Фитохимическое изучение зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.) флоры Башкортостана и перспективы создания на его основе новых лекарственных средств

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

По данным ВОЗ, во многих странах мира отмечен рост вагинальных инфекций, занимающих ведущее место в структуре гинекологических заболеваний. Это связано с ранним началом половой жизни, частой смене партнеров, бесконтрольным приемом антибиотиков, снижением общего иммунного статуса организма. Чаще всего половая инфекция обусловлена несколькими патогенными факторами — вирусами, микробами, грибами, простейшими.

Традиционное лечение неспецифических воспалительных гинекологических заболеваний не всегда приводит к желаемому результату, т.к. оно зачастую локальное, без функционального, этиопатогенетического подхода, что ведет к недостаточной эффективности, применяемых методов лечения и рецидивам.

Тенденция развития лекарственной терапии последних десятилетий характеризуется значительным использованием в медицине фитопрепаратов. Это объясняется прежде всего тем, что препараты растительного происхождения лучше переносятся больными, обычно не вызывают аллергических реакций и не оказывают побочного действия.

Одним из самых широко используемых лекарственных растений, как в народной, так и в научной медицине при различных заболеваниях является зверобой продырявленный (Hypericum perforatum L.). В последние годы возрос интерес к антрахиноновым пигментам зверобоя продырявленного — гиперицинам, т.к. у гиперицинсодержащих препаратов установлена противомикробная, противовирусная и антиканцерогенная активность. В тоже время, несмотря на широкий изученный спектр фармакологической активности зверобоя продырявленного, число промышленно выпускаемых официнальных препаратов из него весьма ограничено (настойка, экстракт), а противомикробные средства «Иманин» и «Новоиманин» сняты с производства.

Зверобой продырявленный имеет обширную сырьевую базу на территории Республики Башкортостан (РБ) и может служить доступным источником для получения противомикробных препаратов. Это очень важно, т.к. в РБ в настоящее время решается вопрос о расширении ассортимента собственного фармацевтического производства. Поэтому изучение накопления биологически активных соединений (БАС) в растении в условиях данного региона и предложение методов стандартизации сырья и препаратов зверобоя продырявленного по содержанию антрахиноновых пигментов является актуальной задачей.

Перспективным также является разработка рациональной лекарственной формы на основе зверобоя продырявленного для комплексного лечения вагинальных инфекций, обладающей противомикробным, противовирусным, иммуномодулирующим, противовоспалительным действием.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью исследования является фитохимическое изучение зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.), произрастающего на территории Башкортостанаизыскание дополнительных методов стандартизации сырья и разработка нормативной документации на сухой полиэкстракт зверобоя продырявленного, а также создание оптимальной лекарственной формы на основе полученного полиэкстракта. В связи с этим, предстояло решить следующие задачи:

• провести фитохимическое исследование зверобоя продырявленного флоры Башкортостана и предложить методы стандартизации по количественному содержанию гиперицинов;

• провести фитохимическое исследование сухого полиэкстракта зверобоя, предложить методы его стандартизации по гиперицинам и сумме флавоноидовразработать нормативную документацию на сухой полиэкстракт зверобоя как субстанцию для получения противомикробных лекарственных средств;

• изучить возможность получения рациональной лекарственной формы на основе сухого полиэкстракта зверобоя и предложить методы ее стандартизации.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Изучен состав основных БАС травы зверобоя продырявленного флоры Башкортостана, свидетельствующий о его доброкачественности и возможности использования в качестве источника для получения противомикробных средств. Выделены и идентифицированы: флавоноиды — рутин, кверцетин, лютеолин, гиперозидантраценпроизводные — гиперицин, псевдогиперицинфенилпропаноиды — кофейная и хлорогеновая кислотыкумарин — умбеллиферон. Предложен метод количественного определения гиперицинов для дополнительной стандартизации сырья зверобоя продырявленного, а также сухого полиэкстракта зверобоя.

Впервые с использованием современных методов анализа изучен качественный состав эфирного масла травы зверобоя продырявленного флоры Башкортостана. Идентифицировано 85 компонентов и установлено, что в составе эфирного масла преобладают сесквитерпеновые углеводороды, из которых в максимальном количестве содержится кариофиллен оксид.

