Характеристика реакции кожи при множественном внутрикожном введении лекарственных препаратов

В последнее десятилетие получили широкое распространение инвазивные методы воздействия на кожные покровы, применяемые в дерматологии и косметологии с терапевтическими и эстетическими целями, такие, как мезотерапия, пилинг, дермабразия. В основе их лежит инициация локальной асептической воспалительной реакции в определённых «проблемных» зонах кожи, воспроизводимой с целью активации регенераторных процессов, утрачиваемых с возрастом или под влиянием факторов внешней среды. Известно, что внутрикожное введение препаратов в виде множественных микроинъекций (мезотерапия), сочетая в себе механическое воздействие (микротравма) и эффекты действия препаратов, обеспечивает благоприятные условия для стимуляции клеточного метаболизма и регенерации кожи (Р1б1-ог М., 1976, Ве1г I., Вагоп Н., 1984). В тоже время, характер и особенности течения асептических воспалительных процессов в коже изучены значительно менее подробно, а большинство работ, выполненных в этом направлении, посвящены изучению особенностей, механизмов развития и характеристик формирования воспалительной реакции в коже в условиях инфицирования и при дерматологических заболеваниях. Необходимо отметить, что это касается проблемы исследования механизмов развития воспалительной реакции в целом. До настоящего времени не имеется достаточно чётких критериев характера течения и механизмов развития асептического воспаления, а также особенностей ранней тканевой реакции кожи на локальную травму.

Таким образом, проведение экспериментальных исследований относительно малоизученной тканевой общепатологической реакции, лежащей в основе широко распространенного лечебного метода, представляется важным для более полного понимания особенностей течения асептических процессов в коже при множественных микротравмах и внутрикожном введении препаратов с различным типом действия. Очевидно, что такого рода сочетанное воздействие, оказывая влияние на характер течения и направленность развития локальной воспалительной реакции, лежит в основе достижения положительных результатов, позволяющих прогнозировать эффекты применения мезотерапии.

Высказанные положения позволили сформулировать цель и основные задачи исследования.

Цель исследования:

Выявить морфофункциональные особенности асептического воспаления и репаративных процессов в коже, определить основные характеристики системного ответа на локальное воспаление, моделируемое путём множественного внутрикожного введения лекарственных препаратов.

Задачи исследования:

1. Изучить морфологические изменения в коже на ранних сроках после внутрикожного введения препаратов с провоспалительным и противовоспалительным типами действия.

2. Исследовать активность фагоцитоза в процессе развития местного воспалительного ответа при внутрикожном введении препаратов.

3. Исследовать особенности изменений показателей периферической крови при локальном внутрикожном введении препаратов (общие клинические и биохимические показатели крови, а также интегральные характеристики размерных спектров лейкоцитов).

4. Исследовать активность апоптоза в неповреждённых участках кожи и в областях проведения микроинъекций исследуемых препаратов на ранних сроках развития местной воспалительной реакции.

5. Изучить особенности отёка ткани кожи на ранних этапах развития локальной воспалительной реакции.

Научная новизна.

Впервые показано, что многократные внутрикожные инъекции различных препаратов вызывают локальное асептическое воспаление, течение которого зависит от типа вводимого препарата. Так, введение НК способствует повышению сосудистой проницаемости и персистенции воспалительной реакции в течение всего времени наблюдения (27 суток) с преобладанием альтеративного и экссудативного компонентов, более выраженной по сравнению с применением препарата КК.

Впервые выявлены особенности течения ранних этапов репаративного процесса при использовании препарата КК, которые характеризовались к 27-м суткам развитием четко организованной структуры коллагеновых волокон, вполне соответствующей по архитектонике поверхностным слоям дермы.

Впервые показано, что при внутрикожных введениях НК выявляется прямая корреляционная связь интенсивности апоптоза и активности воспалительной реакции, проявляющейся в увеличении областей инфильтрации кожи и возрастании показателей «кислородного взрыва» в перитонеальных макрофагах.

