Лектиновые рецепторы холерных вибрионов

АКТУАЛЬНОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В последнее время большое внимание уделяется изучению лектиновых свойств различных биологических объектов, из которых патогенные микроорганизмы представляют наибольшую актуальность.

Лектины — это протеины или гликопротеины, содержащие как минимум два или четыре активных центра, обладающих способностью связывать углеводы, не изменяя их структуры, которые обеспечивают возможность агглютинировать клетки и преципитировать гликоконъюгаты, взаимодействуя с углеводами, особенно с групповыми детерминантами крови (Boyd W., 1970). Однако микроорганизмы, обладая лектинами (адгезинами, агглютининами), могут участвовать и в таких взаимодействиях in vitro, как гемагглютинация, преципитация, цитотоксичность (Луцик М.Д., 1981; Лахтин В. М., 1994), гемолиз (Телесманич Н.Р., 2003). Можно предположить важную роль лектинов и лектиновых рецепторов в персистенции холерных вибрионов и вибрионо-сительстве, явлениях бактериоциногении, в прикреплении к зоои фитопланктону, в формировании биопленок.

Безусловно, адгезия является начальным и необходимым элементом патогенеза, а структуры, обусловливающие адгезивность возбудителя к клеткам хозяина, признаны определяющими факторами патогенности, так как специфическая адгезия является пусковым механизмом для каскада патологических реакций (Луцик М.Д., 1981; Лахтин В. М., 1994; Тихомирова Е. И., 2003). В 80−90 годы исследованиям адгезии холерных вибрионов был посвящен ряд работ (Смоликова Л.М., 1989; Урбанович Л. Я., 1984; Андрусенко И. Т., 1991). На наличие адгезивных свойств исследовались клеточные стенки (Оленечева Л.С., 1984, 1985), пили, компоненты слизи, жгутиков (Уралева B.C., 1983). Некоторые из них были выделены и охарактеризованы (Король В.В., 1992; Ларионова Л. В., 1992). Относительно лектиновых рецепторов холерных вибрионов и их участия в различных процессах в литературе имеются отрывочные сведения. Предполагается, что лектины кишечной группы микроорганизмов взаимодействуют с гликокаликсом щёточной каймы энтероцитов кишечника и вызывают его повреждение. Это приводит к нарушению функции всасывания слизистой кишечника, повышает ее проницаемость для бактериальных токсинов. Они же усиливают катаболизм белков в тканях и приводят к нарушению азотистого баланса. Лектины устойчивы к протеолизу в желудочно-кишечном тракте (Brady Р., 1978; Liener I., 1976).

Известно, что холерный токсин является типичным лектином, углево-дсвязывающая (лектиновая) активность которого сосредоточена в В субъединице (Yangulu N.K., 1996) и специфична ганглиозиду (GM1) (Ouchterlonie О., 1980).

Имеются сведения о том, что маннозочувствительный лектин Vibrio cholerae eltor и Vibrio cholerae 0139 способствует адгезии к зоопланктону, образуя на своей поверхности маннозочувствительные пили. Их синтез кодируется кластером генов msh. Экспрессия маннозочувствительного гемагглю-тинина и не выявленных факторов адгезии различается в зависимости от се-рогруппы и биотипа V cholerae (Chivelli D.A., 2001). Предполагается, что маннозочувствительный лектин V cholerae принимает участие в формировании биопленок, которые в последнее время привлекают внимание исследователей в связи с их возможной ролью в экологии холерных вибрионов — в сохранении вирулентных клонов в межэпидемический период, формировании новых патогенных клонов в результате передачи генетической информации.

Установлено, что атоксигенные гемолитические V cholerae eltor используют связанный с клеткой рецептор, специфичный N-ацетил-Д-глюкозамину гемагглютинин (лектин), как для формирования биологической пленки на поверхности раздела фаз жидкой питательной среды и воздуха, так и для специфической адгезии к клеткам макроорганизма. Следует отметить, что полимер N-ацетил-Д-глюкозамина — хитин, входящий в состав экзоскелета ракообразных и зоопланктона, является питательной средой, которую многие виды Vibrio используют как источник углерода и азота (Sasmal D., 2002).