Впервые изучен химический состав сухого полиэкстракта из травы зверобоя продырявленного. Выделены и идентифицированы 7 индивидуальных соединений, относящихся к группе флавоноидов (рутин, кверцетин, лютеолин, гиперозид), фенилпропаноидов (хлорогеновая и кофейная кислоты), кумаринов (умбеллиферон), антраценпроиз водных (гиперицин, псевдогиперицин).

Теоретически и экспериментально, с использованием метода математического планирования (латинский квадрат без повторных опытов), обоснована возможность получения лекарственной формы на основе сухого полиэкстракта зверобоя для применения в гинекологии — пенообразующие вагинальные таблетки. Установлены их показатели качества и срок хранения.

СВЯЗЬ ЗАДАЧ ИССЛЕДОВАНИЯ С ПРОБЛЕМНЫМ ПЛАНОМ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Башкирского государственного медицинского университета по проблеме «Фармакология и фармация» и является фрагментом исследований кафедры фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии (номер государственной регистрации № 1 990 003 625), государственной научно-технической программы Республики Башкортостан. «Государственные приоритеты здоровья населения республики Башкортостан. Профилактика заболеваний и здоровый образ жизни» (номер государственной регистрации № 1 200 012 029).

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Обоснована целесообразность использования зверобоя продырявленного флоры Башкортостана в качестве источника доброкачественного сырья для получения лекарственных препаратов.

Методика количественного определения гиперицинов апробирована, в работе ЗАО «Фармацевтическая Компания «Бионорм» и рекомендована для включения в нормативную документацию (приложение 5).

На основе полученных результатов разработаны проекты фармакопейных статей предприятия «Herba Hyperici — трава зверобоя», «Extractum Hyperici siccum — экстракт зверобоя сухой»,. «Tabuletta spumatae vaginalia cum extracto Hyperici sicco 0,2 — таблетки вагинальные с экстрактом зверобоя сухим 0,2» (приложение 2).

Осуществлен выпуск опытной партии пенообразующих вагинальных таблеток с полиэкстрактом зверобоя сухим (приложение 6).

Результаты исследований используются в научных исследованиях и учебном процессе на кафедре фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии Башкирского государственного медицинского университета (приложение 4).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на научной конференции студентов и молодых ученых БГМУ (Уфа, 2001 — 2004 гг.) — VI Международном съезде «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (Санкт-Петербург, 2002) — научно-практической конференции посвященной 20-летию фармацевтического факультета БГМУ (Уфа, 2002) — региональной научно-практической конференции «Технология выращивания и использование лекарственных культур» (Уфа, 2003) — на совместном заседании кафедры фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии, фармацевтической химии с курсами аналитической и токсикологической химии, управления и экономики фармации, технологии лекарственных форм с курсом биотехнологии (Уфа, 2005).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 9 работ, в которых отражены основные результаты исследования.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ.

1. С помощью качественных реакций и хроматографических исследований изучен состав БАС травы зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.) флоры Башкортостана. Выделены и идентифицированы флавоноиды рутин, гиперозид, лютеолин, кверцетин, гиперицин и псевдогиперицин, хлорогеновая и кофейная кислоты, умбеллиферон.

2. Модифицированы методики количественного определения коричных кислот и гиперицинов в траве зверобоя.

3. Количественное содержание основных групп БАС в траве зверобоя продырявленного флоры Башкортостана составило: флавоноидов, в пересчете на рутин (4,89% - 5,16%), гиперицинов (0,08% - 0,09%), дубильных веществ (4,94% - 5,10%), коричных кислот (0,24% - 0,26%).

4. Впервые методом ГЖХ в сочетании с масс-спектрометрией изучен качественный состав эфирного масла зверобоя продырявленного (Hypericum perforatum L.) флоры Башкортостана. Индентифицировано 85 компонентовосновным является кариофиллен оксид (11,60% в составе эфирного масла). Определены оптимальные условия количественного определения эфирного масла в траве зверобоя продырявленного (0,130,17%).