Выявлено отсутствие сильных корреляционных связей со стороны лабораторных показателей периферической крови, фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов и спектра размеров лейкоцитов крови при множественном внутрикожном введении препаратов.

Методом ЯМР-релаксации протонов тканевой воды в коже при мезодермальном воздействии показано усиление отёка ткани при введении НК преимущественно за счёт увеличения фракции внутриклеточной воды. Выявлены морфофункциональные параллели и корреляционные связи между выраженностью репаративного ответа, интенсивностью апоптоза в коже, степенью развития отёка ткани кожи и активностью фагоцитоза перитонеальных макрофагов при воспроизведении локальной воспалительной реакции.

Практическая значимость работы.

Полученные в работе данные расширяют существующие представления об особенностях течения воспаления, воспроизводимого в лечебных или эстетических целях в здоровой коже, и позволяют оценить особенности её регенерации после микроповреждений и инъекций лекарственных средств на разных этапах воздействия (до 27 суток), что позволяет прогнозировать направленность развития реакций при использовании мезотерапевтического метода в клинической практике. Дана оценка особенностей фагоцитарной реакции, уровня апоптоза, морфометрических показателей кожи и характеристика общего системного ответа на множественные и многократные внутрикожные инъекции, что позволяет сделать вывод о преимущественно локальном характере воспалительного ответа организма при таких воздействиях.

Выявлены преимущественно провоспалительные эффекты действия НК и противовоспалительные эффекты КК на характеристики асептического воспаления в коже на основании исследования её морфо-функциональных особенностей. Показано также, что множественные и многократные внутрикожные инъекции НК вызывают активную воспалительную реакцию с преобладанием альтеративного и экссудативного компонентов, тогда как применение КК сопровождается развитием признаков воспалительного процесса с выраженными явлениями репарации, что свидетельствует о более полноценной регенерации ткани кожи при внутрикожном применении данного препарата. При этом КК вызывает ограниченную по интенсивности и распространенности воспалительную реакцию, не сопровождающуюся какими-либо изменениями со стороны системы крови.

Существенно, что отёк в ткани кожи, уровень фагоцитарной активности и интенсивность апоптоза при введении КК оказались менее выраженными по сравнению с экспериментами, в которых проводили внутрикожное введение НК и физиологического раствора. В экспериментах было показано, что чем менее выражены признаки воспаления, отёк и апоптоз в коже, тем более полноценно протекает регенерация кожной ткани.

Полученные данные дают теоретические основания для применения методов коррекции состояния кожной поверхности в эстетических и лечебных целях, в основе которых лежит воспроизведение локального асептического воспаления (мезотерапия, пилинги), а также позволяют определить основные направления совершенствования способов «управления» течением воспалительного процесса в коже.

Положения, выносимые на защиту.

1. Моделирование асептического воспаления в коже позволяет воспроизвести развитие комплекса типовых местных морфофункциональных реакций, направленность и выраженность которых может быть обеспечена типом действия препаратов и методикой их применения, что позволяет прогнозировать характер развития воспалительной реакциии в коже с целью достижения терапевтического и эстетического эффектов.

2. Внутрикожное введение никотиновой кислоты сопровождается развитием местных реакций, характеризующихся преобладанием в коже альтеративно-экссудативных проявлений и активацией апоптоза, тогда как использование препарата противовоспалительного типа действия КК приводит к развитию ограниченной по своим проявлениям воспалительной реакции и преобладанием признаков активной репарации.

3. Развитие полноценной регенерации проявляется чётко организованным фибропластическим процессом, причём состоятельность регенерации находится в обратной зависимости от проявлений морфологических признаков воспаления, показателей интенсивности апоптоза, фагоцитоза и отёка ткани.

3-ю.

ВЫВОДЫ:

1. Экспериментальное моделирование асептического воспаления в коже методом проведения множественных внутрикожных инъекций позволяет воспроизвести развитие комплекса местных морфофункциональных реакций, направленность и выраженность которых может быть обусловлена типом действия препаратов и методикой их применения, что позволяет прогнозировать направленность течения воспалительной реакции в коже.

