Нитроксидергические механизмы адъювантного артрита

Актуальность проблемы. Проблема аутоиммунного воспаления в клинике внутренних болезней является чрезвычайно важной. Аутоиммунные болезни поражают 5−7% населения земного шара, чаше развиваются у женщин, чем у мужчин, как правило, в молодом возрасте и рассматриваются как наиболее частая причина хронической патологии человека [1, 24, 28].

Наиболее яркими представителями системных аутоиммунных болезней являются ревматические заболевания: системная красная волчанка, ревматоидный артрит, системная склеродермия, дерматополимиозит и полимиозит, гранулематоз Вегенера [49, 67]. Развитие аутоиммунных ревматических заболеваний связывают с поликлональной В-кпеточной активацией, Т-клеточной активацией антигеном, молекулярной мимикрией, дефектами генов, кодирующих структуру иммуноглобулинов, Т-клеточных рецепторов и синтез цитокинов, нарушением механизмов программированной гибели клеток (апоптоз) [48, 49]. Многие современные тенденции в изучении иммунопатогенеза воспалительных ревматических заболеваний можно проследить на примере ревматоидного артрита [49, 63]. Это находит свое отражение в морфологии ревматоидного синовита, который представляет собой классический пример иммунного воспаления [27].

Ревматоидный артрит (РА) — одно из наиболее распространенных хронических аутоиммунных заболеваний человека, частота которого в популяции достигает 1% [41, 46], а экономические потери от РА для общества сопоставимы с ишемической болезнью сердца. К кардинальным признакам РА относится неуклонно прогрессирующее поражение суставов (хронические боли, деформация, нарушение функции), приводящее к инвалидности и снижению продолжительности жизни пациентов [47, 49]. Увеличение смертности во многом обусловлено нарастанием частоты сопутствующих заболеваний (инфекции, поражение сердечно-сосудистой системы и почек, остеопоретические переломы и др.), развитие которых патогенетически связано с плохо контролируемыми ревматоидным воспалением и дефектами иммунитета [48, 80].

Ревматоидный артрит (РА) представляет собой хронический прогрессирующий синовит, приводящий к постепенной деструкции суставов [20, 41]. Суть патологического процесса при РА составляет прогрессирующее неконтролируемое воспаление синовиальной оболочки суставов, обусловленное резидентными синовиальными клетками: фибробластами, макрофагами, дендритными, тучными, эндотелиальными клетками, Ти В-лимфоцитами [20, 45, 63]. Основное значение в патогенезе РА придают двум тесно взаимосвязанным процессам: антиген-специфической активации CD4 Т-лимфоцитов по Th-1 типу, характеризующейся избыточным синтезом интерлейкина (IL-2), интерферона (IFN-y), IL-17, IL-18, и дисбалансом между продукцией провоспалительных цитокинов (фактора некроза опухоли-a (TNF-а), IL-1, LL-6, LL-8 и противовоспалительных цитокинов (IL-10, растворимого антогониста IL-1, растворимых TNF-a рецепторов, IL-4) с преобладанием продукции первых над вторыми [48, 61]. Th-1 клетки вовлечены в реакции клеточного иммунитета, а именно гиперчувствительность замедленного типа, воспаление, клеточную цитотоксичность [39, 26, 43].

Именно нарушение синтеза цитокинов лежит в основе патогенеза хронического воспаления при аутоиммунных заболеваниях. По современным представлениям ключевыми медиаторами иммуновоспалительного процесса при РА являются TNF-a и IL-ip [45, 44, 48, 184] Эти последние регулируют выработку оксида азота (N0), что выдвигает его на передний план патогенетического процесса в синовиальной оболочке. По данным экспериментальных исследований, подавление синтеза N0 ассоциируется с уменьшением признаков воспаления при различных формах экспериментальных артритов [179, 191, 198, 199, 191]. Экспрессия индуцибельной NO-синтазы (iNOS) и повышенный синтез N0 впервые показаны на моделях органоспецифических аутоиммунных заболеваний in vivo, таких как экспериментальный аллергический энцефаломиелит и иммунологически опосредованный диабет у мышей без признаков ожирения [88, 175]. Подобный характер NO-синтазной функции выявлен на модели адъювантного и коллаген-индуцированного артрита у мышей линии MRL// [202]. Дебют экспериментального артрита предотвращается введением монометиларгинина — специфического ингибитора iNOS [179, 202, 205] Однако, остается не выясненным, как интенсивность выработки N0 в структурах синовиальной оболочки контролирует напряженность и длительность воспалительного процесса.