5. Впервые изучен качественный состав сухого полиэкстракта зверобоя продырявленного. Выявлено содержание в нем флавоноидов рутина, гиперозида, лютеолина, кверцетина, гиперицина и псевдогиперицина, конденсированных дубильных веществ, хлорогеновой и кофейной кислоты, умбеллиферона. Установлено количественное содержание основных групп БАС сухого полиэкстракта зверобоя продырявленного: флавоноидов, в пересчете на рутин (15,01% - 15,43%), гиперицинов (1,02% -1,07%), дубильных веществ (9,89% - 10,01%), коричных кислот (2,27% - 2,34%). Предложены методы стандартизации сухого полиэкстракта зверобоя по количественному содержанию гиперицинов (не менее 0,8%) и флавоноидов, в пересчете на рутин (не менее 13,0%).

6. Впервые получены пенообразующие вагинальные таблетки (ПВТ) с сухим полиэкстрактом зверобоя. Методом математического планирования (латинский куб без повторных опытов) установлен оптимальный состав вспомогательных веществ для получения таблеточной массы и проведена стандартизация ПВТ по следующим показателям: распадаемость (не менее 15 мин), пенообразование (не менее 45 мл), прочность (не менее 4 Н), время полужизни пены (не менее 40 мин), содержание флавоноидов, в пересчете на рутин (не менее 25,0%), содержание гиперицина (не менее 1,0 мг). С помощью метода «ускоренного старения при повышенной температуре» определен срок хранения ПВТ, при котором не происходит изменения показателей качества (3 года).

7. Разработаны проекты ФСП: «Herba Hyperici — трава зверобоя», проект распространяется на траву зверобоя продырявленного как сырье для получения сухого полиэкстракта зверобоя- «Extractum Hyperici siccumполиэкстракт зверобоя сухой», проект распространяется на сухой полиэкстракт зверобоя продырявленного как субстанцию для получения противомикробных препаратов- «Tabuletta vaginalia spumatae cum extracto Hyperici sicco 0,2 — таблетки вагинальные пенообразующие с полиэкстрактом зверобоя сухим 0,2».

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обобщение и анализ научной литературы показали, что Hypericum perforatum L. является широко распространенным растением, химический состав которого достаточно подробно изучен и отличается большим разнообразием БАС. Однако для подтверждения высокого качества сырья флоры Башкортостана и дополнения показателей его доброкачественности необходимо провести детальное исследование основных групп БАС травы зверобоя продырявленного из различных районов республики.

Применение лекарственных средств из травы зверобоя в России ограничивается использованием настойки, экстрактов и сборов. Создание новых и совершенствование известных лекарственных форм на основе зверобоя продырявленного, разработка современных методов их стандартизации, расширение возможностей применения, в том числе в гинекологии, является актуальным.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объекты исследования Объектами исследования служили трава зверобоя продырявленного (Herba Hyperici) и полученный нами из нее сухой полиэкстракт — по технологии, представленной в патенте на изобретение № 2 067 452 «Способ получения экстракта зверобоя» А 61 К 35/78 от 15.12.93.

Образцы лекарственного растительного сырья для фитохимического анализа и изготовления сухого полиэкстракта были собраны в фазу цветения в типичных местообитаниях в различных районах Республики Башкортостан (2001 — 2003 гг.): Уфимском (серия № 1), Стерлитамакском (серия № 2), Гафурийском (серия № 3), Архангельском (серия № 4), Кармаскалинском (серия № 5), Сырье хранилось в соответствии с требованиями нормативной документации (ГОСТ 6077−80, ОСТ 64−070−89 и ГФ СССР XI изд.) при комнатной температуре, в сухом, хорошо вентилируемом помещении, не зараженном амбарными вредителями, без прямого попадания солнечных лучей.

При разработке оптимального состава и технологии пенообразующих вагинальных таблеток использовались материалы, качество которых соответствовало требованиям нормативной документации: сахар молочный (ГФ СССР X изд., ст. 589) — магния стеарат (ТУ 6−09−129) — натрия гидрокарбонат (ГФ СССР X изд., ст. 430) — кислота лимонная (ГОСТ 3652) — кислота аскорбиновая (ФС 42−2668−65) — кислота винная (ГОСТ 5817−77) — метиленхлорид (ТУ 952 456−93) — эмульгатор № 1 (ФС 42−1596−81), а также сухой полиэкстракт из травы зверобоя.

