Роль фотогетеротрофных пурпурных бактерий в самоочищении почвы от углеводородов

Загрязнение природной среды нефтью и нефтепродуктами — острейшая экологическая проблема во многих регионах России и во всем мире. Ежегодно в мире добывается свыше 3.5 млрд. тонн сырой нефти, из них в 2001 году в России было добыто 348 млн. тонн («Территория», информационный портал). Химическое загрязнение окружающей среды происходит на всех стадиях технологического процесса: при добыче, транспортировке, хранении и переработке нефти. При транспортировке нефти по трубопроводам в результате случающихся на них аварий теряется до 1.5−2% добываемой нефти. При одном порыве нефтепровода в среднем вытекает 2 т нефти, при этом в негодность приводится 1 тыс. м2 земли. Есть оценка, что из-за аварий нефтепроводов в России ежегодно разливается 15−20 млн. тонн нефти (Арзамасцев, 2008).

При попадании нефти и нефтепродуктов в почву происходят глубокие и часто необратимые изменения физических, морфологических, физико-химических, микробиологических свойств, а иногда и существенная перестройка почвенного профиля, что приводит к потере плодородия и отторжению загрязненных территорий из хозяйственного использования. Углеводороды нефти способны образовывать в процессе трансформации токсичные соединения, обладающие канцерогенными свойствами и способностью переходить в растения, что значительно снижает качество возделываемых культур и создает определенную угрозу для здоровья человека (Биодеградация нефти и., 2003).

Деятельность человека, связанная с добычей нефти и ее переработкой, поставила ряд задач по сохранению и защите окружающей среды. Биотехнологии защиты окружающей среды — это тот инструментарий, который призван обеспечить восстановление затронутых деятельностью человека экосистем. Одним из современных методов, используемых при разработке экологически чистых технологий защиты окружающей среды и восстановления природных ресурсов, является биоремедиация — это наиболее щадящий метод сохранения биоразнообразия и обеспечения устойчивости очищаемых биоценозов. Формирование этой области научных знаний состоялось в 90-х годах и в настоящее время происходит развитие экобиотехнологий, которые основаны на поиске, селекции и интродукции наиболее активных микроорганизмов-деструкторов, получении ассоциации микроорганизмов, обладающих желаемыми свойствами. (Янкевич, 2002).

Помимо метода рекультивации, предусматривающего интродукцию углеводородокисляющих микроорганизмов в экосистему, большое значение приобретают методы, основанные на стимуляции естественной нефтеокисляющей микрофлоры (Коронелли, 1996), т.к. внесение углеводородокисляющих микроорганизмов не более эффективно, чем стимулирование аборигенной микрофлоры (Atlas, Cerniglia, 1995), а иногда и менее эффективно (A feasibility study on., 1997). Поэтому необходимо изучать все группы микроорганизмов, способные участвовать в деструкции нефти и нефтепродуктов. Целесообразно изучение ассоциаций микроорганизмов с различным спектром биохимических особенностей и их взаимодействие в процессе биодеградации углеводородов нефти. Но в исследованиях, посвященных углеводород-ассимилирующим микроорганизмам, большинство авторов сосредотачивают свое внимание на аэробных хемотрофных бактериях и микроскопических грибах. В то время как есть исследования, говорящие о важной роли фототрофных бактерий в деградации нефтепродуктов (Драчук, 2004; Effect of Photosynthetic., 2004), сведения о возможном участии в биодеградации нефти фотогетеротрофных организмов очень ограничены.

Пурпурные несерные бактерии являются специфической микрофлорой почв, загрязненных углеводородами (Драчук, 2004), обладают широким спектром метаболических путей и таким свойством, как способность к азотфиксации. Поэтому, их участие в биодеградации нефти, в составе смешанных микробных культур или как самостоятельных деструкторов углеводородов представляет большой интерес. Мало изученным является вопрос о распространении этих микроорганизмов в почвах и грунтах, подверженных загрязнению нефтью или нефтепродуктами, и роли их в самоочищении земель от таких поллютантов.

Цель настоящего исследования — выяснить роль фотогетеротрофных пурпурных бактерий в процессах самоочищения почв и грунтов от углеводородного загрязнения.

Основные задачи исследования:

1. Изучить ход самоочищения почвы и грунта от углеводородов при экспериментальном загрязнении: при этом проследить динамику численности аэробных нефтеокисляющих бактерий, нефтеокисляющих грибов, несерных пурпурных бактерий и интенсивность деградации углеводородов в течение 2−3 сезонов.

