Анализ ассоциаций полиморфных вариантов митохондриального генома и гена митохондриальной гамма ДНК-полимеразы с фенотипами сердечно-сосудистого кантинуума

Актуальность. Все многообразие признаков, определяющих фенотип, является следствием взаимодействия генотипа и окружающей среды. В процессе приспособления к условиям среды формируются фенотипические особенности, которые находят отражение в закреплении адаптивных локусов в. геноме человека, представленном двумя составляющими: ядерной и митохондриальной. Митохондриальный геном, представленный кольцевой молекулой ДНК кодирует компоненты электрон-транспортной цепи. Полная нуклеотидная последовательность митохондриальной ДНК (мтДНК) человека была определена в 1981 г [Anderson S. et al., 1981]. Митохондриальный геном может служить моделью для изучения генетических особенностей формирования количественных признаков и мультифакториальных заболеваний (МФЗ). Этому способствует ряд особенностей мтДНК. Во-первых, устраняется проблема определения гаплотипа, так как все кандидатные гены находятся в одной молекулево-вторых, в результате отсутствия рекомбинации гаплотипы сохраняются неизменными в ряду поколений [Wallace D.C., 1982; Chen X.J., Butow R.A., 2005]. Наличие доступных баз данных с описанием полных последовательностей мтДНК, принадлежащих к различным ветвям филогенетического древа, упрощает процедуру поиска функциональных полиморфизмов. Актуальность заключается также в том, что «.описание функций генома митохондрий представляет собой в миниатюре цель, которая стоит перед исследователями ядерного генома» [McKusick V.A., 1988].

Активное изучение митохондриального генома в 90-х годах 20-ого века позволило выделить целый класс болезней, в основе которых лежат мутации генов мт генома [Fernandez-Moreno М.А. et al., 2000]. Мутации мтДНК вызывают тяжелые наследственные синдромы, при которых наиболее часто поражаются органы нервной, мышечной и сердечно-сосудистой систем [Chinery P.F. et al., 1999; Di Mauro S., 2004]. Однако есть данные и об участии распространенных вариантов мтДНК в формировании особенностей количественных признаков. Среди исследованных фенотипов, для которых найдены ассоциации с полиморфизмом мтДНК — болезнь Паркинсона, атаксия Фридрейха, долгожительство, уровень липидов крови, интервальные оценки ЭКГ, инсульт, сахарный диабет, болезнь Альцгеймера, кардиомиопатия, различные виды онкологических заболеваний [Фрейдин М.Б. и др., 1999; Пузырев В. П. и др., 2001; Hegele R.A. et al., 1996; Khogali S.S. et al., 2001; Finnila S. et al., 2001; Ross O.A. et al., 2001; Poulton J. et al., 2002; Coskun P.E. et al., 2003, 2004; Dato S. et al., 2004; Guo X.G. et al., 2005]. Существует гипотеза, что не только генетический дрейф, но и отбор формировал разнообразие мтДНК в популяциях человека [Mishmar D. et al., 2002; Kivisild Т. et al., 2006]. Это позволяет предположить возможную связь между полиморфными участками мтДНК и различными патогенетически важными для развития заболеваний эндофенотипами.

Несмотря на независимость от репликации ядерной ДНК, функционирование мтДНК требует участия ряда белков, кодируемых ядерным геномом [Stuart J.A., Brown M.F., 2006]. Единственной полимеразой млекопитающих, участвующей в процессах транскрипции и репликации мтДНК является митохондриальная ДНК-полимераза гамма (POLG) [Lecrenier N. et al., 1997]. В настоящее время известна локализация и структура гена POLG, кодирующего этот фермент [Walker R.L. et al., 1997]. Функциональную значимость POLG подтверждает наличие в современной классификации митохондриальных болезней целого раздела клинических состояний, вызванных мутациями в гене POLG [Hudson G., Chinneiy P., 2006]. Тем не менее, информации о функциональных полиморфизмах этого гена очень мало.

Конечный фенотип формируется при совместном участии митохондриального и ядерного геномов. Одной из наиболее энергозависимых систем организма человека является сердечно-сосудистая, которая часто поражается при митохондриальных болезнях [Di Mauro, 2004]. В связи с этим представляет интерес изучение мтДНК и функционально связанных с ней ядерных генов при заболеваниях сердечно-сосудистой системы. Сердечнососудистые заболевания (ССЗ) — ведущая причина смертности в большинстве стран мира. В настоящее время существует представление о развитии ССЗ как едином континууме [Беленков Ю.Н., Мареев В. Ю., 2002]. Гипертоническая болезнь (эссенциальная гипертония) является начальным этапом в цепи патологических состояний сердечно-сосудистой системы (ССС) [Руководство по АГ, 2005]. Причем в ряде случаев отмечается остановка прогрессирования и трансформации патологий на этом этапе, что может быть связано с генетическими особенностями организма человека [Пузырев В.П. и др. 20 036]. Это предполагает существование общих генов-кандидатов подверженности заболеваниям, а также подчеркивает актуальность изучения эндофенотипов сердечно-сосудистого континуума — количественных признаков, характеризующих деятельность ССС [Пузырев В.П., 2003а]. Представляется актуальным изучение влияния изменчивости мтДНК и ядерного гена POLG на показатели функционирования ССС в норме и при патологии.