Анализ литературы показывает недостаточность сведений о нитроксидергической функции синовиальной оболочки в норме и при развитии ревматоидного воспаления. Так, концентрация нитритов в синовиальной жидкости значительно превосходит концентрацию нитратов и нитритов в сыворотке крови у больных РА, что указывает на высокий локальный уровень синтеза N0 в суставах, пораженных РА [139, 183]. Известно, что источником N0 в синовиальной жидкости являются гранулоциты [138, 132]. Однако другие типы локальных NO-продуцирующих клеток синовии остаются неизвестны. Вместе с тем, гребует уточнения динамика развития токсического и цитопротективного эффектов N0, притом, что данные об экспрессии NOS в тканях сустава на разных стадиях РА чрезвычайно противоречивы. Одни исследователи отводят N0 роль главного организатора хронического воспаления, другие, напротив, ее отвергают [141]. Не известны также топография и динамика активности NOS синовиоцитов на фоне действия основных фармакологических препаратов.

Многообразие клинических, патологических и иммунологических проявлений РА делает этот процесс похожим на клинико-иммунологический синдром, чем на одну «гомогенную» болезнь [181]. Не случайно РА приобрел статус модели, на которой активно изучаются новые аспекты патогенеза аутоиммунного воспаления и разрабатываются принципиально новые направления противовоспалительной терапии [174]. Выдающееся открытие полного адъюванта Фрейнда дало возможность дальнейшего изучения проявлений клеточного иммунитета при экспериментальном воспроизведении аутоиммунных заболеваний, а именно участия N0 в развитии синовита. Адъювантный артрит мышей напоминает по своему течению и морфологическому проявлению ревматоидный артрит человека [82, 83]. На модели АА планируется уточнить роль ЫО-синтазной компоненты на разных этапах развития синовиального воспаления.

Цель работы: установить значение нитроксидергических механизмов в развитии адъювантного артрита.

В работе решались следующие задачи:

1. Определить локализацию и активность ЫЛОРН-диафоразы и N0-синтаз в клетках синовиальной оболочки и хряща тибиотарзального сустава у здоровых мышей линии С57В1аск6.

2. Изучить локализацию и активность ЫАОРН-диафоразы и ЫО-синтаз в синовиоцитах и хондроцитах тибиотарзального сустава на ранней и поздней стадии адъювантного артрита у мышей линии С57В1аск6.

3. Исследовать уровень акгивности КАОРН-диафоразы и ЫО-синтаз в синовиоцитах и хондроцитах тибиотарзального сустава у мышей линии С57В1аск6 с адъювантным артритом на фоне введения специфического ингибитора фермента М-нитро-Ь-аргинина.

4. Изучить влияние преднизолона на активность нитрооксидсинтазы в синовиоцитах и хондроцитах тибиотарзального сустава у мышей линии С57В1аск6 с адъювантным артритом.

Научпая новизна и теоретическое значение работы: а) впервые проведен комплексный анализ участия ЫО-синтазной компоненты в инициации и развитии адъювантного артритаб) впервые установлена динамика активности ЫАЛРН-диафоразы. индуцибельной и конститутивной ЫО-синтазы в синовиоцитах и хрящевой ткани мышей линии С57В1аск6, дана их детальная количественная характеристика в условиях экспериментального артритав) установлено значение блокаторов ЫО-синтазы и преднизолона на экспрессию нитроксидсинтаз в тканях тибиотарзального сустава у мышей на модели ревматоидного воспаления.

Проведенные исследования позволили обосновать и сформулировать научные положения, способствующие пониманию ЫО-ергических механизмов, лежащих в основе становления и развития адъювантного воспаления. Выявленные изменения состояния ЫАОРН-диафоразы, индуцибельной и конститутивной ЫО-синтазы в синовиоцитах и хондробластах, а также фармакологическая коррекция активности ферментов достаточно объективно свидетельствуют о прямом и неоднозначном влиянии оксида азота на патогенез адъювантного воспаления. Это может иметь важное теоретическое значение для разработки новых подходов в понимании патогенетических механизмов ревматоидного артрита у человека.

