Дипломы, курсовые, рефераты, контрольные...
Срочная помощь в учёбе

Биотехнологический способ получения флавинадениндинуклеотида

Диссертация: Биотехнологический способ получения флавинадениндинуклеотида
ДиссертацияПомощь в написанииУзнать стоимостьмоей работы

Целью диссертации является разработка биотехнологического способа получения ФАД альтернативного химическому синтезу и более эффективного по сравнению с ранее существующими биотехнологическими способами. В результате использования мутагенеза получен штамм В. ammoniagens АТСС 6871 № 65, обладающий повышенной ФАДсинтезирующей способностью по сравнению с исходным штаммом, который применен для… Читать ещё >

Содержание

  • Обзор литературы
  • Глава 1. Характеристика флавинадениндинуклеотида
    • 1. 1. Общие сведения о ФАД
    • 1. 2. Физико-химические и фармакологические свойства ФАД
    • 1. 3. Лечебное действие
    • 1. 4. Синтез флавинов микроорганизмами
  • Глава 2. Биосинтез флавинов микроорганизмами
    • 2. 1. Влияние состава питательной среды на рост продуцентов
    • 2. 2. Влияние источников углерода
  • Глава 3. Пути синтеза ФАД
    • 3. 1. Химический синтез ФАД
    • 3. 2. Ферментативный синтез ФАД
    • 3. 3. Биосинтез ФАД

Биотехнологический способ получения флавинадениндинуклеотида (реферат, курсовая, диплом, контрольная)

Актуальность темы

Недостаток витамина В2 (рибофлавина)в организме приводит к серьёзным изменениям в обмене веществ. Нарушается синтез белков и нуклеиновых кислот, обмен ряда аминокислот, углеводов и фосфолипидов. Функционирует рибофлавин в клетках как составная часть двух коферментных форм: флавинмононуклеотида (ФМН) и флавинаде-ниндинуклеотида (ФАД), осуществляющих реакции дегидрирования в процессе метаболизма. При ряде заболеваний (гепатоциррозах и др. болезнях печени, диффузионных кератитах, конъюктивитах, экземах, дерматитах, стоматитах, ряде аллергий и алкоголизме) патологические изменения в тканях могут возникнуть вследствие нарушения реакций фосфорилирования и нуклеотидирования витамина В2 до ФАД. Эффектным средством профилактики и лечения перечисленных заболеваний является флавинат (динатриевая соль ФАД). Результаты клинического исследования флавината показьюают, что по сравнению с витамином В2, он более эффективно и пролонгированно сохраняет повышенный уровень флавинов в печени, влияет на уровень холестерина и фосфолипидов в печени.

Производство ФАД может быть осуществлено двумя способами: 1) химический способ. Недостаток — очень дорогостоящий, многостадийный процесс, не являющийся экологически чистым из-за использования вредных для организма соединений, таких как пиридин, дициклогексилкарбодиимид и др.;

2) биотехнологический способ с использованием микроорганизмов. Активным продуцентом ФАД является дрожжеподобный гриб ЕгетоШесшт авЬЬуи, который использовался при промышленном производстве ФАД. Однако этот процесс имеет некоторые недостатки: низкий выход продукта и большие потери при его очистке. Как более прогрессивный метод предложен ферментативный синтез при помощи бактерий с добавлением в среду предшественников ФАД .Этот метод нуждался в совершенствовании из-за ряда трудностейсоблюдение строгой стерильности, длительность ферментации.

Научная новизна. Разработан биотехнологический способ получения ФАД с помощью нового, отселекционированного, высокоактивного мутантного штамма Вге1Ьас1епит аттоша§ епе8 АТСС 6871 № 65. Метод основан на энзиматической биоконверсии предшественников динуклеотида (АТФ-Ма и РМФ-Ыа) в реакционной среде в кофермент, где в качестве биокатализатора впервые используются высушенные ацетоном клетки продуцента.

Подобраны условия выращивания ФАД — синтезирующего штамма № 65 и отработаны параметры проведения реакции биосинтеза ФАД.

Модифицирован разработанный ранее метод выделения кофермента из реакционной среды и очистки, что позволяет получить препарат ФАД с содержанием не менее 90,2% основного вещества.

Практическая значимость. В результате проведенных исследований разработана технология получения конкурентоспособного на мировом рынке и рынке России кофермента на основе отечественного сырья экологически чистым методом. Биотехнологический способ получения ФАД относится к малоотходным технологиям и достаточно прост в аппаратурном оформлении. Требования, предъявляемые к микробиологическому оборудованию, менее жесткие, чем требования к оборудованию для химических производств.

Разработан опытно-прмышленный регламент на производство ФАД и наработаны опытные партии препарата.

Цель и задачи исследования

Целью диссертации является разработка биотехнологического способа получения ФАД альтернативного химическому синтезу и более эффективного по сравнению с ранее существующими биотехнологическими способами.

Для достижения поставленной цели были определены основные задачи:

— провести поиск продуцентов кофермента среди бактерий, принадлежащих к родам Micrococcus, Brevibacterium, Coiynebacterium, Alcaligenes;

— изучить возможность получения мутантного штамма Brevibacterium ammo-niagenes АТСС 6871 с высокой продуктивностью ФАД с помощью генетикоселекционных методов;

— исследовать влияние возраста посевной культуры на уровень биосинтеза ФАД;

— изучить влияние условий культивирования штамма и состава ферментационной среды на рост В. аттопладепез;

— разработать способ обработки полученных клеток культуры, обеспечивающий высокий выход ФАД;

— подобрать оптимальные условия проведения реакции биосинтеза обработанными ацетоном клетками В. ammoniagen. es;

— разработать технологическую схему получения ФАД биотехнологическим способом. ю.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Глава 1. Характеристика флавинадениндинуклеотида (ФАД) .

выводы.

На основании проведенных исследований сделаны следующие выводы:

1. Проведен скрининг кулыур среди бактерий родов Sarcina, Micrococcus, Brevibaeterium, Alcaligenes, и как перспективный продуцент флавинадениндинуклеотида (ФАД) отобран штамм Brevibaeterium ammoniagenes АТСС6871.

2. В результате использования мутагенеза получен штамм В. ammoniagens АТСС 6871 № 65, обладающий повышенной ФАДсинтезирующей способностью по сравнению с исходным штаммом, который применен для биосинтеза кофермента.

3. Охарактеризованны некоторые условия, существенные для эффективного выращивания биомассы продуцента — I стадия процесса получения ФАД. Показано, что:

— возраст посевного материала не влияет на образование ФАД;

— в качестве дополнительного источника углерода в ферментационной среде целесообразно использование I % пирувата-Иа;

— оптимальная продолжительность выращивания биомасы составляет 28 час.

4.Установлено, что II стадию — непосредственный биосинтез (биотрансформация предшественников в ФАД) можно проводить сухими ацетонированными клетками культуры и подобран метод их получения.

5. Отработаны оптимальные параметры для проведения реакции биосинтеза ФАД сухими ацетонированными клетками продуцента.

6. Модифицирован метод выделения кофермента из реакционной среды, позволяющий получить препарат ФАДа с чистотой не менее 93%.

7. Разработан опытно-промышленный регламент, основанный на биотехнологическом способе получения ФАД с помощью мутантного штамма В. аттогпа§ ет № 65, включающий следующий стадии: получение посевного материала, ферментация, выделение влажной биомассы, получение сухих ацетонированных клеток, биотрансформация ФАД в реакционной среде, выделение и очистка ФАД, сушка и упаковка готового препарата.