2. Выявить закономерности появления и распространения фотогетеротрофных бактерий в почвах и грунтах, загрязненных нефтепродуктами.

3. Оценить роль разных групп микроорганизмов в биодеградации углеводородов в почве.

4. Определить влияние несерных пурпурных бактерий на скорость деградации углеводородов в почве и грунте.

Научная новизна. Проведено параллельное наблюдение за динамикой процессов самоочищения от углеводородов почвы и грунта с различными абиотическими и биологическими показателями, начиная с самого момента загрязнения. При анализе имеющихся и вновь полученных данных выявлены условия, влияющие на появление и распространение пурпурных бактерий в почвах, загрязненных углеводородами. Получены данные о вкладе фотогетеротрофных бактерий в деградацию нефтепродуктов в почве. Впервые показано положительное влияние несерных пурпурных бактерий на процессы самоочищения земель от углеводородного загрязнения.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные уточняют ход микробиологических процессов в загрязненных углеводородами почвах, дают понятие о роли отдельных групп нефтеокисляющих микроорганизмов в биодеградации этих поллютантов и о взаимоотношении между различными группами микроорганизмов. Результаты работы расширяют представления об экологии пурпурных бактерий, дают представление о роли этих микроорганизмов в процессах самоочищения почв от нефтепродуктов. Данные о влиянии культур фотогетеротрофных бактерий на эффективность биодеградации углеводородов в почве, позволяют использовать их для стимуляции аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры при проведении рекультивации земель, загрязненных нефтью и нефтепродуктами.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Скорость самоочищения почвы от нефтепродуктов зависит от ее физико-химических свойств и функционального состояния микробоценоза. Устоявшийся и сбалансированный микробоценоз более устойчив к незначительному (<5%) углеводородному загрязнению и поэтому эффективней справляется с таким стрессом.

2. На появление и распространение фотогетеротрофных бактерий в почвах и грунтах влияют такие факторы, как количество углеводородов, биотический прессинг, численность нефтеокисляющих грибов.

3. Несерные пурпурные бактерии повышают эффективность биодеградации углеводородов, проводя их аэробное окисление или стимулируя основные группы нефтеокисляющих организмов. Между фотогетеротрофными бактериями и нефтеокисляющими грибами возможны мутуалистические взаимоотношения.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на конференциях молодых ученых «Экология: от Арктики до Антарктики», Екатеринбург, 2007; «Экология в современном мире: взгляд научной молодежи», Улан-Уде, 2007 «Биосфера земли: прошлое, настоящее, будущее», Екатеринбург, 2008; «Современные методы и подходы в биологии и экологии», Уфа, 2008; III Всероссийская научно-практическая конференция «Проблемы экологии Южного Урала», Оренбург, 2007;

По теме диссертации опубликовано 5 работ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. ЭКОЛОГИЯ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ.

ВЫВОДЫ.

1. Скорость самоочищения почвы и грунта от углеводородов при экспериментальном загрязнении различна. Полное освобождение исследованной почвы от загрязнения дизельным топливом <5% произошло за один сезон (120 дней), грунта — за три сезона (более 800 дней). Микробоценоз почвы более устойчив к исследованному загрязнению и не меняет своих качественных характеристик, а количественные меняются незначительно и кратковременно. В микробоценозе грунта при загрязнении нефтепродуктами прослеживаются четкие сукцессионные изменения: подавляющее доминирование нефтеокисляющих бактерий => снижение численности НОБ и развитие нефтеокисляющих грибов => появление несерных пурпурных бактерий.

2. На появление и распространение фотогетеротрофных бактерий в почвах и грунтах влияют следующие факторы: количество углеводородов, биотический прессинг (пурпурные бактерии — стресс-толеранты), численность нефтеокисляющих грибов.

3. Наиболее эффективными деструкторами углеводородов в почве являются аэробные нефтеокисляющие бактерии и нефтеокисляющие грибы. Нефтеокисляющие бактерии проявляют антагонистическое влияние в отношении грибов. Между нефтеокисляющими грибами и пурпурными бактериями существуют мутуалистические связи.