2.2. Методы исследования Качественный, количественный анализ и идентификацию природных биологически активных соединений, содержащихся в объектах исследования, проводили с использованием современных методов фитохимического анализа: хроматографического (на бумаге, в тонком слое сорбента, хромато-масс-спектрометрического, ГЖХ, в том числе и в сочетании с масс-спектрометрией), спектрофотометрического и др. Элементный состав сырья и сухого полиэкстракта определяли с помощью электрозондового рентгеноспектрального анализа.

Все расчеты вели на абсолютно сухое сырье.

В соответствии с требованиями к качеству лекарственного растительного сырья определялись числовые показатели травы зверобоя с использованием методик ГФ СССР XI изд.: влажность (ч. 1, с. 285- ч. 2, с. 161) — общая зола (ч. 2, с. 24) — степень измельченности и содержание примесей (ч. 1, с. 275). Для полиэкстракта, полученного нами из травы зверобоя определяли влажность (ч. 1, с. 285- ч. 2, с. 161) — общую золу (ч. 2, с. 24) — содержание тяжелых металлов в экстрактах (ч. 2, с. 161).

2.2.1. Методы качественного анализа биологически активных соединений Качественные реакции на флавоноиды, общие для всех фенольных.

•" 1 ч/ соединении и специфические, позволяющие установить тип соединении и некоторые особенности структуры, проводили по известным методикам [9, 33,42].

Для проведения качественных реакций на флавоноиды из травы зверобоя продырявленного готовили очищенный экстракт [9, 42]: навеску сырья экстрагировали при соотношении сырья и экстрагента 1:10 96% этиловом спирте на кипящей водяной бане с обратным холодильником в течение 30 мин. Спиртовое извлечение фильтровали, упаривали, густой остаток растворяли в горячей воде и очищали от аликвотной фракции экстракцией хлороформомв водном остатке осаждали танниды 5% раствором желатина и полученное извлечение экстрагировали этилацетатом, который затем отгоняли под вакуумом на ротационном испарителе ИР1-М2. Сухой остаток растворяли в 96% этиловом спирте и использовали для качественных реакций.

Обнаружение гиперицинов в траве зверобоя проводили в этилацетатном извлечении, полученном по выше описанной методике, с помощью концентрированной серной кислоты. При наличии гиперицинов раствор окрашивается в желто-зеленый цвет [49].

Качественное обнаружение. дубильных веществ проводили по известным методикам в водном (1:10) извлечении травы зверобоя продырявленного (реакция с желатином, формальдегидом и раствором хлорида железа (III)) [33].

Для. установления присутствия кумаринов использовали реакции, основанные на образовании окрашенных растворов с диазокрасителями, образовании лактонов и способности флуоресцировать в УФ — свете [52].

Очищенную сумму кумаринов для анализа получали следующим образом: 25,0 г травы зверобоя экстрагировали 100,0 мл 96% этиловым, спиртом на водяной бане с обратным холодильником в течение двух часов. Извлечение сгущали под вакуумом, очищали с помощью 0,5% водного, а затем 0,5% водноспиртового раствора калия гидрооксида. Водно-щелочной раствор разбавляли водой (1:6) и липофильные вещества удаляли диэтиловым эфиром, затем экстракт подкисляли 2,0% раствором соляной кислоты и смесь кумаринов и органических кислот извлекали диэтиловым эфиром! В делительную воронку с обеими фазами по каплям прибавляли 0,5% водный раствор калия гидроксида (для удаления кислотной фракции), эфирную фракцию с кумаринами отделяли, растворитель отгоняли. Остаток растворяли в 96% этиловом спирте и использовали для анализа-[53].

Качественное обнаружение коричных кислот проводили хроматографическим методом (на бумаге и в тонком слое сорбента).