2. Внутрикожное введение никотиновой кислоты сопровождается развитием местных реакций, характеризующихся преобладанием в коже альтеративно-экссудативных проявлений и активацией апоптоза, тогда как использование препарата противовоспалительного типа действия (Кутис Композитум) приводит к развитию ограниченной по своим проявлениям воспалительной реакции и появлением признаков репарации уже на ранних стадиях.

3. Множественное внутрикожное введение Кутис Композитум обеспечивает развитие полноценной и состоятельной регенерации, проявляющейся четко организованным фибропластическим процессом, соответствующим нормальной архитектонике поверхностных слоев дермы, причём состоятельность процессов регенерации находится в обратной зависимости от проявлений морфологических признаков воспаления, показателей интенсивности апоптоза, фагоцитоза и отёка ткани.

4. Многократные внутрикожные инъекции никотиновой кислоты, приводя к преобладанию альтеративного и эксудативного компонентов местной воспалительной реакции, персистирующей в течение всего периода наблюдений, сочетается с повышением активности фагоцитоза и значимым увеличением показателей ДНК-фрагментации в ткани кожи, что свидетельствует об активации апоптоза и прямо коррелирует с отёком ткани по данным ЯМР-релаксации протонов тканевой воды.

5. Асептический воспалительный процесс, индуцированный множественными и многократными внутрикожными инъекциями, не вызывает развитие выраженного системного ответа и способствует формированию комплекса местных морфо-функциональных изменений, создающих основу повышения упругости, улучшения тургора и трофики кожи, что составляет основу клинических эффектов мезотерапии.

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ СОБСТВЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ И ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Результаты настоящего исследования, описанные в предыдущей главе, позволяют предположить наличие определённых закономерностей местного реагирования при внутрикожном воздействии, путем множественных инъекций препаратами провоспалительного и противовоспалительного типов действия. Данные, приводимые в работе, показывают, что описанная нами локальная воспалительная реакция в ткани кожи отражает наиболее ранние этапы и механизмы развития воспалительного ответа в здоровой коже.

Основываясь на данных клинического исследования улучшения тургора, эластичности и рельефа кожи при проведении пилингов, дермабразии, мезотерапии, а также литературными данными (Петряева М.А. 1992, Ефимов Е. А., Букина Т. В., Кобзарь В. Е. 1988), направленное внутрикожное терапевтическое воздействие должно вызывать не только интенсивную воспалительную реакцию, но и развитие воспаления с явлениями полноценной регенерации в короткие сроки. В то же время, следует учитывать, что особенности течения воспалительной реакции в коже в ответ на множественные внутридермальные воздействия являются отражением применения лекарственных препаратов, обладающих провоспалительными и противовоспалительными свойствами. В экспериментальном исследовании в качестве вещества, обладающего провоспалительным действием, был выбран препарат НК, в качестве препарата с противовоспалительной активностью — КК. Полученные результаты исследования показали, что множественные внутридермальные инъекции с применением лекарственных средств разных групп способствуют достоверно значимым морфофункциональным изменениям в коже, отражающим преимущественно локальный воспалительный ответ.