В последнее время установлено, что ген hlyA, отвечающий за продукцию гемолизина, кодирует синтез рициноподобного галактозоспецифичного лек-тина, принимающего участие в лизисе эритроцитов барана, но не эритроцитов кролика, а также в гемагглютинирующей способности атоксигенных и токсигенных штаммов холерных вибрионов (Телесманич Н.Р., 2003).

Генетическим маркером эпидемической значимости штаммов холерных вибрионов являются гены ctx АВ, кодирующие продукцию холерного токсина — одного из основных факторов вирулентности, который по своим свойствам и строению является типичным лектином (Ouchterlony О., 1980; Holmgren J., 1978). Вместе с тем токсигенные штаммы без токсин-корегулируемых пилей адгезии (TCP) не способны колонизировать слизистую кишечника и вызывать инфекционный процесс. Поэтому ген tcpA, контролирующий биосинтез TCP, признан наряду с ctx АВ ключевым генетическим фактором, определяющим эпидемический потенциал вибрионов (Tracksis М., 1998). Однако фенотипическому проявлению гена tcpA, изучению уровня адгезии штаммов и углеводной специфичности их лектиновых рецепторов, а также участию углеводных рецепторов мембраны-мишени в различных процессах взаимодействия не уделяется должного внимания. Вместе с тем известно, что фила-ментозные придатки бактерий фимбрии или пили (Brinton С., 1959) представляют собой надмолекулярные сложноорганизованные структуры, являющиеся поливалентным лектином. Поливалентность лектина достигается за счет их углеводсвязывающих доменов.

Таким образом, понимание молекулярных основ адгезии холерных вибрионов, которая имеет место в различных межклеточных взаимодействиях, требует знаний о поверхностных структурах патогена, ответственных за этот процесс. Однако бактериальные клетки имеют на своей поверхности целый спектр рецепторов, узнающих углеводы и определяющих специфичность межклеточных взаимодействий. Спектр этих рецепторов различается у разных видов бактерий и является определяющим в проявлениях патогенности и в механизмах адаптации к условиям окружающей среды. Поэтому изучение углеводной специфичности лектиновых рецепторов микроорганизмов является чрезвычайно важным для разработки подходов к дифференциальной диагностике и познания механизмов патогенности и персистенции.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

.

Цель: определение спектра углеводной специфичности лектиновых рецепторов холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп.

Задачи исследования:

1. Для изучения углеводной специфичности лектиновых рецепторов холерных вибрионов оценить возможность использования эритроцитов четырех групп крови человека и эритроцитов животных in vitro.

2. Оптимизировать методические подходы in vitro для определения адгезивной и агглютинирующей способности токсигенных и атоксигенных холерных вибрионов на эритроцитах четырех групп крови человека, нативных и формалинизированных эритроцитах барана и кролика.

3. Выяснить возможность использования эритроцитов человека для постановки пробы Грейга.

4. Отработать в условиях in vitro методы ингибирования сахарами процессов адгезии и гемагглютинации.

5. Определить спектр углеводов, специфически связывающихся с лекти-новыми рецепторами, локализованными на поверхности токсигенных и атоксигенных холерных вибрионов.

6. Оценить роль лектиновых рецепторов в адгезивной и гемагглютини-рующей активности холерных вибрионов.

7. Отработать условия для изучения специфичности лектиновых рецепторов холерных вибрионов, участвующих в образовании биопленки in vitro.

8. Провести сравнительный анализ специфичности лектиновых рецепторов, участвующих в образовании биопленок холерными вибрионами в эксперименте, в сравнении с механизмами адгезии холерных вибрионов in vitro.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Впервые адгезивная и гемагглютинирующая способности холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп были изучены на широком спектре нативных и формалинизированных эритроцитов млекопитающих in vitro.

Впервые установлено, что адгезивная активность холерных вибрионов коррелирует с гемагглютинирующей активностью на эритроцитах II группы крови человека.

Впервые предложен экспресс-тест для оценки эпидемической значимости холерных вибрионов in vitro на основании комплекса показателей: адгезии, гемагглютинации и гемолиза на эритроцитах II группы крови человека.

Впервые показана возможность использования эритроцитов II группы крови человека для постановки пробы Грейга.

Впервые выявлены внутривидовые различия между возбудителями холеры 01 и 0139 серогрупп по углеводной специфичности лектиновых рецепторов.