Практическая ценность работы. Полученные в работе данные по топографии и реактивности ЫО-синтезирующих синовиоцитов и хондроцитов в условиях экспериментального артрита могут быть использованы в области клинической и теоретической ревматологии, патофизиологии и патологической анатомии аутоиммунного поражения опорно-двигательного аппарата. Установленная динамика активности ЫО-синтазы и резистентность синовиоцитов при введении ингибитора энзима и преднизолона может представлять эффективную модель для разработки препаратов направленного действия и надежной фармакологической коррекции патологии суставов при ревматоидном артрите.

Положения, выносимые на защиту:

1 Участие ЫО-содержащих клеточных структур синовиальной оболочки в развитии аутоиммунного артрита определяется их типологической и химической гетерогенностью.

2. Динамика активности NOS в синовиоцитах зависит от стадии воспаления и определяет специфическое эффекторное действие N0 на клетки-мишени.

3. Степень поражения хрящевой ткани суставов при адъювантном артрите коррелирует с NO-синтетической функцией хондробластов.

4 Введение Ы-нитро-Ь-аргинина и преднизолона снижает активность фермента в клеточных элементах синовии.

Апробация работы состоялась на кафедре гистологии, цитологии, клеточной биологии ГОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет МЗ РФ» (Владивосток, 2005). Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Конгрессе ревматологов России (Саратов, 2003, Москва, 2004), на заседаниях Приморского краевого терапевтического общества (Владивосток, 2001;2003), Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 25.09. 2004), Конгрессе европейской противоревматической лиги (EULAR, Берлин, 2004), Конгрессе международной ассоциации по остеоартрозу (OASI, Чикаго, 2004), в рамках научной сессии ДВО РАН и СО РАМН «Новые технологии в диагностике и лечении заболеваний человека» (Владивосток, 2005), Тихоокеанской научно-практической конференции студентов и молодых ученых (Владивосток, 2005).

выводы.

1. Умеренная активность NADPH-диафоразы установлена в синовиоцитах покровного и стромального слоях синовиальной оболочки у здоровых мышей линии C57BIack6. В субпокровном уровне синовии NADPH-d позитивные клетки отсутствуют. Топография NADPH-d совпадает с локализацией конститутивной NOS (c-NOS).

2. Хондроциты и хондробласты тибиотарзального сустава здоровых мышей содержат NADPH-d. Высокая активность фермента выявляется в цитоплазме пролиферируюших хондробластов, занимающих краевую зону хряша В средних и глубоких слоях хрящевой ткани интенсивность окрашивания хондроцитов снижается до умеренной и низкой.

3. Ранняя фаза адъювантного воспаления характеризуется увеличением на 30,4% числа нитрооксидпозитивных клеток. Активность NADPH-диафоразы в клетках синовиальной оболочки определяется на высоком уровне (75,2+3,8 ЕОП). На 30-день адъювантного артрита количество и активность нитрооксидпозитивных клеток снижается.

4 В начальной фазе адъювантного артрита количество синовиоцитов, экспрессирующих iNOS постоянно увеличивается, достигая максимума на 7−14 день. Большинство клеток экспрессирующих i-NOS локализуется в покровном и стромальном слоях синовиальной оболочки.

5. Поздняя стадия адъювантного артрита характеризуется значительным уменьшением количества и интенсивности окрашивания i-NOS реактивных элементов, что сопровождается сохранением экспрессии конститутивного изофермента (n-NOS) в синовиоцитах покровного, субпокровного и глубокого стромального уровней синовиальной оболочки.

6. В раннюю стадию адъювантного артрига преобладают хондробласты с высокой активностью NADPH-d. В позднюю стадию активность фермента и количество нитрооксидпозитивных клеток снижается.

7. Ы-нитро-Ь-аргинин тотально блокирует активность ЫАЭРН-ё, ?-N08 и п-ЫОБ в макрофагах и синовиоцитах покровного и субпокровного слоях синовиальной оболочки. Активность ЫАГ) РН-(1 в стромальном слое прогрессивно уменьшается до низкой.