Морфологическое исследование кожи в зонах инъекций показало, что изменения эпидермиса и дермы в опытных группах минимально выражены и, по-видимому, отражают динамику асептического воспалительного ответа на повреждение. Это вполне соответствует деликатно проводимой манипуляции с использованием препаратов и может служить дополнительным подтверждением малой травматичности мезотерапевтического метода, что согласуется с литературными данными [ТЫеггее К.А., Мге1еп Б., 1985]. Однако, при проведении экспериментальной работы на протяжении всех сроков исследования, было показано, что, в коже животных при введении исследованных препаратов наблюдаются универсальные проявления острого и подострого воспаления, менее выраженные при физической стимуляции (физиологический раствор). Значительно более существенные в количественном и качественном отношении отличия обнаружены в группах, получавших НК и КК (см. рис. 8−10). При морфометрическом исследовании кожи животных, которым вводился препарат НК, наблюдались воспалительные изменения в коже с преобладанием альтерации и экссудации на всех сроках введения препарата. Эти фазы воспалительной реакции при использовании НК значимо превосходили результаты, полученные в экспериментах, в которых вводили КК и физиологический раствор. Морфологическое исследование показало, что развивающаяся воспалительная реакция в ответ на множественное внутрикожное введение НК носит ограниченный по распространенности характер и персистирует на протяжении всего эксперимента. При мезодермальном введении НК гистоархитектоника коллагеновых волокон в сосочково-ретикулярном слое дермы представлена к большим срокам эксперимента рыхло расположенными, не организованными в компактную слоистую структуру волокнами с редко «разбросанными» в них гистиоцитами и фибробластами. Также, при количественной оценке взаимосвязей морфологических показателей между собой была обнаружена сильная обратная взаимосвязь количества участков, занимаемых коллагеновыми волокнами и отёчными, или разрыхлёнными структурами, что, вероятно, подтверждает более выраженную местную воспалительную реакцию и неполноценные явления регенерации при применении провоспалительных препаратов по сравнению с противовоспалительными на всех сроках исследования.

Данные морфологического исследования животных, получавших НК, согласуются с результатами проведенных физико-химических исследований, характеризующих течение и активность местной воспалительной реакции.

При определении уровня ф-ДНК в клетках кожи, на малых сроках введения препарата НК выявили значительное нарастание показателя активности апоптоза клеток кожи по сравнению с введением других препаратов, что свидетельствует о выраженной активации запуска механизма запрограммированной клеточной гибели при множественном внутрикожном воздействии провоспалительных препаратов. Это подтверждается усилением апоптоза клеток кожи при усилении воспалительной реакции, которая проявляется в увеличении площади, занимаемой инфильтративными участками. Данное предположение согласуется с литературными данными, согласно которым, процесс апоптоза клеток кожи может активизироваться на любое повреждающее воздействие [Лушников Е.Ф., Абросимов А. Ю, 2001]. Эти данные согласуются с результатами показателей ЯМР-релаксометрического исследования протонов тканевой воды в коже. Было показано, что нарастание отёка ткани кожи прямо пропорционально изменяется в соответствии с повышением активности апоптоза клеток кожи. Это обстоятельство также даёт основание предполагать наличие стимулирующих механизмов запуска запрограммированной клеточной гибели в ответ на альтеративно-экссудативные процессы в коже, что, вероятно, происходит при мезодермальном воздействии препаратами провоспалительного ряда (см. рис. 18).

При сравнительной оценке результатов исследования степени развития отёка ткани в ответ на внутрикожное введение НК нами была продемонстрирована прямую зависимость увеличения задержки воды в ткани кожи от активности местной воспалительной реакции, осуществляемое, преимущественно за счёт воды внутриклеточной фракции.

Это находит своё подтверждение в активации апоптоза клеток кожи при усилении внутриклеточного отёка.

При исследовании активности фагоцитоза перитонеальных макрофагов обнаружили, что интенсивность хемотаксиса и продукция активных форм кислорода у животных, получавших НК, была в пределах физиологической нормы на всех сроках исследования. Тем не менее, сравнительный анализ показателей ф-ДНК и результатов исследования «кислородного взрыва» перитонеальных макрофагов выявил прямо пропорциональную зависимость активации апоптоза клеток кожи от нарастания интенсивности фагоцитарной реакции макрофагов при усилении общего воспалительного ответа в ответ на введение НК, что подтверждается литературными данными [Крутецкая З.И., Лебедев O.E., и др, 2001, Овчарук И. Н., Котиков В. А., 1991]. Подтверждением отсутствия системной воспалительной реакции при введении провоспалительных препаратов служат лабораторные показатели периферической крови (клинический и биохимический анализы, а также интегральные характеристики размерных спектров лейкоцитов), демонстрирующие отсутствие системного ответа и позволяющие увидеть тенденции вариаций лабораторных показателей крови в течение всего экспериментального исследования.