Показать весь текст

Список литературы

  1. В. М. Клементьева И.В. Крутикова Р. П. Флавинат —// Химико -фарм. журнал, 1980 — T. X1. № 8, — с. 113−116.
  2. B.C. Ферментные методы анализа. М.: Наука, 1969−740с.
  3. Н.Р. Микробиология.- М.: Агропромиздат, 1989-С.25.
  4. A.M. Метаболиты внутриклеточного фонда микроорга-низмов.-М.: Наука, 1974. с.26−27.
  5. A.M. Биохимические основы микробиологического синтеза. -М.: Легкая и пищеая промышленность, 1984 с. 103−104.
  6. И.С., Матас Т. С., Кугчерас Р. В. Ферменты метаболизма флавиновых нуклеотидов у Steptomyces olivaceus.// Микробиологоя, 1989-т.58, вып. 1 -с.37−39.7 .Березовский В. М. Химия витаминов.-М.: Пищевая промышленность, 1973 -632с.
  7. Э.Э. Прикладная биохимия. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1981−294с.
  8. Генетика и селекция микроорганизмов. // под ред. Алиханян С. И. М.: Наука, 1964 — 305с.
  9. Генетика в микробиологии и цитологии. // под ред. Пяткина К. Д. Киев.: Здоровье, 1970−238с.11 .Глемжа А. А. Механизм действия флавиновых ферментов. // В кн. «Коферменты» М.: Медицина, 1973-С.157−175.
  10. И.М. Технология ферментных препаратов.- М.: Пищевая промышленность, 1982−391с.
  11. А.Г. Молочно-кислые бактерии.Селекция промышленных штаммов. Минск: Вышэйшая школа, 1981-е. 164.
  12. Н.С., Милько Е. С. Способность к синтезу флавинов у разных форм Мус. Lacticolum 104. // Микробиологогия, 1971 в 1, t. XL-c.40−42.
  13. Э.М. Биосинтез флавинов микроорганизмами. // Сб."Итоги науки. Вирусология и микробиология ." М.: 1972-тЗ-с.5−55.
  14. М., Уэбб Э. Ферменты -М.: Мир, 1982−1118 с.
  15. Т.Кайнельсон Л. А., Тругнева К. В. Опыт лечения препаратом ФАД центральных тапето ретинальных абиотрофий.// Вестник офтальмологии, 1978-№ 6-с.63.
  16. И.В. Биологическая активность коферментных форм и некоторых производных рибофлавина.//Автореферат, 1985 23 с.
  17. С.Г. Высушивание микроорганизмов и биопрепаратов-М.Сельхозгиз, 1952−220с.
  18. В.М., Цибульская М. И., Суворова Е. Е., Королев П. Н., Клинов C.B., Гунар В. И. Биотехнологический метод получения кофермента А. /У Сб. «Кофермент, А и его предшественники.: синтез, анализ и экпериментальное изучение. М.: 1997 с. 5 — 14.
  19. Г. А. Практическое руководство по энзимологии -М.: Высшая школа, 1980−352с.
  20. В.Л. Биохимия растений .М.: Мир, 1968- с. 248.
  21. ВЛ. Основы биохимии растений М. Высшая школа, 1971−464с.
  22. Крю Ж. Биохимия.-М.: Медицина, 1979−509 с.
  23. АЛ., Жданов В. Г., Степанов А. И. Мутанты В. Subtilis, устойчивые к розефлавину. // Генетика, 1982- т. XVIII, № 2 с. 319.
  24. Г., Кордес Ю. Основы биологической хими -М.: Мир, 1970−567с.
  25. Е.М. /У В кн.!'Витамины», под ред. Смирнова М. И. М.: Наука, 1974−217с.
  26. М.Д. Лекарственные средства- М.Медицина, 1984ч. II- 685с.
  27. Методы практической биохимии. // под ред. Ульямс Б., Уильсон К.- М.: Мир, 1978−268с.
  28. Методы общей бактереологии.// под.ред. Герхардта Ф.- М.: Мир, 1984-т.2−470с.
  29. Е.С., Иванова Н. Т. Влияние состава среды и условий культивирования на синтез флавинов Мус. lactieolum 104
  30. Микробиология, 1970-т.39-в.1-е, 71−77.
  31. Е.С., Работнова ИЛ. Образование рибофлавина некоторыми видами микобактерий на среде с н-гексадеканом. // Микробиология, 1969-т.38 ,-в.2-с.264−269.