Впервые показан доминирующий спектр углеводной специфичности рецепторов адгезии холерных вибрионов и установлены отличия токсигенных (негемолитических) штаммов от атоксигенных (гемолитических) по специфичности лектиновых рецепторов.

Впервые изучены лектиновые рецепторы, участвующие в адгезии и гемагглютинации, и показана гетерогенность популяции гемолитических холерных вибрионов эльтор, имеющих ген tcpA.

Впервые предложен способ фенотипической дифференциации гемолитических вибрионов эльтор, имеющих ген tcpA, с помощью выявления специфичности некоторых лектиновых рецепторов.

Впервые отработаны условия для изучения углеводной специфичности лектиновых рецепторов, необходимых для образования биопленок холерными вибрионами эльтор in vitro.

Впервые проведен сравнительный анализ специфичности лектиновых рецепторов, участвующих в механизмах адгезии и в формировании биопленки в эксперименте.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Изучение углеводной специфичности лектиновых рецепторов на эритроцитах человека является удобной моделью для исследования рецепторов клеточной мембраны не только холерных вибрионов, но и других микроорганизмов.

Знание углеводной специфичности лектиновых рецепторов холерных вибрионов на поверхности цитомембраны полезно для выяснения участия последних в различных физиологических и патофизиологических процессах, а также разработки новых подходов к дифференциальной диагностике.

Изучение ингибирующего действия углеводов на адгезию и агглютинацию эритроцитов холерными вибрионами in vitro, дает возможность определить наличие или отсутствие лектиновых рецепторов, участвующих в адгезии, что перспективно для изучения патогенеза холеры, а ингибирование способности вибрионов к пленкообразованию на поверхности жидких питательных сред важно для понимания механизмов выживания вибрионов в окружающей среде.

Характеристика спектра углеводной специфичности лектиновых рецепторов холерных вибрионов расширила наши представления о биологии и фенотипе возбудителя холеры и может быть использована для дальнейшего углубленного изучения роли лектинов в патогенезе холеры и способности возбудителя образовывать микробиологические сообщества в условиях окружающей среды.

Данные по адгезивности и лектиновому составу токсигенных и атокси-генных холерных вибрионов, имеющих и не имеющих ген tcpA, OI и 0139 серогрупп могут быть использованы для дальнейшего научного исследования, и в результате привести к совершенствованию подходов диагностики и лечения холеры.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Данные оценки адгезивной активности холерных вибрионов in vitro по среднему показателю адгезии на стекле и гемагглютинирующей активности позволили предложить новый тест для дифференциации токсигенных (негемолитических) и атоксигенных (гемолитических) штаммов холерных вибрионов.

Отличия лектинового состава вибрионов классического биовара от вибрионов эльтор и «Бенгал», а также токсигенных штаммов от атоксигенных, имеющих и не имеющих ген tcpA, дает возможность на основании экспресс-метода определения фенотипических свойств возбудителя установить принадлежность выделенной культуры не только к биовару и серологической группе, но и ориентировочно прогнозировать эпидемическую значимость выделяемых культур.

Предложена модификация пробы Грейга с возможностью ее использования для постановки теста с эритроцитами II группы крови человека, взамен эритроцитов барана.

Получен патент «Способ определения ингибирующей способности Сахаров на адгезию холерных вибрионов» (№ 2 288 274 РФ от 27.11.06).

Получен патент на изобретение «Способ выявления эпидемически значимых холерных вибрионов Vibrio eltor и Vibrio cholerae 0139 по их адгезивной способности» (№ 2 332 460 РФ от 27.08.08).

Разработаны Методические рекомендации по постановке экспресс-теста для определения эпидемической значимости штаммов холерных вибрионов на основании комплекса показателей: адгезии, гемолиза, гемагглютинации на эритроцитах II группы крови человека in vitro и Методические рекомендации по фенотипической идентификации гемолитических штаммов, имеющих ген tcpA, с помощью выявления специфичности лектиновых рецепторов.