8. Преднизолон снижает активность ЫАОРН-ё, ?-N08 и с-ЫОБ в клетках глубокого стромального слоя синовиальной оболочки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Проблема аутоиммунного воспаления в клинике внутренних болезней является чрезвычайно важной. Многие современные тенденции в изучении иммунопатогенеза воспалительных ревматических заболеваний можно проследить на примере ревматоидного артрита [27, 28]. Это находит свое отражение в морфологии ревматоидного синовита, который представляет собой классический пример иммунного воспаления [27].

Ревматоидный артрит — одно из самых тяжелых аутоиммунных заболеваний человека с преимущественным поражением суставов, распространенность которого в популяции колеблется от 0.5 до 1% [46]. Через 10−15 лет от начала болезни примерно 90% пациентов теряют трудоспособность, а 1/3 становится полными инвалидами [44]. Уже в дебюте РА воспаление имеет хронический характер, очень быстро приводит к необратимой деструкции суставов, и именно поэтому, плохо поддается воздействию противовоспалительных препаратов [44]. Предполагается, что агрессивное подавление воспаления в самом начале болезни может способствовать снижению риска инвалидности и преждевременной смерти [46]. Учитывая фундаментальный вклад аутоиммунного воспаления в патогенез РА, исследования на модели РА имеют общемедицинское значение [57, 82]. Несомненные успехи в изучении патогенеза РА: уточнения роли провоспалительных медиаторов (цитокинов, лейкотриенов, простагландинов, оксигенных радикалов) в активации деятельности лимфоцитов, макрофагов, синовиоцитов, привели к изменению тактических подходов к лечению РА [80]. На основании полученных данных было выдвинуто несколько основных гипотез патогенеза РА [44]. Согласно одной из них РАантигеннообусловленное, Т — клеточно-опосредованное заболевание, воспалительный потенциал которого «запускается» через распознавание антигена СБ4+ Т-клетками в синовиальной ткани [80]. Гистологически в синовиальной оболочке даже на поздних стадиях болезни, постоянно выявляются активированные С04+ Т-клетки в тесной ассоциации с антигенпрезентирующими клетками, вызывающими стимуляцию Т-клеток [206]. Скопление в синовиальной оболочке Т-клеток вызывает реакцию гиперчувствительности по ТЫ-механизму (синтез ФНО-а, интерферона-у, интерлейкина-2, ИЛ-12) [24]. Активированные Т-клетки синовиальной оболочки выделяют медиаторы, регулирующие функцию В-клеток, макрофагов, фибробластов (синтез провоспалительных медиаторов) и занимают ключевую позицию в развитии и прогрессировании ревматоидного синовита [206].

В последнее время исследователей привлекает участие оксида азота в патогенезе РА [201]. Обнаружено, что концентрация нитрита в синовиальной жидкости у больных РА была значительно выше концентрации нитритов в сыворотке крови у тех же больных, что иллюстрирует высокий локальный уровень синтеза N0 в суставах, пораженных РА [117]. Интенсивность продукции N0 кореллировала с показателями активности РА, такими, как продолжительность утренней скованности, количество воспаленных и болезненных суставов [99]. Все вышеперечисленные факты позволяют утверждать, что интенсивность продукции N0 у больных РА отражает напряженность воспалительного процесса [148]. Полимеразная цепная реакция подтвердила экспрессию значительного количества т1ША N08−2 в синовиальной оболочке при РА [183]. Иммуногистохимические исследования показали, что в синовиоцитах, эндотелиальных клетках, хондроцитах экспрессируется N08−2 в большей степени, чем в инфильтрирующих синовиальную оболочку мононуклеарных клетках и фибробластах [122]. Большинство синовиоцитов и инфильтрирующих мононуклеаров, иммунореактивных к N08−2, экспрессировали СБ 14 и НЬА-ОЯ рецепторы [122]. Этот факт позволяет предположить, что основными продуцентами N08−2 являются А-синовиоциты.