4. Фотогетеротрофные бактерии увеличивают скорость биодеградации нефтепродуктов и в почве, и в грунте. Это увеличение может происходить как за счет прямого аэробного окисления углеводородов самими фототрофными бактериями (при загрязнении <5%), так и благодаря их положительному влиянию на углеводородокисляющие способности других групп микроорганизмов. На основе лабораторных экспериментов установлено, что наиболее сильно фотогетеротрофные бактерии стимулируют деятельность нефтеокисляющих грибов. Полученные данные свидетельствуют о возможности использования культур несерных пурпурных бактерий при проведении рекультивации нефтезагрязненных земель.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

В ходе проведенной работы показано, что, в зависимости от типа почвы, скорость самоочищения от углеводородов может быть различной. Это подтверждается и литературными данными. Калюжин В. А. и Коломытцев Е. О. показали, что за тридцать суток процент деструкции нефти в торфе составил 65%, в песке — 52.2%, в глине — 34%, в почве — 36%. Результат эксперимента показал, что наиболее эффективно деструкция протекает в торфе. В песке деструкция протекает в 1,1 раза медленнее, а в глине и в почве — в 1,8 раз (Калюжин, Коломытцев, 2000). В работе Маркез-Роча с соавторами (Biodegradation of Diesel., 2001) за 5 недель содержание дизельного топлива в почве без дополнительного внесения бактериального консорциума уменьшилось на 15%. За 150 дней в коричневой иловато-суглинистой почве typic Hapludalf деградировало 47% углеводородов, при начальном загрязнении 6000 мг/г сухой почвы (Effects of nutrient., 2005).

Это связано с тем, что различные почвы обладают различным, свойственным для них микробным потенциалом к деградации углеводородов (Microbial communities in., 2002). Так, в нашей работе, почва, не подверженная антропогенному воздействию, имела сложившийся и устойчивый микробоценоз, который лучше справился с небольшим углеводородным загрязнением, чем микробоценоз грунта, образовавшегося чуть более 20 лет назад. Поэтому скорость убыли углеводородов в почве превосходит таковую в грунте. Полное очищение от низкомолекулярных углеводородов дизельного топлива грунте заняло 3 сезона (более 800 дней), а почвы 1 сезон (120 дней).

Менее доступные для микроорганизмов углеводороды, содержащиеся в отработанном моторном масле и, в качестве присадок, в дизельном топливе марки «зимнее», остались не деградированными как в грунте, так и в почве. Именно малая скорость деградации высокомолекулярных метано-нафтеновых, ароматических и полиароматических углеводородов, для большинства из которых известны, главным образом, кометаболические пути биодеградации, определяет продолжительное время полного самоочищения почв при нефтяном загрязнении (Гузев, Левин, 1989).

Внесение культуры пурпурных несерных бактерий увеличивало степень самоочищения от углеводородов как почвы, так и грунта. Это увеличение может быть объяснено двумя причинами. Во-первых, при незначительном загрязнении углеводородами (до 5%) имеет место прямое аэробное окисление нефтепродуктов фототрофными бактериями. Это предположение подтверждают наши лабораторные эксперименты и опыты, проведенные С. В. Драчуком (Драчук, 2004), в которых была показана способность к аэробному росту в темноте на среде с дизельным топливом в качестве единственного источника углерода и энергии у одного штамма Rhodopseudomonas acidophila и двух штаммов Rhodopseudomonas palustris. С увеличением содержания углеводородов в почве усиливается анаэробиоз и аэробное усвоение углеводородов пурпурными бактериями ингибируется. Это происходит из-за обволакивания нефтепродуктами почвенных частиц, на которых адсорбированы бактерии. Создающаяся пленка углеводородов препятствует поступлению кислорода к бактериям. Нефтеокисляющие грибы, обладая воздушным мицелием, преодолевают такой барьер, получая кислород в незаполненных порах. Поэтому способны к аэробному усвоению углеводородов при большей степени загрязнения, чем фототрофные бактерии. Во-вторых, культура пурпурных бактерий может косвенно влиять на интенсивность деградации нефтепродуктов, стимулируя основные группы нефтеокисляющих микроорганизмов. Так, Драчу ком установлено, что присутствие азотфиксирующих фотогетеротрофных пурпурных бактерий компенсирует недостаток азота в среде оказывает положительное влияние на окисление углеводородов аэробными гетеротрофными бактериями Dietzia maris (Драчук, 2004). Тен с сотрудниками показали, что добавление жидкой культуры фотосинтетических бактерий в почву облегчает разрушение нефтепродуктов, а так же стимулирует рост углеводородокисляющих микроорганизмов (Effect of Photosynthetic., 2004). Гусев с соавторами обнаружили, что присутствие в водной экосистеме внеклеточных выделений цианобактерий, а так же самих клеток оказывает положительное влияние на процесс биодеградации дизельного топлива (Влияние выделений и., 1982). В наших лабораторных опытах, наибольшее влияние на очищение почвы от углеводородов пурпурные бактерии оказывали в ассоциации с нефтеокисляющими грибами. В случае недостатка азота пурпурные бактерии могут фиксировать молекулярный азот, обогащая почву этим биогенным элементом, что должно положительно сказываться на жизнедеятельности других групп микроорганизмов. Но при высоком содержании связанного азота, очевидно, имеет место и другой механизм стимуляции. С одной стороны, фотогетеротрофные бактерии поглощают из окружающей среды органические кислоты, которые являются продуктами неполного окисления углеводородов грибами и накапливаются в среде при избытке углеводородов, недостатке азота, фосфора, серы (Экскреция метаболитов., 1981), кислорода, тиамина (Ермакова, 1970), определенной кислотности, концентрации железа (Изучение влияния условий., 1975), и могут приводить к субстратному ингибированию ферментных систем окисления углеводородов (Рубан, 1980; Breuil, Kushner, 1980). С другой стороны — эти бактерии могут поставлять грибам необходимые для развития факторы (витамины, аминокислоты, микроэлементы и др.), которые попадают в среду, очевидно, после гибели бактериальной клетки. Этим самым они не только стимулируют метаболизм грибов, но и минимизируют негативное действие нефтеокисляющих бактерий, которое подтверждается динамикой численности грибов и НОБ в лабораторных и естественных условиях. Возможность антагонистических взаимоотношений между прокариотными и эукариотными культурами (вплоть до паразитизма) при росте на углеводородах предполагали так же Яранцева М. М. и Фахрутдинов А. И. (Яранцева, Фахрутдинов, 2007).

