Роль опухолевого супрессора р53 в регуляции организации цитоскелета и формы нормальных и опухолевых клеток

Актуальность проблемы.

Одной из важнейших задач клеточной биологии является изучение механизмов морфогенеза клеток, тканей и органов, а также патологических изменений морфогенеза, происходящих в процессе опухолевых превращений. В настоящее время выяснены многие черты клеточных механизмов морфогенека и, в особенности, природа динамики цитоскелетных и адгезионных структур клетки, определяющих эти процессы. Вместе с тем, остается малоизученным вопрос контроля этих цитоскелетных изменений основными регуляторными системами клетки.

Особую роль среди таких регуляторных систем играет система гена и белка р53 — важнейшего регулятора процессов клеточного цикла, апоптоза и дифференцировки. Несмотря на огромное число исследований, посвященных структуре и функции р53, вопрос о связи этой системы с функцией цитоскелета остается неясным. Этот вопрос актуален не только для понимания нормальных механизмов морфогенеза, но и для понимания основных механизмов | канцерогенеза, поскольку в динамике канцерогенеза резко нарушаются как • функция р53, так и функции цитоскелетных систем, в особенности актомиозинового контракгильного аппарата. Одним из особых аспектов этой проблемы является изучение связи изменения активности р53 с так называемыми эпителио-мезенхимальными трансформациями, играющими важнейшую роль в морфогенезе многих тканей, а также при злокачественном превращении клеток. I.

Цели и задачи работы.

Целью настоящей диссертационной работы являлось изучение взаимосвязей между изменением морфологического фенотипа клеток различного происхождения, их цитоскелетных систем, и активностью опухолевого супрес^ора р53.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Изучить, является ли избирательное разрушение цитоскелетных систем -41 актиновых микрофиламентов или микротрубочек — фактором, достаточным для активации р53 в клетках. ч.

2. Изучить изменения морфологического фенотипа клеток в зависимости от экспрессии р53.

3. Изучить феномен мезенхимо-эпителиальной трансформации при воздействии на клетки хелатора железа дефероксамина и выяснить, является ли этот фенотипический переход р53-зависимым. I.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Впервые показано, что нарушение целостности цитоскелетных систем клетки с помощью специфических химических агентов влечет за собой активацию онкосупрессора р53 и остановку клеточного цикла или апоптоз клеток с разрушенным цитоскелетом. Разборка пучков актиновых микрофиламентов с помощью цитохалазина й или микротрубочек с помощью колцемида вела к функциональной активации р53 и, как следствие, к остановке клеточного цикла или апоптозу клеток. В линиях клеток, не содержащих р53 или содержащих функционально неактивный р53, остановка цикла или апоптоз в ответ на разрушение цитоскелетных систем были не выражены. Таким образом, впервые было показано, что патологические изменения морфологии клеток и цитоскелетных систем может приводить к активации р53. Полученные нами данные существенно дополняют и расширяют представления о стрессорных воздействиях, приводящих к активации р53.

Показано, что экспрессия р53 меняет морфологический фенотип клеток. Клетки карциномы, лишенные р53, имели более дисковидную, эпителиоидную морфологию, сопровождающуюся образованием эпителиоидных островков, а I также изменениями цитоскелетных систем. Так, в отличие от исходных, р53-содержащих клеток, в клетках с нокаутированным р53 частично восстанавливались краевые пучки актиновых микрофиламентов, отсутствующие у клеток, экспрессирующих р53. Контактные структуры клеток, лишенных р53, т! акже были более ярко выражены. Так, эти клетки образовывали протяженные тангенциальные адгезионные контакты. Фокальные контакты р53-негативных клеток были более многочисленны, чем у р53-позитивных клеток, и располагались по всему периметру клетки. В целом, такая перестройка цитоскелета и изменение морфологического фенотипа клеток говорит о том, что р53 индуцирует переход клетки к более мезенхимальному фенотипу.

Показано также, что переход клеток от фибробластоподобного к «эпителиоидному фенотипу, т. е. мезенхимо-эпителиальная трансформация, может быть вызвана добавлением к культурам хелатора железа дефероксамина, и что I эта морфологическая трансформация не зависит от экспрессии р53 в клетках. В сравнительных опытах с воздействием дефероксамина на клетки, экспрессирующие р53 дикого типа и клетки, где р53 был так или иначе инакгивирован, мы показали, что индукция мезенхимо-эпителиальной ' трансформации не зависит от экспрессии р53.

Таким образом, установлены многообразные реципрокные связи между экспрессией р53 и динамическими перестройками цитоскелета, в том числе, участвующими в мезенхимо-эпителиальной трансформации. Исследование участия р53 в контроле морфологического фенотипа и цитоскелетной организации клеток приобретает все большее значение. Понимание роли р53 в этих процессах может привести к более полному пониманию механизмов канцерогенеза. В • частности, полученные нами данные о таких взаимодействиях могут оказаться ценными для разработки новых методов нормализации морфологического фенотипа и предотвращения процесса инвазии. I.

Обзор литературы.

В соответствии с задачами работы в обзоре литературы рассмотрены основные данные, касающиеся различной формы клеток и цитоскелетных структур, играющих главную роль в динамике этой морфологической организации. В первой части обзора мы разберем организацию двух типов клеток — эпителия и мезенхимальных клеток (фибробластов). Далее будут рассмотрены данные о механизме взаимных переходов между этими двумя типами организации, а также возможная роль р53 в этих переходах.

Выводы.

1. Дезорганизация актинового компонента цитоскелета специфическим ингибитором (цитохалазином) приводит к активации опухолевого супрессора р53. Эта активация, в свою очередь, ведет к различным последствиям, характерным для повышенной экспрессии этого опухолевого супрессора: остановке клеточного цикла в фазе или апоптозу.