Для установления элементного состава в золе использовали электрозондовый анализатор JEOLJXA 6400 с приставкой энергодисперсионного анализа Nozan [87]. Для этого около 1,0 г (точная навеска) травы зверобоя продырявленного и около 0,5 г (точная навеска) сухого полиэкстракта зверобоя сжигали и прокаливали в течение 4 часов при Хроматографические исследования Хроматографическое исследование травы зверобоя и сухого полиэкстракта зверобоя проводили методами восходящей одномерной и двумерной хроматографии на бумаге (БХ), бумага — хроматографическая Санкт-Петербургской фабрики № 2 марки «С» и «М" — в тонком закрепленном слое сорбента (ТСХ) — на пластинках «Silufol», «Silufyx» (Чехия) [27, 52, 56, 82, 100]. При необходимости через хроматограмму повторно пропускали разделяющую систему, что обеспечивало более четкое разделение при близких значениях Rf.

Для хроматографического исследования сумму флавоноидов из травы зверобоя получали последовательной экстракцией 40%, 70% и 96% этиловым спиртом (по типу полиэкстракта) для наиболее полного извлечения всех групп флавоноидов. Полученные извлечения объединяли, сгущали, освобождали от липофильной фракции хлороформом и обрабатывали этилацетатом и н-бутанолом [42].

Для анализа гиперицинов сырье предварительно обрабатывали хлороформом и экстрагировали 70% этиловым спиртом, последний отгоняли и водный остаток обрабатывали этилацетатом. Полученное извлечение использовали для хроматографирования [49].

Коричные кислоты извлекали горячей водой из сырья освобожденного от липофильной фракции хлороформом. Экстракцию повторяли трижды. Водные извлечения объединяли, охлаждали до комнатной температуры и фильтровали через бумажный фильтр. Фильтрат трижды обрабатывали диэтиловым эфиром. Эфирные извлечения объединяли, сушили безводным натрия сульфатом, фильтровали. Эфир отгоняли, сухой остаток растворяли в 96% этиловом спирте и использовали для хроматографирования [74].

Полученную для проведения качественных реакций сумму кумаринов использовали также и для хроматографического анализа.

Для хроматографического исследования сухого полиэкстракта использовали этилацетатные извлечения из 70%, 30% этанольных фракций. Для этого каждую сгущенную водно-спиртовую фракцию обрабатывали этилацетатом и полученные извлечения использовали для хроматографии.

Для выделения суммы флавоноидов из 70% и 30% этанольных фракций полиэкстракта этилацетатные извлечения из этих фракций сгущали под вакуумом на роторном испарителе до полного удаления растворителя. Полученный остаток растворяли в 96% этиловом спирте и использовали для хроматографирования.

Навеску ацетоновой фракции 0,1 г растворяли в 10 мл ацетона и использовали для хроматографирования.

В эксперименте использовались следующие системы растворителей [9, 42,49,52,82]: для хроматографии на бумаге:

1.15% раствор уксусной кислоты.

2. 2% раствор уксусной кислоты.

3. Н-бутанол — уксусная кислота — вода (4:1:5).

4. Н-бутанол — уксусная кислота — вода (3:6:1).

5. Толуол — этилформиат — муравьиная кислота (5:4:1).

6. Хлороформ.

7. Петролейный эфир для хроматографии в тонком слое сорбента:

A. Этилацетат — 85% муравьиная кислота (50:6);

Б. Хлороформ — этиловый спирт (8:2);

B. Этилацетат — этиловый спирт — вода (10:2:1);

Г. Этилацетат — уксусная кислота (8:2);

Д. Бензол — уксусная кислота (5:2);

Е. Этилацетат — н-бутанол — муравьиная кислотавода (5:3:1:1).

Для проявления хроматограмм использовали реактивы: а. Алюминия (III) хлорид, 5% раствор в этиловом спиртеб. Аммиака 25% водный растворв. Железа (III) хлорид, 3% водный растворг. Натрия гидроксид, 10% водный растворд. Диазотированная сульфаниловая кислотае. Натрия гидроксид, 10% спиртовый раствор.

Вещества детектировали просматривая хроматограммы в видимом и УФ-свете, до и после проявления. Для этого использовали ртутно-кварцевую лампу со светофильтром, при длине волны 365 нм.