Важным фактором при этом является этническая дифференциация полиморфизма мтДНК, которую нужно учитывать при экстраполяции результатов на другие популяции. Каждая молекула мтДНК, принадлежащая к определенной гаплогруппе, несет набор генетических вариантов, характерных для этой гаплогруппы, которые могут включать как нейтральные, так и функционально значимые полиморфизмы. Оценка вклада гаплогрупп мтДНК в изменчивость количественных признаков (эндофенотипов сердечнососудистого континуума) в выборках различного этнического состава позволит прояснить вопрос о функциональной значимости «нейтральных» генетических полиморфизмов.

Цель исследования: Изучить роль полиморфизма мтДНК и функционально связанного с ней ядерного гена POLG в формировании эндофенотипов сердечно-сосудистого континуума в различных популяциях.

Задачи исследования:

1. Изучить изменчивость мтДНК в группах алтайцев, якутов, тувинцев и русских.

2. Изучить распространенность полиморфных вариантов rs758130 — TaqI (A/G) и rs2238296 -Mspl (Т/С) гена POLG в исследуемых группах.

3. Проанализировать вклад локусных вариантов митохондриального генома в изменчивость количественных признаков, характеризующих состояние сердечно-сосудистой системы.

4. Оценить роль полиморфизма гена POLG в детерминации исследуемых признаков.

5. Выявить межэтнические различия в структуре генетической детерминации сердечно-сосудистого континуума, связанные со структурно-функциональными особенностями мт генома.

Научная новизна. Впервые исследована роль полиморфных вариантов мтДНК и функционально связанного с ней ядерного гена POLG при формировании фенотипов, патогенетически значимых для развития сердечнососудистых заболеваний. Установлена межпопуляционная дифференциация в распространении частот аллелей гена POLG. Оценена степень вклада полиморфизма мтДНК и гена POLG в фенотипическую дисперсию количественных показателей. Получены данные о важности сочетанного вклада локусов митохондриального и ядерного геномов в вариабельность количественных признаков, характеризующих функцию сердечно-сосудистой системы. Впервые проведен анализ влияния изученных полиморфизмов на развитие и тяжесть течения эссенциальной гипертонии.

Практическая значимость. Полученные сведения о полиморфизме гена POLG и мтДНК и о межэтнических различиях в популяциях русских, тувинцев, алтайцев, якутов важны для эволюционной генетики и оценки исторических особенностей формирования коренного и пришлого населения Сибири. Этнические особенности вовлеченности различных маркерных систем, определяющих изменчивость патогенетически значимых для развития сердечно-сосудистой патологии количественных признаков, могут быть использованы при формировании групп риска развития эссенциальной гипертонии и ее осложнений. Результаты исследования также представляют интерес в области генетико-эпидемиологических исследований мультифакториальных заболеваний.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Изученные популяции Сибири характеризуется высоким уровнем генного разнообразия по митохондриальной ДНК, с преобладанием внутрипопуляционной компоненты.

2. Полиморфизмы rs758130 — TaqI (A/G) и rs2238296 -Mspl (Т/С) гена POLG находятся в неравновесии по сцеплению во всех изученных популяциях.

3. Вклад полиморфизма мтДНК и ядерного гена POLG в изменчивость количественных признаков, отражающих функцию сердечно-сосудистой системы, равноценен и не превышает 30% дисперсии. В определении вариабельности количественных признаков, описывающих функцию сердечно-сосудистой системы, эффекты взаимодействия локусов мтДНК и POLG наиболее выражены для индекса массы тела, артериального давления, липопротеидов низкой и высокой плотности в изученных популяциях.

4. В определении изменчивости количественных признаков, описывающих функцию ССС, значимы эффекты взаимодействия локусов мтДНК и гена POLG.

5. Показатели липидного спектра крови и гипертрофия миокарда при эссенциальной гипертонии в большей степени ассоциированы с полиморфизмом мтДНК, по сравнению с интервальными оценками ЭКГ и уровнем артериального давления.

Апробация работы: Основные материалы диссертационной работы доложены на 6-ом Международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2005) — Межлабораторном научном семинаре в ГУ НИИ медицинской генетике ТНЦ СО РАМН (Томск, 2006) — Ежегодном Российском национальном конгрессе кардиологов (Москва, 2005) — 37-ой ежегодной конференции Европейского общества генетиков человека (Прага, Чехия, 2005), Российской научной конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2005), 38-ой ежегодной конференции Европейского общества генетиков человека (Амстердам, Нидерланды, 2006), 13-ом международного конгресса по Приполярной медицине (Новосибирск, 2006), IX-ом Всероссийском популяционном семинаре «Особь и популяция — стратегия жизни» (Уфа, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, из них 2 — в центральной печати.

выводы

1. Установлено, что 86,5% изменчивости ГВС1 мтДНК определяется на внутрипопуляционном уровне. Наименьшее значение генетического разнообразия по гипервариабельному сегменту D-петли мтДНК выявлено у якутов (h=0,938), наибольшее — у русских (h=0,988).

2. Отмечена расовая специфичность частот аллельных вариантов гена POLG: у монголоидов — частота аллеля G TaqI (A/G) — 37%- частота аллеля С Mspl (Т/С) — 38% и русских частота аллеля G TaqI (A/G) — 47%- частота аллеля С Mspl (Т/С) — 45%. Изученные полиморфизмы гена POLG находятся в неравновесии по сцеплению во всех изученных популяциях.

3. Вклад полиморфизма гена POLG и мтДНК в фенотипическую изменчивость количественных признаков, отражающих функционирование сердечно-сосудистой системы, варьировал в широких пределах, достигая 30% в популяции русских.

4. Показаны ассоциации вариантов мтДНК с количественными признаками: увеличение частоты замен 16 145−148, 16 189 и 16 311 отмечалось в группе лиц с низкими значениями индекса массы тела, общего холестерина и липопротеидов низкой плотности в различных популяцияхв популяции якутов гаплотип 16 092−16 189−16 362 ассоциирован с низким уровнем общего холестерина и липопротеидов низкой плотностив группе больных эссенциальной гипертонией выявлена ассоциация замены 16 126 129 с высокими значениями эхографических показателей (ИММЛЖ, ТМЖП, ЗСЛЖ, ИГЛЖ), у алтайцев выявлена ассоциация полиморфизма 16 311 с более низкими значениями уровня общего холестерина.

5. Взаимодействие полиморфных вариантов мтДНК и POLG наиболее значимы для индекса массы тела, артериального давления, липопротеидов низкой и высокой плотности в изученных популяциях.

6. Выявлен вклад изученных полиморфных вариантов в формирование эссенциальной гипертонии и особенностей ее течения, как на уровне отдельных полиморфизмов гена POLG и мтДНК, так и для гаплогрупп мтДНК: полиморфизм 16 292−298 предрасполагает к развитию ЭГ (OR=l, 86- р=0,046), аллель G TaqI (A/G) POLG является протективным фактором в отношении ЭГ (C)R=0,66- р=0,038) — гаплогруппа Н снижает риск развития ГЛЖ при ЭГ (ORK), 36- р=0,043), а полиморфизм 16 126−129 (OR=3,26- р=0,017) и гаплогруппа Т (OR=9,33- р=0,018) -предрасполагающие факторы в развитии ГЛЖ у больных ЭГ.

7. Продемонстрирована значимость этнического фактора в проявлении вклада полиморфизмов 16 126−129 и 16 354−362 в изменчивость концентрации общего холестерина, индекса атерогенности и электрокардиографического интервала RR.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Изучение вклада полиморфизма мтДНК и функционально связанного с ним гена POLG в формирование особенностей деятельности ССС в норме и патологии проводилось как на межпопуляционном, так и на индивидуальном уровнях. Исследование проводили в четырех различных этнических группах. Для анализа ассоциаций изученных локусов использовали не только количественные признаки, отражающие функционирование ССС, но также и интегральные факторы, их объединяющие.

В результате проведения исследования популяционного полиморфизма мтДНК отмечено наименьшее значение генетического разнообразия для якутов (это согласуется с наименьшим числом выявленных гаплотипов), наибольшее у русских. В целом монголоидные группы отличались меньшим разнообразием ГВС I по сравнению с европеоидными. В тоже время среднее число нуклеотидных различий между всеми возможными парами гаплотипов внутри выборок было выше для монголоидных популяций. Для полиморфизмов гена POLG отмечена расовая специфичность распределения полиморфизма у монголоидов и европеоидов. Сравнение результатов с он-лайн базами данных и литературными источниками подтверждает полученные закономерности на примере других популяций [Wheeler D.L. et al., 2006; Thorisson G.A. et al., 2005].