  32. В.А., Цибульская М. И. Взаимосвязь процессов биосинтеза флавинов и стеринов у E.ashbyii // Прикладная биохимия и микробиология, 1971 т. VII -с.604−606.
  33. Миронов В А., Цибульская М. И. Взаимосвязь процессов роста и флавиногинеза E.ashbyii. // Микробиологическая промышленность, 1972-в.1-с.16−19.
  34. В.А., Цибульская М. И. Взаимодействие пируватдекарбо -ксилазной активности и биосинтеза ФАД в культуре E.ashbyii // Прикладная биохимия и микробиология, 1973-Т.9, в 2-C.216−218.
  35. В.А., Цибульская М. И. Биосинтез ФАД различными вариантами E.ashbyii. // Сб. Микробиологическая промышленность, 1974 В 6-сЛ-З.
  36. К.А., Работнова И. Л. Изучение световой и темновой стадий фотоиндуцированного синтеза каротиноидов Mycobacterium flavum var.methanicum. //Микробиология, 1969 т.38-с.389−392.
  37. O.A., Квасников Е. И., Ногина Т. М. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии.-Киев: Наукова Думка, 1985−335с.
  38. Патент Японии № 45−22 518, 1970
  39. Патент Японии JMo 46−6398, 1971
  40. Патент Японии № 47−26 707, 197 244. Патент ФРГ № 1 570 027,1975
  41. Патент Японии. Способ получения ФАД № 54−94 281,1981.
  42. Патент Японии № 60−141 295,1982
  43. Патент Японии. Ферментативное производство ФАД. № 209 092,1984.
  44. Н.В., Акишина Р. И. Получение витаминов и коферментов методом биотехнологии. /У Обзорная информация. «Химико-фармацевтическая промышленность.» М.: ЦБНТИ Минмедбиопрома СССР, 1987-B.7-c.4−6.
  45. Г. К., Головлева Л. А. Исследование микроорганизмов в органическом синтезе .- М.: Наука., 1976- 335с.
  46. А.И. Генетические основы селекции микроорганизмов с использованием аналогов. // Цитология и генетика, 1975-т. IX, № 4- е.363.
  47. Л .П. Образование флавинов некоторыми видами дрожжей рода Candida.- // Микробиология, 1965 т.34 — № 4 -с.617−622.
  48. А. Биотехнология: свершения и надежды -М.: Мир, 1987−412с.
  49. Способ получения флавинадениндинуклеотида ферментацией. Патент Японии № 105 600,1970.
  50. A.B. Синтез ФАД в животных тканях.//Биохимия, 1941- с. 301 311.
  51. A.B. Энзиматический синтез ФАД. // Биохимия, 1942−7,4-с Л 88−200.
  52. Ферментативный способ получения флавинадениндинуклеотида. Патент Японии № 28 998,1972.
  53. А.Г., Тоцкий В. Н., Чаговец Р. В. Мембранный транспорт ко-ферментных витаминов и коферментов.-Киев: Наукова Думка, 1982−279с.
  54. К., Иохей Н. Микробиологическое образование ФАД.// Р. Ж. Биология, 1983-№ 3-с.367.
  55. М.й. Биосинтез ФАД у гриба Eremotheeium ashbyii. // Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.-М.: 1975−180с.
  56. М.И., Суворова Е. Е. Влияние источников углерода на рост бактерий родов Brevibacterium и Microccocus в процессе биосинтеза ФАД. // Проблемы микробного синтеза витаминов и их производных: Тез.докладов.-Ташкент, 1990-е .40−41.
  57. Г. М., Фикташ И. С. Особенности синтеза флавинов дрожжевой клеткой. // Международный биохимический конгресс. Рефераты секционных сообщений.-М.: 1961-Т.11,-с.82.
  58. Г. М., Кшеминская Г. П. О потребностях в витаминах дрожжей рода Candida. // Микробиология, 1965-№ 1 -с.53−60.
  59. Г. М., Струговщикова Л. П., Дубчак Т. Т., Терек И.И, О природе флавинов из кулгьтуральных жидкостей различных видовдрожжей Candida. // Прикладная биохимия и микробиология, 1967-т.3,вып.1-стр.44.