Для сравнительной хроматографии и идентификации природных веществ использовали аутентичные образцы («свидетели»): кверцетин, гиперозид, рутин, лютеолинкофейную и хлорогеновую кислотыумбеллиферон, полученные из Государственного ботанического сада Сибирского отделения РАН, НПО ВИЛАР, Института органической химии (г. Иркутск).

Выделение индивидуальных веществ и их идентификация Получение индивидуальных соединений группы гиперицинов, флавоноидов, кумаринов и фенилпропаноидов (коричных кислот) проводили методом препаративной хроматографии в тонком слое сорбента силикагеля (пластинки «Silufol UV-254» (Чехия)) [52].

После разделения суммарных экстрактов флавоноидов, кумаринов, гиперицинов и коричных кислот в подходящей системе растворителей хроматограммы детектировали в УФ-свете. Зоны, соответствующие гиперицинам, флавоноидам и коричным кислотам счищали с пластинок. Пятна, имеющие одинаковое значение Rf и сходную окраску (флуоресценцию) в видимом и УФ-свете, объединяли и элюировали этиловым спиртом или другими растворителями.

Индивидуальные вещества очищали многократной кристаллизацией из подходящего растворителя (этиловый спирт, метиловый спирт, их смеси с водой и др.).

Идентификацию всех выделенных веществ осуществляли путем сравнительной хроматографии с аутентичными образцами исследуемых веществ (в том числе пробы смешения), изучением УФ-, хромато-масс-спектров выделенных веществ, установлением температуры плавления.

Исследование УФ-спектров выделенных индивидуальных веществ, а также этанольных, ацетоновых фракций полиэкстракта, полученных по технологической схеме проводили на спектрофотометре марки «Specord-40» (Институт органической химии УНЦ РАН) при аналитически значимых интервалах длин волн:

• для флавоноидов-320−380- 240−270 нм.

• для коричных кислот — 310−340 нм.

• для гиперицинов-530−640 нм Идентификацию осуществляли путем сопоставления масс-спектров электронного удара с базой данных в библиотеке масс-спектров WILEY 275 L и согласно [43, 44].

Температуру плавления изолированных веществ определяли на блоке Кофлера после многократной кристаллизации выделенных индивидуальных веществ из подходящего растворителя.

2.2.2. Методы количественного анализа биологически активных соединений Количественное определение флавоноидов в траве зверобоя продырявленного проводили по методике 1, приведенной в ГФ СССР XI изд. (ст. 52 «Herba Hyperici»).

Определение содержания флавоноидов в сухом полиэкстракте из травы зверобоя осуществляли методом дифференциальной спектрофотомерии на приборе СФ-46 в кюветах с толщиной слоя 10 мм с использование двух методик:

Методика 2 — описанная в ВФС 42−2733−96 «Сухой экстракт из травы зверобоя» [25].

Методика 3 — разработанная Беликовым ВВ. с соавт. [1]. В основе этих методов лежит способность флавоноидов образовывать окрашенный комплекс со спиртовым раствором алюминия хлорида, что приводит к батохромному смещению максимума поглощения УФ-спектра. Расчет количественного содержания флавоноидов в методиках 1, 2 ведется в пересчете на рутин, как на преобладающий и специфичный флавоноид в траве зверобоя продырявленного, а в методике 3 — на один доминирующий в исследуемом сырье флавоноидов, используя коэффициент пересчета, получаемый делением молекулярной массы рутина на молекулярную массу данного флавоноида. Навеска полиэкстракта для анализа (методика 3) рассчитывалась нами с учетом выхода экстрактивных веществ в полиэкстракт.

Количественное определение гиперицинов проводили по методикам 4 [112] и 5 [62], в основе, которых лежит специфическое поглощение в видимой части спектра раствора гиперицина в метиловом спирте при длине волны 590 нм и в этиловом спирте при длине волны 598 нм. В методике 5 измеряют поглощение непосредственно этанольного (50%) извлечения из травы зверобоя продырявленного, а в методике 4 вначале получают ацетоновое извлечение из травы зверобоя продырявленного, которое затем растворяют в метаноле и измеряют оптическую плотность полученного раствора. Данная методика была нами модифицирована (гл. 3.3.).