Многообразие клинических, патологических и иммунологических проявлений РА делает этот процесс более похожим на клинико-иммунологический синдром, чем на одну «гомогенную» болезнь [181]. Неслучайно РА приобрел статус модели, на которой активно изучаются новые аспекты патогенеза аутоиммунного воспаления и разрабатываются принципиально новые направления противовоспалительной терапии [57, 82]. Открытие полного адъюванта Фрейнда дало возможность дальнейшего изучения проявлений клеточного иммунитета при экспериментальном воспроизведении аутоиммунных заболеваний, в том числе участие N0 в развитии синовита.

Резюмируя содержание настоящей работы, мы обсудим некоторые общие вопросы патогенеза адьювантного артрита с точки зрения функции N0 в инициации и развитии аутоиммунного воспаления.

N0 как медиатор этих процессов получил право на самостоятельное существование в начале девяностых годов XX века, но только в последние пять лет с помощью иммунои гистохимических методов были установлены основные механизмы его действия на клетки хрящевой ткани и синовиальной оболочки. Радиометрические и биохимические исследования привели к выводу о двух противоположных направлениях активности N0 — цитотоксическом (провоспалительном) и цитопротективном (противовоспалительном). Однако полученные данные не решили вопрос о количественном и топологическом представительстве NO-ергических синовиоцитов на разных стадиях течения аутоиммунного воспаления. Клетки, нарабатывающие N0, поддерживают основной баланс этой молекулы. Типология и локализация NO-продуцирующих клеток определяют спектр действия газа на их ближайшее микроокружение. Оказалось, что главной причиной, препятствующей созданию полномасштабной картины участия N0 в генезе такого аутоиммунного поражения суставов, как ревматоидный артрит, является чрезвычайная гетерогенность локализации активности конститутивной и индуцибельной NOS у человека и экспериментальных животных. Для решения этой задачи потребовались разработки новейших моделей аутоиммунного воспаления и сопоставление их с результатами изучения NOS на материале суставов человека.

Использованная в нашем исследовании специфическая линия мышей C57BIack6, генетически предрасположенных к развитию аутоиммунного воспаления соединительной ткани, имеет определенные преимущества перед другими моделями, так как позволяет исследовать изменение NADPH-d/NOS-содержащих структур на разных стадиях воспалительного процесса. Тем не менее, прежде чем картировать энзимы, мы провели контрольные опыты с тем, чтобы выделить критерии, адекватные для индукции адьювантного артрита у линейных животных в качестве модели РА у человека. Параллельно мы верифицировали картину артрита на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, и только после этого приступали к исследованию топохимии NADPH-d/NOS. Нами установлено, что:

1. Минимальная эффективная доза полного адьюванта Фрейнда, введенного в тибиотарзальный сустав, вызывает развернутую картину аутоиммунного воспаления, которая коррелирует с признаками ревматоидного артрита у человека. При этом мы не наблюдали каких-либо заметных системных проявлений: прибавка в весе у мышей с индуцированным артритом не отличается от таковой у контрольных животных, а воспалительный процесс не распространяется на соседние суставы.

2. Наиболее частыми изменениями синовиальной оболочки при введении адьюванта являются пролиферация синовиоцитов покровного слоя, лимфоидная инфильтрация, ангиоматоз и фибриноидные изменения интерстициальной ткани. При адыовантном артрите достоверно чаще, чем на других моделях, определяется накопление в инфильтрате макрофагов и лимфоцитов, что в известной степени соотносится с патоморфологией ревматоидного артрита у человека В этой связи наиболее важным морфологическим проявлением являются накопление в межуточной ткани плазмоцитов и ангиоматоз, которые статистически значимо чаще встречаются при периартикулярном введении адъюванта. Эти критерии, по нашему мнению и мнению других исследователей [82, 98], убедительно свидетельствуют в пользу специфичности моделируемого адъювантного артрита.

3. NO-ергическая функция синовиоцитов и хондробластов определяется динамикой активности NADPH-d/NOS на разных стадиях воспаления Одновременная идентификация конститутивного (c-NOS) и индуцибельного (i-NOS) изоферментов на фоне введения N-нитро-Ь-аргинина и преднизолона позволяет точнее оценить избирательное вовлечение NO-ергической компоненты в патогенез адъювантного артрита.