2. Деполимеризация системы микротрубочек специфическим агентом (колцемидом) приводит, наряду с характерными нарушениями митоза и структуры ядер, к активации р53. Следствием такой активации является остановка клеточного цикла в фазе Э1.

3. Полученные данные показывают, что разрушение каждого из основных компонентов цитоскелета — актин-миозиновой системы и системы микротрубочек — приводит к сходному повышению активности опухолевого супрессора р53. Эти данные существенно расширяют представление о спектре нарушений внутриклеточного гомеостаза, вызывающих активацию этого супрессора.

4. Клетки карциномы с нокаутированным р53 резко отличаются по своей морфологии и цитоскелетной организации от гомологичных клеток, экспрессирующих р53. Клетки без р53 имеют морфологию эпителиоидного типа, тогда как клетки с р53 — морфологию типа поляризованных фибробластов. Таким образом, между активностью опухолевого супрессора р53 и цитоскелетной организацией имеется взаимозависимость: эта активность зависит от структуры цитоскелета, но и в свою очередь регулирует эту структуру.

5. Дефероксамин, удаляющий железо из цитоплазмы, вызывает переход клеток от фибробластоподобной к эпителиоидной цитоскелетной структуре и морфологии. Такой переход протекает сходным образом как в клетках с активным р53, так и в клетках, где эта активность подавлена введением генетичского супрессорного элемента или нокаутом.

Суммируя полученные данные, можно заключить, что структура цитоскелета и активность р53 реципрокно регулируют друг друга. Вместе с тем, определенные перестройки морфологии клеток (переход от поляризованной к эпителиоподобной структуре) могут осуществляться как при участии р53, так и без такого участия. Поскольку поляризованная структура клетки может способствовать опухолевой инвазии, полученные данные существенно раширяют представления о механизмах возникновения злокачественного инвазивного фенотипа в процессе канцерогенеза.

Заключение

.

В этой работе мы рассмотрели взаимодействие белка-онкосупрессора р53 и цитоскелетных систем: актиновых микрофиламентов и микротрубочек. Эти цитоскелетные системы определяют форму клетки, ее подвижность, а также образование адгезионных структур. Белок р53 является центральным компонентом сигнальных каскадов, активирующихся в ответ на клеточный стресс. Нам удалось показать, что нарушение целостности каждой из цитоскелетных систем, ведущее к изменениям формы клетки, является фактором, достаточным для активации защитной клеточной системы, приводимой в действие р53. Ранее было показано, что р53 активируется в ответ на генетические нарушения, являясь, таким образом, своеобразным «стражем генома». Выявленная нами в различных клеточных системах активация функции р53 при различных цитоскелетных нарушениях существенно дополняет и расширяет круг стрессорных воздействий на клетку, меняющих экспрессию этого гена. р53 можно считать не только «стражем генома», но и стражем всей внутренней организации клетки, в том числе цитоскелетных систем.

Во второй части работы нам удалось показать, что отношения между р53 и цитоскелетными системами являются реципрокными — с одной стороны, нарушение цитоскелетных систем влияет на активность р53- с другой стороны, активность р53 влияет на организацию цитоскелета и морфологический фенотип клеток. В наших экспериментах с клетками карциномы мы наблюдали изменение формы клеток с фибробластоподобной на эпителиоидную при нокауте р53.

В третьей части работы мы рассмотрели переход между эпителиодной и фибробластоподобной формами клеток, поскольку указанные данные свидетельствовали о возможной связи р53 с переходом между мезенхимальной и эпителиоидной структурой. В этой серии экспериментов мы исследовали вопрос о том, является ли такое изменение экспрессии р53 необходимым условием со всех случаях МЭТ. Для этого анализа мы использовали обнаруженный нами феномен: индукцию мезенхимо-эпителиального перехода под действием ОРО, который удаляет железо путем комплексообразования из внутриклеточного пула. В нашей опытной системе, в которой добавление к клеткам карциномы ОРО вызывало драматический сдвиг клеточной формы в эпителиоидном направлении, роль р53 оказалась не столь значимой. Клетки, лишенные р53 и имеющие более эпителиодную морфологию, после обработки DFO не отличались от своих фибробластоподобных предшественников. Клетки обеих линий сильно распластывались и образовывали эпителиоподобные островки. Тогда, чтобы исключить возможность частичной реверсии трансформированного фенотипа под действием DFO, мы повторили эти эксперименты, используя линию фибробластов, то есть клеток совершенно другого происхождения и другой цитоскелетной организации. Результаты оказались сходными — мы наблюдали явный морфологический сдвиг в сторону эпителиоидного фенотипа вне зависимости от активности р53 в клетках. Оказалось, что подавление функциональной активности р53 с помощью генетического супрессорного элемента GSE22 не влияло на переход фибробластоподобных клеток в сторону эпителиоидного фенотипа, вызываемого инкубацией с DFO. Таким образом, р53, по-видимому, участвует в определенных, но не во всех сигнальных путях, модулирующих переходы между фибробластоподобным и эпителиоидным фенотипом. Как уже отмечалось (см. гл 3 раздела Результаты), действие DFO, вероятно, связано с уменьшением количества активных форм кислорода (ROS) в клетке. С другой стороны, накапливающиеся в последнее время данные указывают на существенное значение ROS в морфологической неопластической трансформации. Как показывают полученные нами данные, эти перестройки могут проходить, по-видимому, разными путями: с участием изменения экспрессии р53 и без такого участия. В частности, такие перестройки возможны в неопластических клетках, многие из которых лишены активного гена р53. Таким образом, многообразные связи между активностью р53 и организацией цитоскелетной системы могут иметь существенное значение как для физиологических морфологических реакций, так и для канцерогенеза, в частности для процесса инвазии.