Анализ морфофункциональных особенностей течения воспаления на ранних этапах внутрикожного воздействия препаратами с провоспалительным типом действия позволил нам сделать вывод о развитии характерных реакций, свойственных местному пролонгированному асептическому воспалению в коже с явлениями замедленной регенерации.

Результаты экспериментальных исследований, поставленных с применением КК, выражено отличались от данных, полученных при внутрикожном введении НК. Было показано, что применение препарата КК на всех этапах исследования характеризуется минимальными воспалительными изменениями. Воспалительная реакция кожи в ответ на введение КК по сравнению с НК менее выражена и распространена.

РИС. 18. Взаимосвязь показателей ЯМР-релаксации (Т2мсек) и ДНК-фрагментации (маркёр апоптоза) кожи.

О*.

50 40 30 20 10 0.

Повышение отечности г = -0,571 р = 0,009 у = -0,7583х + 50,597 Я2 = 0,9024.

30 40.

Т2, мсек.

РИС. 19. Взаимосвязь маркеров отека ткани: показателей ЯМР-релаксации (Т2мсек) и внеклеточной воды (Ра%).

80 г = 0,553 р = 0,004 70.

60 у = 0,5598х + 48,257 = 0,9785.

Повышение отечности.

30 40.

Т2, мсек.

50 I.

Коллагеновые волокна сосочково-ретикулярного слоя дермы к концу эксперимента характеризуются четкой и плотно упакованной структурой, соответствующие протекающему организованному фибропластическому процессу с явлениями полноценной репарации и регенерации по сравнению с введением НК. Это подтверждается взаимоотношением морфологических структур кожи, которое выявляет уменьшение экссудативного компонента и активацию пролиферативного компонента воспалительной реакции.

При определении уровня апоптоза клеток кожи в ответ на введение КК, наши исследования позволили установить факт снижения активности клеточной гибели, что проявлялось уже на малых сроках исследований. Вероятно, это связано с признаками снижения проявлений местной воспалительной реакции, проявляющейся в уменьшении инфильтрации кожи воспалительными клетками и снижении фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов. Более активная стимуляция апоптоза, вызванная введением КК, относительно группы сравнения, может указывать на активацию сигнальных путей инициации воспалительного процесса, возможно, цитокинового механизма иммунного ответа, запускающего пролиферацию и полноценную регенерацию кожи [Комаревцев В.Н., Комаревцева И. А., Орлова Е. А., 1998].

При изучении степени выраженности тканевого отёка в ответ на введение противовоспалительных препаратов методом ЯМР-релаксометрии протонов водорода тканевой воды кожи было обнаружено, что при применении КК наблюдается снижение отёка кожи до уровня показателей для контрольной группы. Предположительно, это может быть связано со снижением фракции внутриклеточной и увеличением внеклеточной воды в ткани, что, вероятно, подтверждают наличие у КК противовоспалительных свойств уже после проведения первой инъекции препарата (см. рис. 19).

При наблюдении организма животного под системным влиянием препарата КК не было обнаружено достоверных изменений со стороны общего клинического и биохимического анализов крови. Исследование перитонеальной жидкости на предмет выявления особенностей изменения активности фагоцитоза при анализе показателей активности кислородного «взрыва» позволило показать, что данные показателя ф-ДНК уменьшались в зависимости от снижения активности «кислородного взрыва», что может указывать на угнетение препаратом КК воспалительной реакции и снижении активности апоптоза в клетках кожи.