Прежде чем перейти к разбору функции N0 в развитии АА рассмотрим топохимию NADPH-d/NOS у здоровых мышей линии С57В1аск6. Активность NADPH-диафоразы (NADPH-d) установлена в синовиоцитах покровного и стромального слоях синовиальной оболочки у здоровых мышей. В покровном слое преобладают синовиоциты с умеренной активностью фермента (42−60 ЕОП). В субпокровном уровне NADPH-d позитивные клетки отсутствуют. Топография NADPH-d совпадает с локализацией конститутивной NOS (c-NOS). У контрольных животных в клетках хряща высокая активность NADPH-d выявляется в цитоплазме пролиферирующих хондробластов, умеренная и низкая в хондроцитах промежуточного и глубокого слоев. Таким образом, нам удалось установить наличие N0- синтетической функции у клеточных элементов хряща и синовии у интактных мышей. Выявлены различия в экспрессии NOS в интактном хряще у человека и экспериментальных животных. Определяются они различной способностью к экспрессии c-NOS, что следует принимать во внимание при оценке результатов полученных в эксперименте и их экстраполяции на человека.

Гистологическая картина адъювантного артрита имеет прогрессирующую динамику и разделяется на два этапа: ранний артрит (до 14 дней от начала введения адъюванта) и поздний или хронический артрит (30-ый день воспаления).

При топохимическом анализе NADPH-d/NOS нами установлен неоднородный паттерн активности энзимов на разных этапах течения воспалительной реакции. В синовиальной оболочке мышей обнаруживаются NADPH-d-позитивные синовиоциты покровного, субпокровного и стромального уровней синовии, сосудистые эндотелиоциты и фибробласты с высокой степенью активности энзима. На 7-й и 14-й день эксперимента количество маркированных клеток, преимущественно с высоким уровнем активности фермента, увеличивается в среднем на 30,4%. На 30-й день эти показатели заметно снижаются, приближаясь к контрольному уровню.

Иммуноцитохимическое исследование NOS показывает возрастание активности i-NOS в синовиоцитах на ранней стадии артрита. Хроническая фаза воспалительной реакции характеризуется снижением i-NOS-иммунореактивного окрашивания клеток и усилением окрашивания на c-NOS. Динамика воспаления сопровождается не только изменениями активности ферментов, но и типологического паттерна маркируемых клеток: в первую неделю адъювантного воспаления выявляются, в основном, плеоморфные синовиоциты покровного и субпокровного слоя, а на поздней стадии — клетки стромального слоя с преобладанием i-NOS-иммунореактивных фибробластов и лимфоцитов.

Гетерогенная локализация конститутивной и индуцибельной NOS указывает на неоднородное участие N0 в развитии адъювантного артрита. Локальная наработка N0 в структурах синовиальной оболочки некоторыми авторами интерпретируется как проявление защитных свойств нитроксида, которые препятствуют накоплению токсических свободных радикалов, пероксинитритов и продуктов воспалительной реакции и, таким образом, защищает от гибели синовиальные клетки [106].

Токсический и защитный эффекты, вызываемые монооксидом азота, взаимодополнительны и противостоят друг другу как элементы одного действия. Они представляют две стороны процесса, обусловленного активностью различных изоформ NOS, уровнем наработки N0 и его окислительно-восстановительным статусом [66]. Избыточная продукция монооксида азота стимулирует локальное образование супероксидных ионов, формирующих первичное звено цитотоксического эффекта. Токсические оксиданты нарушают связи между компонентами клеточных мембран и цитоплазматических белков, запуская механизмы некроза и апоптоза, что на фоне массивного поступления N0 усугубляет энергетический дисбаланс клеток синовиальной оболочки [23, 31].