Существование фотогетеротрофных бактерий в почве в природных условиях зависит от нескольких факторов. Во-первых, содержание углеводородов, во-вторых, совокупность почвенных условий (развитость микробоценоза, химический состав, влажность и др.). При этом, от почвенных условий зависит принципиальная возможность поселения в них пурпурных бактерий. Основным лимитирующим фактором для развития этих прокариот в незагрязненных почвах и грунтах является биотический прессинг со стороны хищных микроорганизмов и конкурентов за пищевые ресурсы, что объясняется реализацией у пурпурных бактерий такой экологической стратегии как стресс-толерантность, т. е. они являются организмами с низкими конкурентными способностями, в связи с относительно низкой скоростью размножения. Хотя при большом начальном количестве, они могут на длительный срок закрепиться и в незагрязненной почве, однако естественным путем попадание такого числа клеток невозможно.

Среди исследованных нами факторов почвенных условий, для распространения фотогетеротрофных бактерий так же имеет значение численность нефтеокисляющих грибов: высокое содержание нефтеокисляющих грибов, сопровождается, в большинстве случаев, повышенным количеством пурпурных несерных бактерий. Это, очевидно, связано с использованием бактериями продуктов неполного окисления углеводородов грибами.

Пурпурные бактерии обнаружены только в почвах и грунтах, имеющих углеводородное загрязнение (за исключением торфов). Однако углеводороды могут как создать благоприятные условия для заселения почвы или грунта фотогетеротрофными бактериями, подавив деятельность какой-либо из лимитирующих их развитие групп микроорганизмов, так и, наоборот, сделать условия неподходящими для успешного размножения этих бактерий, если концентрация поллютанта будет слишком высока. Потенциально, пурпурные бактерии могут жить в почве, залитой дизельным топливом, но, очевидно, только до момента исчерпания доступной органики, которая в таких условиях может восстанавливаться за счет деятельности сульфат-восстанавливающих бактерий, способных окислять алканы до жирных кислот в анаэробных условиях (Anaerobic Transformation of., 2003). Так же углеводородное загрязнение может никак не повлиять на появление ниши для пурпурных бактерий, если будет недостаточно велико для того, что бы привести к значительным изменениям в микробном сообществе данной почвы.

Таким образом, пурпурные несерные бактерии, не являясь частью автохтонной микрофлоры почв и грунтов, способны занять возникающую нишу, образующуюся при углеводородном загрязнении, и играют важную роль в процессах самоочищения почв и грунтов от этих поллютантов. Они могут прямо влиять на скорость деструкции нефтепродуктов, осуществляя аэробное окисление, либо оказывать косвенное влияние, обогащая почву необходимыми веществами, такими как связанный азот, фосфор, микроэлементы, витамины, аминокислоты и др. и стимулируя тем самым деятельность основных групп нефтеокисляющих микроорганизмов, осуществляющих аэробное или анаэробное разложение углеводородов.

Внесение культур пурпурных несерных бактерий, наряду с другими мероприятиями, может иметь практическое значение при рекультивации нефтезагрязненных почв.