На основании результатов морфофункционального исследования ткани животных, которым вводили КК, было высказано предположение о наличии у препарата КК противовоспалительных свойств, которые проявляются уже на малых сроках экспериментального исследования, что согласуется с данными Фармакологического комитета Минздрава России (см. гл.2). Таким образом, КК может рекомендоваться к широкому использованию как противовоспалительный и активирующий процесс регенерации препарат с целью улучшения упругости, тургора и сглаживания рельефа кожи.

Дополнительным методом, отражающим изменения со стороны периферической крови, стал метод измерения удельной площади поверхности лейкоцитов. Известно, что при использовании стимулирующих препаратов, в частности гомеопатической природы, открываются возможности для триггерной или резонансной активации различных систем организма, а в данном случае — кроветворной. Автоколебательные процессы при гемопоэзе хорошо известны [Colijn С., Makey М. С, 2005, Olsen L.F., Kummer U., Kindzelskii A.L. et al., 2003, Adachi Y., Kindzelskii A.L., Ohno N., ets. 1999]. На них можно воздействовать применением различных лекарственных веществ, в том числе влиять на колебательную стимуляцию лейкопоэза кроветворной ткани. Поскольку множественные внутрикожные инъекции лекарственных препаратов могут, как стимулировать, так и подавлять иммунную систему, замедляя или ускоряя заживление и восстановление ткани колеи в местах инъекций, то знание особенностей реакции периферической крови на множественное внутрикожное воздействие может помочь регулировать течение общего воспалительного ответа.

В проведенном экспериментальном исследовании измерения удельной площади поверхности лейкоцитов периферической крови как при применении препаратов, так и при физическом воздействии, нами удалось выявить выраженные тенденции в активации раннего системного ответа. На основании результатов полученных данных возможно предположить, что множественное внутрикожное введение способствует развитию пролонгированного стимулирующего эффекта на лейкоцитарную фракцию крови на ранних сроках эксперимента. При сравнительном анализе реакции периферической крови на НК и КК обнаруживались тенденции к колебательным изменениям удельной площади поверхности лейкоцитов на протяжении трех выбранных сроков, не сопровождающиеся качественным изменением клеток крови. При этом показали, что первичная реакция крови на введение КК (ранние сроки) является наиболее активной. При изучении системного ответа на НК наблюдалось усиление воспалительного ответа к третьей серии эксперимента. Данные наблюдений, по-видимому,, подтверждают обнаруженные местные изменения и отражают наличие у препарата НК провоспалительных свойств. Исследование системной реакции у контрольной группы позволило сделать вывод об отсутствии изменений со стороны периферической крови, что подтверждает наше представление о преимущественно локальном характере развитии ранней воспалительной реакции в ответ на внутрикожное введение препаратов (см. рис. 14−15) .

При постановке эксперимента с внутрикожными инъекциями физиологического раствора были выявлены тенденции изменений в системной реакции, предположительно, вызванной механической стимуляцией кожи инъекциями, что, по-видимому, представляет собой ответную реакцию организма, которая к поздним срокам воздействия возвращается к исходным данным. Выявленные нами тенденции сопровождаются изменением качественного состава лейкоцитов на средних сроках, что, вероятно, является проявлением стандартной восстановительной реакции подопытных объектов на процедуры, в то время как в группах с НК и КК эти изменения наступали позже (см. рис. 16).

Таким образом, в проведённом экспериментальном исследовании были изучены некоторые особенности течения воспалительной реакции в коже при применении множественного внутрикожного воздействия препаратов провоспалительного и противовоспалительного ряда и вариации течения локальной воспалительной реакции, что обоснованно позволяет моделировать развитие воспаления в здоровой коже. В настоящей работе была сделана попытка продемонстрировать адаптивный характер асептического воспаления, отражающего наиболее ранние этапы и механизмы общего воспалительного ответа, то есть именно ту фазу срочной адаптации кожи к повреждению, которая оказывается в настоящее время менее всего изученной. Это обстоятельство позволяет выделить прикладное и фундаментальное значение исследования, направленного на выявление-закономерностей общего и местного реагирования кожи при её микроповреждениях.