Обсуждая значение NOS в развитие экспериментального артрита, приведем результаты исследований фермента на модели лаймского артрита у мышей линии DBA/2J, резистентной к развитию артрита и линии C3H/HeJ, восприимчивой к развитию артрита [97]. Авторы работы модифицировали эти линии в генетически дефицитные по экспрессии i-NOS. Несмотря на то, что обе линии были дефицитны по ключевому антимикробному агенту, гистологические признаки артрита оказались одинаковыми в обеих линиях. Другие авторы [143] изучали экспрессию i-NOS в синовиальной оболочке коз, инфицированных вирусом козьего артрита-энцефалита. В результате проведенного исследования не обнаружено доказательств прямой стимуляции вирусом экспрессии i-NOS, а также ее участия в антивирусном ответе. Наличие iNOS в синовии было выявлено только на поздних стадиях течения артрита. Большинство i-NOS-позитивных клеток не несли рецепторов МНС II класса и CD68, что позволило идентифицировать их как синовиоциты типа В [143].

Предполагается [114], что i-NOS в большей степени вовлекается в формирование рубцовой ткани воспаленного сустава. Так, на линиях мышей дефицитных по гену экспрессии i-NOS (C57BL/6Ai) в сравнении с линией мышей C57/B16Cij в условиях аутоиммунного артрита было показано, что делеция гена N0S-2 снижает количество нитротирозин-позитивных хондроцитов, уровень нитратов/нитритов в крови в первой линии [114]. Однако при этом не обнаружено разницы в экспрессии ММР-3 и ММР-9 в хондроцитах и уровне интерлейкина-1? в крови животных обеих линий [114]. Авторы делают вывод, что удаление гена iNOS не влияет на развитие артрита, но уменьшает степень дегенерации хряща [91].

С учетом вышеизложенного обнаруженное нами снижение активности индуцибельной изоформы фермента в хронической фазе экспериментального артрита дают основания поставить вопрос о протективной функции i-NOS. Этот вывод подтверждают данные, полученные на различных моделях экспериментального артрита. Авторам удалось показать, что применение селективных ингибиторов i-NOS приводило к ухудшению течения эрозивного артрита [97, 191]. Предполагают, что сущность протективного эффекта i-NOS состоит в сенсибилизации клеточных структур к апоптозу с последующей его реализацией через р53 опосредованный механизм на поздней стадии эволюции РА [116].

Усиление окрашивания синовиоцитов при реакции на NADPH-d/NOS, наблюдаемое нами в модели адьювантного артрита, следует рассматривать как проявление адаптационной активации (индукции) ферментов, возникающей в ответ на введение адъюванта. Синовиоциты способны нарабатывать высокие концентрации N0 в ответ на аппликацию IL-l?, TNF и LPS [213]. Индукция NOS в тканях сустава инициируется дистрофическими, метаболическими и ишемическими изменениями, которые неизбежно возникают в результате действия медиаторов воспаления и продуктов деятельности иммунокомпетентных клеток.

Установленные нами изменения экспрессии NOS позволяют по-новому представить патогенетическую роль N0 в развитии адьювантного синовита. В условиях острого воспаления продукция N0 вызывает токсические явления в тканях сустава и определяется суммарной активностью индуцибельной и конститутивной NOS с доминированием i-NOS. При хроническом процессе спектр эффекторного действия N0 поддерживается активностью, главным образом, конститутивного изофермента. При этом гиперпродукция N0 усиливает интенсивность воспаления, стимулирует проницаемость микрососудов и синтез свободных радикалов [91], потенцирует активность циклооксигеназ и цитокинов [86].

Согласно нашим результатам монотонная экспрессия конститутивной формы NOS на всех стадиях патологического процесса указывает на её участие в патогенезе АА через обеспечение персистирования воспаления, вероятнее всего, путем поддержки Thlтипа иммунного ответа. Убедительные доказательства такого эффекта были приведены в литературе ранее [156, 200].

Таким образом, нами установлено прямое участие NO-ергических механизмов в развитии адъювантного артрита. N0- ергические механизмы определяются функцией синовиоцитов, активность NOS в которых оказалась неоднородной: превалирование i-NOS в острой фазе на фоне перманентного синтеза n-NOS в острой и хронической фазе артрита. Всё это позволяет говорить о возможной протективной функции i-NOS и патологической n-NOS, тем более, что в последующих работах выявлено участие NOS-2 в физиологическом синтезе N0 и участие NOS-1 и N0S-3 в дополнительном синтезе NO при воспалительных заболеваниях [58]. Можно предполагать, что активация N0S-2 -составная часть защитно-адаптационных реакций [58].