  60. ТА. Синтез и свойства флавинадениндинуклеотида и его аналогов. // Диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук.-М.: 1973−176с.
  61. В.Н., Финогенова Т. В. Влияние концентрации железа на синтез флавинов Nocardia erythropolis. Доклад АН. СССР., 1964-№ 3-с.692−694.
  62. Г. Общая микробиология.- М.: Мир, 1972−476с. 71. Экспериметальная витаминология. // под. ред. Островского Ю. М. -Минск: Наука и техника, 1979−550с.
  63. A.M., Северин Е. С., Браунштейн А. Е. Органические кофакторы ферментов-коферменты // Сб. Ферменты.М.: Наука, 1964−218с.
  64. Яровенко В Л., Колунянц К. А., Голгер Л. И. Производство ферментных препаратов из грибов и бактерий М: Пищевая промышленность, 1970−443с.
  65. Cerletti P., Strom R., Giordano М., Barra D., Giovenco S. Flavin coenzymes, flavinogenesis and reproduction in A.gossypii. // J. Biochem,-1965-Mb 6-p.773.
  66. Christie S.M.H., Henner C.W., Todd A.R. Nucleotides. Part XXV. A synthesis of flavin adenine dinucleotide. // J.Chem.Soc.-1954−46.
  67. Demain A.Z. Riboflavin oversynthesis./У An. Rew.Microb. 1972.-v.26-p.369−379.
  68. Goodwin T.W. Horton A.A. Biosynthesis of riboflavin in cellfreesystems. /J.Nature 1961- № 4970 — p.772−774.
  69. Goto M. Identification of a new phosphoiylated pteridinet from E. coli // J.Bioch. Biophis.Research. Com. 1961 — № 6-p. 180.
  70. Huennekens F.M., Kilgour G. L. A new chemical synthesis of flavin-adenin dinucleotide and anlogue. // J.Amer.Chem. Soc. 77−1955-p.6716−6717.
  71. Katagiri H., Yamada H. Jmai K. Biosynthesis of flavin coenzymes by microorganizm. // J.Vitaminol.- 1959−5-№ 2-p. 129−133.
  72. Kearney E.B., Englard S. The enzymatic phosphorylation of riboflavin. //J.Biol. Chem. 1951−193-p.821.
  73. Klein J.R., Kohn H J. The synthesis of FAD from riboflavin by human blood cells in vitro and in vivo. //J. Biol.Chem. 1940−136-p. 177,
  74. Kornberg A., Pricer W.E. Nucleotide pyrophosphatase. // J.Biol. Chem.-1950- 182,№ 2-p.763.
  75. KLorte F., Aldag H., Schicke H. Heterocyclen in stoffwechsel VII Uber die Biosynthese des Riboflavins. Z. Naturborsch. 1956−1 3b-№ 7 -p.463−464.
  76. Korte F., Aldag H., Veber die Umwandlung eines dioxopteridins in riboflavin bie verschiedenen microorganizmen. // Justus liebigs Ann. Chem.-1959−628-p. 144−153.
  77. Korte F., Ludwig G. Zur biosynthese des riboflavins. // Justus liebigs Ann. Chem.-1961−648-p.131−134.
  78. Krishnaswamy P.R. Biochemical investigation in a riboflavin excreting mutent yeast BYl // D.Sc.thesis Mysore University.-1956-p 150.
  79. Kumar P.A., Rao A. Biosynthesis. Hydrolysess of riboflavin. Flavin coenzymes. // J. Scientific and Research. 1968- v.27, № 6- p.225−235.
  80. Masaturu M., Jokidi O. About contents of flavin in the cells Pasteurella tularensis. //J.Med, andbiol. -1960−56, № 2-p.53.
  81. Microbiol technology. // Edit by Pepper H.J., Perlman P. -New York, London, San. Francisco-1979−552 c.
  82. Nakamyra K., Takasawa S. and Tanaka M. Abstr. 20 th. Annu. Mtg. Vitamin Soc. Japen. // Vitamin (Japenes)-1968−37-p.622.
  83. Osman H.G., Soliman M.H. Biosynthesis of riboflavin by E. ashbyii. IV. The nutritional requirements in nitrogen and carbon for E.ashbyii. // Activ fur Microbiol 1963−46,№ 3-p. 247−254.
  84. Peel J.L. The flavins of same microorganisms. // J.Gen.Microb. -1955−12, № 1-p.l 1−14.