Предложенный экспресс-тест для определения эпидемической значимости выделяемых штаммов холерных вибрионов внедрен в практику в ФГУЗ Иркутском противочумном институте Сибири и Дальнего Востока Роспот-ребнадзора и ФГУЗ Северо-Кавказской противочумной станции Роспотреб-надзора. Этот метод также используется в лаборатории микробиологии холерных вибрионов ФГУЗ Ростовского противочумного института — головного по проблеме холеры в стране, ведущего постоянный мониторинг за свойствами свежевыделенных штаммов холерных вибрионов.

Метод фенотипической идентификации гемолитических штаммов, имеющих ген tcpA, с помощью выявления специфичности лектиновых рецепторов внедрен в практику в ФГУЗ Северо-Кавказской противочумной станции Роспотребнадзора и используется в лаборатории микробиологии холерных вибрионов ФГУЗ Ростовского-на-Дону противочумного института Роспотребнадзора при мониторинге свежевыделенных культур.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Эритроциты II группы крови человека могут быть использованы в качестве модели для определения эпидемической значимости штаммов холерных вибрионов в тесте адгезии, гемагглютинации и применены в пробе Грей-га, взамен эритроцитов барана.

2. Токсигенные Vibrio cholerae eltor и V. cholerae 0139 имеют рецепторы, специфичные гексозам (глюкозе, маннозе, сахарозе, галактозе и лактозе).

3. Гемолитические атоксигенные штаммы V. cholerae eltor и V. cholerae 0139, наряду с рецепторами, специфичными гексозам (глюкозе, маннозе, сахарозе, галактозе и лактозе), обладают лектинами, специфичными аминосахарам (Д-глюкозамину, Д-галактозамину, N-ацетил-Д-галактозамину, N-ацетил-Д-маннозамину), которые полностью отсутствуют у токсигенных штаммов.

4. Vibrio cholerae eltor, Vibrio cholerae 0139 не имеют рецептора, специфичного арабинозе. Холерные вибрионы классического биовара отличаются наличием рецептора арабинозы, наряду с гексозами, при отсутствии амино-сахаров.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Материалы диссертации были представлены на проблемных комиссиях Научного совета по Санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации «Холера и патогенные для человека вибрионы» (Ростовна-Дону, 2004, 2005, 2006, 2007, 2008 гг.) — научной конференции, посвященi ной 85-летию со дня рождения академика РАМН И. Н. Блохиной «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний» (Нижний Новгород, 2005 г.) — VII Межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита „Группы восьми“ и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств» (Оболенск, 2006 г.) — IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007 г.).

Диссертация выполнена в рамках трех научных тем ФГУЗ РостНИПЧИ Роспотребнадзора: «Основы гемолитической активности холерных вибрионов» (№ гос. регистрации 01.20.03 115 443) — «Лектиновые рецепторы холерных вибрионов» (№ гос. регистрации 0120.0 507 858) — «Липазная и адгезивная активность холерных вибрионов не 01 серогруппы» (№ гос. регистрации 01.2.007 7 281).

ПУБЛИКАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

По теме диссертационного исследования опубликовано 14 научных работ, в том числе 2 из них в периодических изданиях из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени, получено 2 патента на изобретение.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ.

выводы.

1. На основании оценки комплекса показателей: адгезии, гемагглюти-нации и гемолиза эритроцитов II группы крови человека разработан экспресс-тест для дифференциации токсигенных (негемолитических) и атокси-генных (гемолитических) холерных вибрионов. Токсигенные штаммы при использовании эритроцитов II группы крови высокоадгезивны, гемагглюти-нируют, но не лизируют эритроциты данной группы крови.

2. Культуры холерных вибрионов эльтор с характеристикой ctx" tcp+Hly+ гетерогенны по адгезивным свойствам и могут быть как высокоадгезивными, так и низкоадгезивными, но всегда отличаются наличием гемолиза в мазке при использовании эритроцитов II группы крови.

3. Эритроциты II группы крови человека, наряду с эритроцитами барана, могут быть использованы для постановки пробы Грейга.

4. Все холерные вибрионов эльтор и «Бенгал» (токсигенные и атокси-генные) обладают лектиновыми рецепторами, специфичными гексозамглюкозе, маннозе, сахарозе и лактозе.

5. Гемолитические атоксигенные штаммы Vibrio cholerae el tor, Vibrio cholerae 0139, наряду с рецепторами гексоз, обладают лектинами, специфичными аминосахарам: Д-глюкозамину, Д-галактозамину, N-ацетил-Д-галактозамину, N-ацетил-Д-маннозамину, которые полностью отсутствуют у токсигенных штаммов.

6. Холерные вибрионы классического биовара имеют рецепторы гексоз — глюкоза, манноза, сахароза и лактоза, как у токсигенных вариантов эльтор и «Бенгал», и отличаются от них наличием рецептора, специфичного арабинозе.

7. Лектиновые рецепторы холерных вибрионов эльтор, участвующие в образовании биопленок на жидких питательных средах, специфичны как гексозам (глюкозе, сахарозе, маннозе, галактозе), так и аминосахарам (N-ацетил-Д-глюкозамину, N-ацетил-Д-маннозамину).

Заключение

.

В образовании биопленки холерными вибрионами участвуют белок-углеводные взаимодействия между холерными вибрионами, а модель изучения пленки, образуемой на поверхности 1% пептонной воды можно использовать для изучения специфичности лектиновых рецепторов холерных вибрионов, участвующих в этом процессе.

Нами показано, что гемолитические штаммы вибрионов эльтор образуют плотные пленки, на поверхности раздела фаз жидкость — воздух шириной более 3 мм и твердый субстрат-жидкость. Токсигенные штаммы эльтор образуют пленку не более 1 мм шириной. Классические вибрионы в большинстве случаев, не образуют пленку.

Лектиновые рецепторы, участвующие в образовании биопленок специфичны как гексозам (глюкозе, сахарозе, маннозе, галактозе), так и некоторым аминосахарам (N-ацетил-Д-глюкозамину, N-ацетил-Д-маннозамину).

Таким образом, в процессе образования биопленки холерными вибрионами на поверхности жидких питательных сред принимает участие больший спектр лектиновых рецепторов, по сравнению с процессами адгезии in vitro.

Изучение молекулярных основ взаимодействия холерных вибрионов с клетками человека и животных, идентификация лектиновых гаптенов и их углеводной специфичности является важным моментом для понимания механизмов патогенности, вирулентности и эпидемической значимости холерных вибрионов. Одним из параметров, характеризующим патогенность холерных вибрионов, является адгезия.

Изучение процесса адгезии холерных вибрионов традиционно проводилось на кишечнике чувствительных животных (изолированная петля, тканевые диски, изолированные микроворсинки эпителиоцитов).

В.И. Брилисом (1986) разработан метод для кишечной группы, который основан на способности микроорганизмов «прилипать» к гликофорину эритроцитов барана.

По данным Е. Г. Абрамовой (1995), гликофорин эритроцитов идентичен гликофорину гликокаликса кишечника и эритроциты могут служить моделью для изучения адгезивных свойств бактерий.

Исходя из этого, нами была выбрана и адаптирована к особенностям микробиологии холерных вибрионов, методика, разработанная В. И. Брилисом, а в качестве модели для исследования адгезивности в сравнительном аспекте выбраны эритроциты четырех групп человека, нативные и формалини-зированные эритроциты барана и эритроциты кролика.

Нас интересовало изучение адгезии холерных вибрионов не только с патогенетической точки зрения, но и со стороны использования данного фактора в диагностических целях — для диффренциации токсигенных и атокси-генных вибрионов различных серологических групп, то есть для ориентировочного определения эпидемической значимости холерных вибрионов.

В результате проведенных исследований нами было показано, что каждая изученная группа эритроцитов млекопитающих вступает во взаимодействие с холерными вибрионами сохраняя свою особенность, а оптимальной моделью, отражающей эпидемическую значимость V. cholerae eltor, V. cholerae 0139 с характеристикой ctx' tcp~ Hly+, ctx+ tcp+ Hly при адгезии холерных вибрионов являются эритроциты II группы крови человека. Адгезия к эритроцитам I, III групп крови менее демонстративно отражает наличие гена ctx АВ. Адгезия на эритроцитах IV группы крови человека, формалинизиро-ванных и нативных эритроцитах барана и кролика не коррелируют с основными факторами патогенности и эпидемической значимости V. cholerae.

Наличие групп со средней адгезивной активностью среди токсигенных и атоксигенных штаммов на моделях эритроцитов I, III, IV групп крови человека, формалинизированных и нативных эритроцитов барана и кролика свидетельствует о сложности процесса адгезии, суть которого заключается во взаимодействии вибрионов с различными углеводными детерминантами, то есть с широким и разнообразным спектром рецепторов адгезинов холерных вибрионов.

Заслуживает внимания тот факт, что консервированные эритроциты не чувствительны к холерным вибрионам «Бенгал» и менее чувствительны к эльтор вибрионам, чем нативные эритроциты, что, по нашему мнению, делает их непригодными для изучения адгезивности холерных вибрионов.

Установлено, что значения адгезии у культур, выделенных от людей, выше показателей адгезии штаммов, выделенных из объектов окружающей среды.

Нами показано, что штаммы, в общепринятых тестах эпидемической значимости определенные как токсигенные, не гемолитичные при использовании эритроцитов II группы крови имеют средний показатель адгезииСПА >1,5- атоксигенные гемолитичные СПА <1,5.

Исходя из этого, нами сделан вывод о возможности использования теста адгезии для ориентировочной оценки эпидемической опасности выделяемых культур — дифференциации токсигенных не гемолитических штаммов, имеющих высокий показатель адгезии от атоксигенных гемолитических, являющихся низкоадгезивными.

Следует отметить, что разработанный нами метод является экспрессным, занимающим около трех часов.

В процессе исследования способности к адгезии атоксигенных вибрионов холеры эльтор с генотипом сЫ 1ср+, мы разделили их на две группы: культуры, обладающие высокой способностью к адгезии, и вторая группа, №р+ штаммы с низкими показателями адгезии. Вторая группа крови в этом случае отражает повышенную вирулентность культур с генотипом с/х.

Следует отметить, что при исследовании атоксигенных штаммов холерных вибрионов в мазках возможна не только количественная оценка адгезии, но и определение наличия гемолитической активности, по лизису эритроцитов.

Вышесказанное свидетельствует о том, что при выделении штаммов с генотипом Ох №р+, помимо определения гена^рА, необходим дополнительный тест на наличие или отсутствие адгезивной активности, так как наличие гена токсин-коррегулируемых пилей не всегда свидетельтвует о способности последних к адгезии, аналогично, тому, как токсигенные штаммы не всегда могут вызывать холерогенный эффект. Штаммы данного типа, имеющие СПА >1,5, являются потенциально опасными, способны вызывать спорадические случаи холеры, локальные вспышки при общем источнике заражения, обуславливать вибрионосительство, и, по всей видимости, приводить к формированию токсигенных эпидемически значимых популяций.

Важным моментом для понимания механизмов вирулентности и эпидемической значимости холерных вибрионов является изучение молекулярных основ взаимодействия холерных вибрионов с клетками эукариот и определение специфичности лектиновых рецепторов холерных вибрионов. Характерным и показательным свойством лектинов является агглютинация взвеси частиц, на поверхности которых находятся остатки углеводов (углеводные детерминанты).

В связи с этим, на первом этапе изучения спектра лектиновой специфичности холерных вибрионов различных серогрупп и характеристик (наличие генов ctx А, В, tcpA и гемолитической активности) мы выявляли штаммы агглютинирующие эритроциты I — IV групп крови человека, эритроциты барана и кролика, и не только сделали вывод о соответствии гемагглютини-рующей и адгезивной активности, но и показали, что выявленные лектино-вые рецепторы составляют адгезивный потенциал холерных вибрионов.

Нами впервые получены данные о составе лектиновых рецепторов холерных вибрионов, а также проведен сравнительный анализ лектиновой специфичности вибрионов различных биоваров и серогрупп эпидемически опасных и неэпидемических вариантов возбудителя холеры.

Многие исследователи, рассматривая формирование вирулентных клонов холерных вибрионов, находят объяснение этому процессу в приобретении клеткой мобильных генетических элементов (СТХФ, RSl.

Если анализировать полученные нами результаты в эволюционном плане (классические холерные вибрионы, гемолитические эльтор, гемолитические эльтор, имеющие ген tcp, гемолитические Бенгал, токсигенные Бенгал вибрионы), то можно ориентировочно предсказать какие рецепторы приобретались, и какие были утрачены в процессе эволюции. А также, какие рецепторы характерны для эпидемических вариантов и важны в патогенезе, а какие лектины, возможно, играют важную роль в экологии холерных вибрионов, обитающих во внешней среде.