Изучение полиморфизма мтДНК и гена POLG в определении изменчивости количественных признаков функционирования ССС и факторов их совместного варьирования позволил выявить ряд особенностей. Сравнение частот изученных аллелей в группах с крайними значениями признаков, вне зависимости от этнической составляющей позволило выявить ряд полиморфных замен мтДНК, значимо чаще встречающихся у лиц с низкими или высокими значениями признаков. Эти данные позволяют провести предварительную оценку участия мтДНК в формировании изученных признаков и использоваться для качественной оценки ее влияния.

Установлено, что полиморфизм гена POLG вносит вклад в фенотипическую изменчивость всех изученных признаков, характеризующийся этнической и половой специфичностью. Так в выборках монголоидов (алтайцы, якуты, тувинцы) уровень вклада не превышал 11% у мужчин и 13% у женщин, в то время как в выборке русских жителей г. Томска это значение достигало 36% в группе мужчин и 10% - женщин.

Уровень вклада полиморфных вариантов мтДНК в фенотипическую изменчивость проанализированных количественных признаков также характеризовался ярко выраженной этнической и половой спецификой. Однако в целом его значения соответствовали данным, полученным для полиморфизма гена POLG. Учитывая аналогичный уровень вклада ядерных локусов для целого ряда признаков [Макеева О.А., 2004] можно высказать предположение о приблизительно одинаковом вкладе полиморфных вариантов большинства изученных ядерных генов и полиморфизма мтДНК в изменчивость количественных признаков, отражающих функционирование сердечно-сосудистой системы.

Показано, что совместное влияние полиморфизма мтДНК и гена POLG проявляется на признаках, с которыми они не связаны по отдельности. В то же время, следует отметить обратную закономерность, когда устраняется индивидуальное влияние митохондриального локуса в сочетании с аллельным вариантом POLG. Это можно объяснить изменением выраженности эффекта полиморфизмов мтДНК в зависимости от генотипа POLG. Вероятным механизмом этого является увеличение или снижение сродства регуляторного региона к митохондриальной гамме-полимеразе и изменение экспрессии мтДНК [Johnson А.А. et al., 2000], что ведет к увеличению или снижению выработки белковых продуктов, участвующих в процессах энергообмена [Coskun Р.Е. et al., 2003]. Конечный результат этого совместного функционирования должен зависеть от их индивидуальной силы и направления действия. Полученные данные свидетельствуют о важности комплексной оценки генетической составляющей количественных признаков.

Сравнение частот изученных аллельных вариантов в группах здоровых и больных ЭГ выявило протективный эффект аллеля G TaqI (A/G) POLG в отношении развития ЭГ. Накопление замены 16 292−298 у больных ЭГ по сравнению с группой здоровых русских, позволило высказать предположение об участии данного локуса в предрасположенности к ЭГ.

Установлена связь филогенетических гаплогрупп Н и Т с развитием ГЛЖ у больных ЭГ. Интересно, что в других исследованиях гаплогруппа Т была ассоциирована с ГКМП и астеназооспермией [Ruiz-Pesini Е. et al., 2000; Castro M.G. et al., 2005]. У больных астенозооспермией с гаплогруппой Т при изучении активности OXPHOS выявили снижение эффективности работы первого комплекса на 23%, по сравнению с гаплогруппой Н, и четвертого комплекса на 29% [Ruiz-Pesini Е. et al., 2000]. Нарушение энергетического баланса в кардиомиоцитах, причиной которому может быть полиморфизм в составе гаплогруппы Т, приводит к более выраженному течению осложнения, за счет нарушения работы Сазвисимой АТФ-азы, снижению скорости реадсорбции Са2+ в саркоплазматический ретикулум и апоптозе клеток [Goffart S. et al., 2004; Nouette-Gauliani К. et al., 2005].

В основе связи изученных полиморфизмов с количественными признаками лежит функциональная значимость мтДНК и POLGфакторов, влияющих на процессы энергообмена во всех клетках организма, что опосредует их плейотропный эффект на формирование особенностей функционирования, в первую очередь, энерголабильных органов и систем, в частности сердечно-сосудистую [Ide Т. et al., 2005]. Другой стороной этого влияния может являться эффективность работы OXPHOS, снижение которой приводит к повышенному выбросу электронов и окислительному стрессу, который играет ключевые роли в патогенезе целого ряда заболеваний [Ide Т. et al., 2005; Stanly W.C. et al., 2005; Howell N. et al., 2005; Reddy P.H., Beal M.F., 2005].

Продемонстрирована значимость этнического фактора в проявлении вклада полиморфизмов 16 126−129 и 16 354−362 в изменчивость концентрации

ОХС, уровня KK и интервала RR. Следует отметить повторяемость результатов в двух различных объединенных группах алтайцев, якутов, русских и тувинцев, русских для полиморфизма 16 126−129 и 16 354−362.

Проведенное исследование является, возможно, одной из первых попыток одновременного анализа популяционно-расовой специфики и патогенетической значимости полиморфизма митохондриальной ДНК.