  85. Peel J.L. The separation of flavins by paper electrophoresis and its application to the examination of the flavin contens of microorganisms. // JJBiochem.-1958−69, № 8-p.403−415.
  86. Rao N.A., Kummar S.A. Degradation of nucleotides in plants. // J.Biochim. -Biophys. Acta -1963−73-p.87.
  87. Revindranath S.D., Purification. Properties of enzymes hydrolysing FAD. //J. Biochem.-1967−4(2)-p.98.
  88. Revindranath S.D., Rao N.A. Nucleotidases in plants III. Effect of Metabolites on the enzyme hydrolyzing FAD from phaseolus radiatus.
  89. J. Arch.bioch. and bioph.-1969−133-p.54−59.
  90. OO.Sakai T., Watanabe T. Chibata T. Induction of efficient mutant for production of FAD from Sarcina lutea. //JAgrie. and Biol.Chem.-1973−37(12)-p.2882.
  91. Sakai T., Watanabe T ., Chibata T. Selection of microorganisms producing flavinadenindinucleotide from FMN, and adenine (AMP) and production of flavinadenin dinucleotide by Sarcina lutea. // JAgric. and Biol.Chem.-1973−37(4)-p.849−856.
  92. Sakai T., Uchida T. Jshra C. Prodaction of nicotineamide adenine dinucleotide by Saccharomyces carlsbergensis. // JAgric. and Biol.Chem.-1973a-37−1041.
  93. Sakai T., Uchida T., Ishra C. Accumulation of nicotineamide adenine dinucleotide in Bakers yeasts by secondary culture. // J.Agric. and Biol.Chem.-1973b-37−1049.
  94. Schlee P, Zur. Nieden K. Biochemic and physiologic der Flavinoginese in microorganismen. // J. Pharmazie,-1970−25(11)-p.651.
  95. Shimizu S., Ishida M., Tani Y. and Ogata K. Flavin changes of Kloeckera sp. № 22 during adaptation to methanol. // J.Agric. and Biol. Chem.-1977a- 41-p.423.
  96. Shimizu S., Ishida M., Tani Y. and Ogata K. Derepressic of FAD -pyrophosphorylasa and flavin changes during grawth of Kloeckera sp. № 2201 on methanol. It J.Agric. and Biol. Chem.- 1977b- 44-p.2215.
  97. Shimizu S., Ishida M., Tani Y. and Ogata K. // J.Ferment. Technol.-1977c-55-p.630.
  98. Shimizu S., Yamana K., Tani Y. and Yamada H. //J.Appl. Biochem. Biotechnol -1983a-8-p.237.
  99. Veldkamp H., Vevema P., Harden H., Konings W. Production of riboflavin by Arthrobacter globiformis. // J.Appl. Bacteriol-1966-p. 107.
  100. Watanabe S. Metabolism of riboflavin by animal tissues. // J. Vitaminol -1959−5-p.254.
  101. Watanabe T., Kato I., Chibata J. Prodaction of FAD by mutant of Sarcina lutea. // J.Appl. Microbiol 1974- 27, № 3- p.531 -536.
  102. Weigand F., Simon H., Pahms G., Waldschmidt M., Schlieg H.J., Wacher H., A precursor of leucopterin in Pieris brassicae L. // J.Angew.Chem.-1961−73-p.479.
  103. Whitby L.G. Enzymic formation of new riboflavin derivate. // J. Nature -1950−166-p. 479.
  104. Whitby L.G. Riboflavinyl glucoside a new derivative of riboflavin. // J.Biochem. -1952-v.50-p.433.1 i 7. Wilson A.C., Pardee A.B. The regulation flavin of sinthesis by E.coli. // J. Gen. Microbiol -1962−28 ,№ 2-p.283−303.
  105. Warburg 0., Christian W. // Biochim. Z.-1938−298-p.l50.
  106. Yagi K. Methods of Biochemical Analysis. // Ed D. Glick 1962 — 10 -p.320
  107. Yagi K., Yamada S. Studies of intodaction of riboflavin-5' -monosulfate. // Acta biochimica Polonica-1964-т. 11 ,№ 2−3 -p. 319.
  108. H., Shimizu S., Tani J. Синтез коинзимов иммобилизованными клеточными системами. //J. Enzyme Engineering-1980-v.5-p.405.
Заполнить форму текущей работой

Заказал и сдал!