Интересные данные получены нами при исследовании локализации NADPH-d/NOS на фоне введения неселективного блокатора ферментов N-нитро-Ь-аргинина и преднизолона. Оба агента вызывают существенную регрессию численности иммунореактивных клеток, но, вероятно, действуют на разные популяции синовиоцитов. При аппликации N-Hmpo-L-аргинина происходит снижение активности NADPH-d, i-NOS и c-NOS в макрофагах стромального слоя, а также в других клетках всех слоев синовиальной оболочки.

Действие N-нитро-Ь-аргинина заключается в подавлении одинаково эффективном как конститутивных, так и индуцибельной изоформ NOS [9]. В результате их использование приводит к нежелательному снижению активности iNOS. Поскольку в ряде работ при использовании N-mnpo-L-аргинина противовоспалительный эффект не достигался, а в некоторых случаях исход воспаления (возникновение эрозии суставов) даже ухудшался, предполагается, что для достижения противовоспалительного эффекта полная блокада синтеза N0 необязательна [191]. Это предположение исходит из того, что защитный эффект ингибиторов NOS определяется не полным прекращением синтеза N0, а снижением его до уровня, при котором супероксиддисмутаза начинает активно взаимодействовать с супероксидом, защищая синовию от него и одновременно препятствуя образованию пероксинитрита и вторичных оксидантов [10].

Неоднородное действие^{нитро-Ь-аргинина} обусловлено не только различной типологией обнаруженных синовиоцитов, но и, по-видимому, их неодинаковым участием в поддержании NO-ергического баланса при развитии адъювантного воспаления. Эти данные согласуются с влиянием L-аргинина (L-Arg) на характер течения аутоиммунного воспаления. Установлено, что при адьювантном артрите L-аргинин оказывает противовоспалительное действие, которое связывают с его влиянием на синтез N0 и антиноцицептивным эффектом [84]. При адьювантном артрите L-Arg опосредует выработку опиоидного дипептида киоторфина, который даже в незначительных концентрациях вызывает анальгезию и, таким образом, сдерживает развитие отека периартикулярных тканей [129] Нитропроизводные L-аргинина, блокируя активный центр NOS, снижают активность гуанилатциклазы, что в конечном итоге усиливает болевые реакции и ведет к отеку пораженной конечности. Можно полагать, что аппликация N-нитро-Ь-аргинина в эксперименте потенциирует механизмы адъювантного артрита, несмотря на снижение активности NOS.

Антиили провоспалительное действие блокаторов NOS находится в определенной зависимости от стадии воспаления, на которой происходит экспозиция препарата. Однако в отличие от^{нитро-Ь-аргинина,} локальное действие преднизолона на NO-синтазную функцию синовиальной оболочки направлено преимущественно в сторону снижения напряженности воспалительного процесса. Преднизолон действует на экспрессию энзимов в синовиоцитах, находящихся, главным образом, в глубоком уровне стромального слоя. Снижение активности фермента в этих условиях сопряжено с преобладанием кластерных форм синовиоцитов притом, что тотальная инактивация NOS в них не обнаруживается. Фармакодинамика кортикостероидов включает в себя влияние на различные звенья NOS-зависимого синтеза N0. Преднизолон укорачивает период полураспада мРНК-N0S-2 внутри клеток [58], снижает внутриклеточное содержание мРНК-NOS-l, mPHK-NOS-2 и mPHK-NOS-3 [58], способствует дезинтеграции синтезированных молекул NOS [58], уменьшая проявления воспаления при АА.

Таким образом, применение специфического неселективного и неспецифического блокаторов нитроксидсинтаз в модели адъювантного артрита у линии мышей С57В1аск6 подтвердило наличие NO-ергической функции синовиоцитов и её активное участие в развитии аутоиммунного воспаления. При этом применение специфических ингибиторов NOS не обязательно будет сопровождаться противовоспалительным эффектом.

Влияние NO-синтазной компоненты на развитие адъювантного воспаления не ограничивается клетками синовиальной оболочки. Хронизация воспаления неизбежно распространяется на хрящевую ткань, что в дальнейшем ведет к формированию паннуса и деструкции сустава. