Разработка промышленных технологий очистки рекомбинантных белков: гормона роста человека и гранулоцитарного колониестимулирующего фактора

Актуальность исследования.

Получение лекарственных препаратов с помощью методов генной инженерии является сегодня приоритетным направлением в развитии такой важной отрасли, как биотехнология. Возможность получения фармацевтических генно-инженерных белков в промышленности дает следующие преимущества: отсутствие ограничений по источнику сырья и низкая себестоимость конечного продукта.

В настоящее время в мировой практике четко выражена тенденция к замене препаратов, получаемых из природных источников, на их рекомбинантные аналоги. Такие препараты, разрабатываемые рядом зарубежных фармацевтических компаний, уже сегодня успешно применяются в медицинской практике. Способы получения инсулина, интерферонов, интерлейкинов, гормона роста человека, гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, окситоцина и др. были запатентованы в разных странах. Они характеризуются различными способами экспрессии генов в клетках-продуцентах, штаммовой вариабельностью и видовым разнообразием продуцирующих культур, способами очистки и качеством самих препаратов. Однако в России, по ряду причин, отсутствуют как собственные технологии получения многих, из перечисленных выше, терапевтических препаратов, а имеющиеся инновационные разработки не внедрены в производство.

Одним из путей быстрого развития биофармацевтической промышленности является производство дженериков — лекарственных препаратов, срок действия патентной защиты на которые уже закончился. Разработка таких технологий и организация собственного масштабного производства позволит быстро освоить современное оборудование, приобрести опыт работы в условиях ОМР, изучить различные методы анализа и очистки, добиться высокого качества выпускаемого продукта, обеспечить необходимыми. препаратами большее количество пациентов и заложить основы импортозамещения.

Цель исследования:

Целью диссертационной работы являлась разработка технологий получения и очистки рГРЧ и рчГ-КСФ из телец включения для организации полномасштабного промышленного производства активных фармацевтических субстанций.

Задачи исследования:

1. Оптимизировать условия проведения процессов солюбилизации и ренатурации рГРЧ и рчГ-КСФ в различных условиях.

2. Подобрать условия, позволяющие оптимально осуществить хроматографическую очистку рГРЧ и рчГ-КСФ из телец включения на промышленных сорбентах.

3. Подобрать условия ферментативного отщепления Ы-концевого метионина от Ме^рГРЧ.

4. Выявить критерии, определяющие масштабирование процессов получения рГРЧ и рчГ-КСФ.

5. Масштабировать процессы получения рГРЧ и рчГ-КСФ в условиях опытно-промышленного производства.

6. Провести сравнительную оценку качества полученных препаратов с импортными аналогами.

Научная новизна полученных результатов.

1. Впервые, для ренатурации белков, Ме^рГРЧ и рчГ-КСФ, был применен пероксид водорода, который позволяет быстро и эффективно проводить процесс при высокой концентрации белка.

2. Установлено, что применение Си804 в процессе ренатурации осложняет очистку белков от эндотоксинов.

3. Выявлена новая, ранее нигде не опубликованная структурная модификация рГРЧ, связанная с преобразованием дисульфидной связи.

11 СО.

СуэСуэ в тиоэфирную при рН 12.

Практическая значимость полученных результатов:

1. Разработан опытно-промышленный регламент на производство 150 г субстанций рГРЧ за один производственный цикл.

2. Разработанный технологический процесс производства рГРЧ используется для производства лекарственного препарата «Растан».

3. Разработан опытно-промышленный регламент на производство 100 г субстанции рчГ-КСФ за один производственный цикл.

4. Разработанный технологический процесс производства рчГ-КСФ используется для производства лекарственного препарата «Нейпомакс».

Список опубликованных научных работ по теме диссертации:

1. Н. В. Кононова, А. И. Бобрускин, Т. И. Костромина, Т. Д. Мелихова, A.A. Вайнсон, Е. В. Свешникова, A.A. Зинченко, A.B. Демин, Д. И. Баирамашвили: Разработка и оптимизация технологического процесса получения субстанции филграстима // Биотехнология.—2009.— № 5.—С.24 — 32.

