. Evaluation of NK lytic activity on K562 cell line // Journal of Immunological Methods -1988- 107-p. 73−78.
Papadopoulos N.G. et al. An improved fluorescence assay for the determination of lymphocyte-mediated cytotxicity using flow cytometry // J Immunol Methods 1994 — 177 — plOl.
Parish C.R. Fluorescent dyes for lymphocyte migration and proliferation studies // Immunology and Cell Biology 1999 — 77 — p.499−508.
Scharton T.M., Sher A. Role of natural killer cells in innate resistance to protozoan infections // Curr Opin in Immunol 1997 — 9 -p.44−51.
Shapiro H.M. Practical Flow Cytometry Third Edition — New York -Wiley Liss — 1995 — p.316−317, 317−319, 345−347.
Slezak S.E., Horan P.K. Cell-mediated cytotoxicity. A highly sensitive and informative flow cytometric assay // J Immunol Methods 1989 -117 — p.205.
Stater K. Cytotoxicity tests for high-throughput drug discovery // Curr Opin in Biotechnology 2001 — 12 — p. 70−74.
Sultzer B. et al. PPD Tuberculin: a B-cell mitogen // Nature -1972 240 -p. 198−200.
Taga K. Et al. Target-induced death by apoptosis in human lymphokine-activated natural killer cells // Blood 1996 — 87 — p.2411.
Taylor M. et al. Problems encoutered in the preparetion of MIF and mitogenic factor (MIT) from PHA-stimuleted human peripheral lymphocytes //Cell Immunol. 1975 — 19 — p. 41−47.
Thiel A. et al. Immunomagnetic cell sorting pushing the limits // Immunotechology 1998 — 4 — p.89−96.
Tobery T.W. et al. A simple and efficient method for the monitoring of antigen-specific T cell responses using peptide pool arrays in a modified ELISpot assay // Journal of Immunological Methods 2001- 254 — p. 5966.
Vales-Gomez M. et al. Interaction between the human NK receptors and their ligands // Crit Rev Immunol 2000 — 20(3) — p.223−244.
Vujanovic N.L. et al. Non-secretory apoptotic killing by human NK cells // J Immunol. 1996 — 157 — p. 1117.
Wahlberg B.J. et al. Measurement of NK activity by the microcytotoxicity assay (MCA): a new application for an old assay // Journal of Immunological Methods 2001 — 253 — p.69−81,
Warren H.S. Using carboxyfluorescein diacetate succimidyl ester to monitor human NK cell division: Analysis of the effect of activating and ingibitory class I MHC receptor // Immunology and Cell Biology 1999 — 77 -p.544−551.
Watson J.V. The Early Fluidic and Optical Physics of Cytometry // Cytometry 1999 — 38 — p.2−14.
Wedemeyer N., Potter T. Flow cytometry: an «old» tool for novel application in medical genetics // Clin Genet 2001 — 60 — p. 1−8.
Weston S.A., Parish C.R. New fluorescent dyes for lymphocyte migration studies. Analysis by flow cytometry and fluorescence microscopy// Journal of Immunological Methods 1990 — 133 — p.87−97.
Wodnicka M. et al. Novel fluorescent technology platform for high throughput cytotoxicity and proliferation assays // J Biomol Screening -2000−5-p. 141−152.
Zarcone D. Et al. Flow cytometry evaluation of cell mediated cytotoxicity // J Immunol Methods 1986 — 94- p. 73.

Заполнить форму текущей работой