Содержание дубильных веществ определяли с помощью методики 6 -окислительно-восстановительное титрование раствором калия перманганата [31] и методики 7 — метод комплексонометрического титрования [15, 34], основанный на осаждении дубильных веществ аммиачным раствором окиси цинка (по ГОСТ 4564–70), выделении осадка центрифугированием, разрушении комплекса цинк — дубильные вещества уксусной кислотой и титровании катионов цинка раствором трилона Б в присутствии индикатора — ксиленолового-оранжевого.

Определение количественного содержания суммы фенилпропаноидов (оксикоричных кислот) проводили методом прямой хромато-спектрофотометрии при аналитической длине волны 327 нм по модифицированной нами методике 8 [107].

2.2.3. Методы технологических исследований Объектом технологических исследований служил сухой полиэкстракт из травы зверобоя, полученный нами последовательным экстрагированием навески сырья растворителями с повышением полярности по «Способу получения экстракта зверобоя», разработанному Мухамедзяновым P.M. с соавт. и изложенному в патенте [79].

В качестве технологических показателей для сухого полиэкстракта из травы зверобоя нами были определены — насыпная масса по известной методике [37]- сыпучесть и угол естественного откоса на приборе ВП-12А [2, 37]. Для определения фракционного состава использовали ситовой анализ [30, 101].

Нами была изучена также возможность получения пенообразующих вагинальных таблеток (ПВТ) с полиэкстрактом зверобоя. Установление оптимального состава вспомогательных веществ ПВТ проводили методом математического планирования эксперимента — латинский куб второго порядка без повторных опытов [73].

Механическую прочность ПВТ определяли методом сжатия «на ребро» (перпендикулярно силе прессования) на разрывной машине 2167 Р-50 [73] в лаборатории механики композиционных материалов и конструкций Уфимского государственного авиационного технического университета. Определение распадаемости осуществляли по известной методике (ГФ СССР XI изд. вып. 2, с. 158). Количество пены определяли объемным методом [21]. В полученном растворе, после определения пенообразования используя иономер ИУ ЭВ-74 устанавливали рН водного извлечения [21].

Установление срока годности ПВТ проводили по ОСТ 42−2-72 «Лекарственные средства. Порядок установления сроков годности», а также методом «ускоренного старения» в соответствии с инструкцией И-42−2-82 с использованием термостата ТС-80 М2 [24].

Статистическую обработку экспериментальных данных фитохимических и технологических исследований проводили, используя критерии Стьюдента и Фишера с вычислением граничных значений доверительного интервала среднего результата (Р=95%) и определением ошибки единичного определения при различных значениях «п» по известным методикам [14, 30].

ГЛАВА III. ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ТРАВЫ ЗВЕРОБОЯ ПРОДЫРЯВЛЕННОГО ФЛОРЫ БАШКОРТОСТАНА Как указывалось в главе I, трава зверобоя является перспективным сырьем для получения противомикробных препаратов, фармакологическая активность которых обеспечивается комплексом БАС содержащихся в сырье. Для разработки и последующего внедрения в медицинскую практику новых лекарственных средств необходимо проведение исследований, позволяющих разработать для них нормативы качества. Современные требования к стандартизации лекарственных средств при разработке показателей качества обуславливают использование системной цепи «лекарственное растение — сырье — субстанция — препарат», которая дает возможность объективно обосновывать и разрабатывать характеристики и показатели качества, как сырья, так и лекарственного средства на его основе. Одной из задач данной работы является химическое изучение сухого полиэкстракта зверобоя как субстанции для получения противомикробных препаратов. Источником получения его при разработке и в перспективе для промышленного получения является трава зверобоя, собранная на территории республики Башкортостан, следовательно, проведение полного фитохимического анализа сырья — травы зверобоя продырявленного флоры Башкортостана — является необходимым этапом стандартизации.

3.1. Определение числовых показателей травы зверобоя Одной из характеристик доброкачественности растительного сырья являются такие числовые показатели как влажность, зольность, минеральные и органические примеси, значения которых определяли, используя фармакопейные методы (гл. 2.2.). Результаты исследований представлены в таблицеЗ.1.