2. Н. В. Кононова, А. И. Бобрускин, И. А. Пучков, С. А. Косарев, Г. О. Кожевников, A.B. Демин, Д. И. Баирамашвили, А. И. Мирошников // Опытно-промышленная технология получения активной фармацевтической субстанции рекомбинантного гормона роста человека.—Биотехнология.—2008.—№ 5.—С.ЗЗ — 42.

3. Н. В. Кононова, А. И. Бобрускин, И. А. Пучков, Т. Г. Галкина, Д. И. Баирамашвили: Сравнительный анализ качества российского препарата РАСТАН с зарубежными аналогами ГЕНОТРОПИН и ХУМАТРОП // Тезисы научных докладов (Доклад) на Российском симпозиуме Биофарма 2009 —2009.—Турция.—С. 19.

4. Н. В. Кононова, А. И. Бобрускин, И. А. Пучков, Д. И. Баирамашвили: Технология производства рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в промышленных масштабах // Тезисы научных докладов на Международной школе-конференции посвященной 40-летию создания ГосНИИгенетики.—2008.—Москва.—С.49.

5. А. И. Бобрускин, Н. В. Кононова, Д. И. Баирамашвили: Промышленная технология производства рекомбинантного гормона роста // Тезисы научных докладов на IV Московском международном конгрессе Биотехнология: состояние и перспективы развития.—2007.—Москва.—С.85.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

выводы.

1. Подобраны оптимальные условия солюбилизации, ренатурации и хроматографической очистки Ме^рГРЧ и рчГ-КСФ из телец включения.

2. Оптимизированы условия отщепления метионина от 1М-концевой части Ме^рГРЧ лейциновой амнопептидазой Аеготопаэ рго1ео1уиса. Показано, что отщепление метионина происходит полностью, без образования побочных продуктов.

3. Проведены масштабирование и валидация каждого технологического процесса и сформулированы основные универсальные подходы к масштабированию хроматографических методов очистки рекомбинантных белков.

4. Разработана общая технологическая схема выделения двух препаратов рГРЧ и Г-КСФ, которая стандартизует процедуру документирования технологического процесса в соответствии с требованиями вМР.

5. Показано, что выделяемые белки соответствуют фармакопейным требованиям и не уступают в качестве импортным аналогам.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Автор выражает глубокую благодарность руководителям работы: д.х.н., профессору В. И. Швецуд.х.н. Д. И. Баирамашвилиначальнику цеха экспериментальной ферментации ОБП ИБХ РАН Т. И. Костроминойс.н.с лаборатории протеомики ИБХ РАН, к.б.н P. X. Зиганшину за помощь в проведении масс-спектрометрического анализаруководителю лаборатории лучевых методов лечения опухолей, д.б.н. А. А. Вайнсону за помощь в проведении экспериментов по выявлению специфической активности препаратоввсех сотрудников ЗАО «Мастерклон» за помощь в проведении экспериментальных исследованийдоценту кафедры биотехнологии и бионанотехнологии МИТХТ, к.х.н Ю. Г. Кирилловойдоценту кафедры биотехнологии и бионанотехнологии МИТХТ, к.х.н О. В. Есиповойс.н.с. лаборатории биотехнологии ИБХ РАН, к.х.н. Р. С. Есипову, руководителю отдела сервиса GE Healthcare А. Н. Веретенникову и заведующему центра коллективного пользования ГосНИИгенетики, к.т.н. Е. И. Кандыбе за консультации во время проведения работы и написания диссертации.

Отдельно автор выражает глубокую признательность и особую благодарность заведующему лаборатории биотехнологии ИБХ РАН, академику РАН, д.х.н А. И. Мирошникову за всестороннее участие и поддержку в работепрофессору, чл.-корр. РАН д.х.н. Е. В. Гришину за помощь в приобретении опыта и знаний в области молекулярной биологии, белковой химии и хроматографии во время работы в лаборатории нейрорецепторов и нейрорегуляторов ИБХ РАН.