Очевидно, что для всех холерных вибрионов независимо от биовара и токсигенности характерно наличие рецепторов, узнающих глюкозу, маннозу, галактозу, сахарозу, лактозу. У гемолитических штаммов появляются рецепторы узнающие аминосахара, которые исчезают с появлением tcp, А и ctx АВ генов, что, по всей видимости, важно для приспособления атоксигенных штаммов к различным условиям обитания. Несмотря на то, что гемолитические эльтор вибрионы имеют все рецепторы, углеводную специфичность которых мы изучали на разных эритроцитах глюкозо -, маннозо -, сахарозо -, лактозоспецифичные рецепторы экспрессируются у значительно меньшего количества штаммов.

С появлением tcp гена утрачиваются рецепторы, узнающие амминоса-хара, а способность к адгезии у атоксигенных гемолитических штаммов, имеющих tcp, А ген совпадает с наличием лектинов, узнающих сахарозу, лактозу и N-ацетил-Д-галактозамин.

Отличительной особенностью атоксигенных высокоадгезивных штаммов, имеющих tcp ген, является наличие N-ацетил-Д-галактозамина.

V. cholerae cholerae по лектиновой специфичности рецепторов отличаются от патогенных вибрионов эльтор и Бенгал по наличию рецепторов, специфичных арабинозе. Не обнаружено рецепторов специфичных амминосаха-рам у классических холерных вибрионов.

Очевидно, что высокая адгезивная активность эпидемически значимых штаммов связана с наличием у большого количества культур гемагглютини-нов, узнающих глюкозу, маннозу, галактозу, сахарозу, лактозу.

Можно предположить, что патогенность холерных вибрионов, по всей видимости, развивалась от авирулентных свободноживущих гемолитических холерных вибрионов к вирулентным эпидемически значимым, где вирулентные клоны являются более деградированными представителями холерных вибрионов. Это находит подтверждение в том, что рецепторы специфичные амминосахарам (N-ацетил-Д-галактозамин, N-ацетил-Д-маннозамин, Д-галактозамин, Д-глюкозамин) утрачиваются токсигенными холерными вибрионами, у которых лектины более ограничены и представлены только гексо-зами. Выживание во внешней среде вирулентных штаммов ограничено во времени, однако, гемолитические штаммы постоянно циркулируют. Наличие рецепторов специфичных аминосахарам у гемолитических штаммов делает их более приспособленными к выживанию в различных условиях обитания.

Интересным является факт, что у штаммов с характеристикой ctx tcp+ Hly+, выделенных от вибрионосителей в 2005 году, обнаружен рецептор, специфичный N-ацетил-Д-галактозамину, у штаммов с данной характеристикой, выделенных из объектов окружающей среды в 2002 году, этот рецептор отсутствует. Таким образом, с появлением tcpA гена начинают исчезать рецепторы, узнающие амминосахара, а способность к гемагглютинации у атоксигенных гемолитических штаммов, имеющих ген tcpA, преимущественно связана с наличием лектинов, узнающих сахарозу, лактозу и в меньшей степени с другими сахарами.

Нами показано, что по наличию лектиновых рецепторов специфичных N-ацетил-Д-галактозамину и Д-галактозамину, определяемых методом ин-гибирования гемагглютинации эритроцитов II и IV групп крови человека, можно делать заключение о том, содержит ли выделенный штамм ген tcpA и если содержит, то является ли вирулентным, попавшим в окружающую среду от человека, который представляет собой потенциальную опасность в развитии ограниченных эпидситуаций и вибрионосительства, или исследуемая культура не является вирулентной и выделена из объектов окружающей среды при наличии рецепторов характерных для гемолитических штаммов, имеющих ген tcpA.

Очевидно, что углеводная специфичность лектиновых доменов микроорганизмов как структурных компонентов клеточной стенки играет важную роль в межклеточных взаимодействиях патогена и клетки-мишени хозяина, таких как адгезия, а так же, являясь структурными составляющими экзотоксинов (холерного токсина, гемолизина, коклюшного, дифтерийного, шигопо-добного и других токсинов), участвуют в реализации патогенетического потенциала при инфекционных заболеваниях.

Ключевым моментом, определяющим стратегию выживания холерных вибрионов, является способность образовывать микробные сообщества, названные биопленками, как во внешней среде, так и в организме хозяина. Взаимодействие, как между бактериальными клетками, так и между клетками про и эукариот носит характер лектиновых взаимодействий, что определяет многообразие механизмов адгезии, одним из которых является способность к образованию биопленочных структур в различных условиях обитания, в частности у холерных вибрионов. Взаимодействие между клетками холерных вибрионов может носить характер как гидрофобных взаимодействий (липид-липид), так и гидрофильных, лектиновых (белок-углеводных) взаимодействий, что может лежать в основе механизмов образования биопленок в растворах.

Образование пленки холерными вибрионами на жидких питательных средах является одним из визуальных диагностических признаков. Эта способность на определенном этапе знаний связывалась с подвижностью и аэ-рофильностью холерных вибрионов. Способность холерных вибрионов ме-таболизировать в аэробных и анаэробных условиях может определять многообразие субстратов для образования пленок, в том числе и формирование последних при отсутствии твердых объектов.

Согласно современным представлениям, под биопленкой понимается совокупность микроорганизмов и внеклеточных полимерных веществ. В литературе показано, что процесс формирования биопленок зависит от многих факторов, которые связаны с характеристиками раствора, свойствами носителя, а также во многом определяются составом популяции микроорганизмов. Огромное количество вариантов взаимодействия всех этих факторов обуславливает разнообразие адгезивных механизмов при использовании различных поверхностей и микроорганизмов.

Нами получены данные и проведен сравнительный анализ спектра лектиновых рецепторов, участвующих в образовании биопленок на жидкой питательной среде и адгезии к эукариотическим клеткам.

При выявлении и сравнении доминирующего спектра лектиновых рецепторов V. cholerae eltor, участвующих во взаимодействии с эукариотиче-скими клетками на модели in vitro и в создании биопленочного сообщества на поверхности жидкой питательной среды мы нашли как общие характерные биологические признаки, так и отличия. Так, общим для токсигенных и атоксигенных вибрионов эльтор в любых межклеточных взаимодействиях (в собственных и с клетками эукариот) является наличие сахарозоспецифичных рецепторов, независимо от характеристики штаммов и используемой модели. Атоксигенные гемолитические tcp ~ V cholerae eltor используют рецептор N-ацетил-Д-глюкозамина как для формирования биологической пленки на поверхности раздела фаз жидкой питательной среды и воздуха, так и для специфической адгезии к клеткам макроорганизма. Следует отметить, что полимер N-ацетил-Д-глюкозамина — хитин, входящий в состав экзоскелета ракообразных и зоопланктона, является питательной средой, которую многие виды Vibrio используют как единственный источник углерода и азота.

По нашим данным маннозоспецифичные рецепторы участвуют в адгезии к эукариотическим клеткам только у токсигенных штаммов, в то время как в собственных межклеточных взаимодействиях при образовании пленкиs. в эксперименте in vitro рецептор маннозы принимает участие у всех групп штаммов.

Интересным, на наш взгляд, является факт использования токсигенны-ми и атоксигенными холерными вибрионами одинаковых лектиновых рецепторов как для формирования биопленки на поверхности питательной среды так и при адгезии к эритроцитам млекопитающих. Однако, для создания микробных сообществ в виде пленки на поверхности жидких питательных сред, гемолитические холерные вибрионы дополнительно используют рецепторы, специфичные глюкозе и маннозе, что еще раз свидетельствует об экологической пластичности атоксигеных вибрионов эльтор, по сравнению с эпидемическими.

Как известно, холерные вибрионы эльтор не ферментируют арабинозу. В результате проведенных нами исследований установлено, что лектиновые рецепторы, специфичные арабинозе не участвуют ни в процессах адгезии и гемагглютинации, ни в пленкообразовании, то есть вибрионы эльтор, по всей видимости, не имеют рецепторов, специфичных арабинозе.

Результаты наших исследований свидетельствуют, что модель биопленки, образуемой холерными вибрионами на поверхности жидких питательных сред, можно использовать для изучения механизмов образования биопленок, в которых участвуют лектин-углеводные взаимодействия между клетками холерных вибрионов, аналогично процессам адгезии холерных вибрионов к клеткам эукариот.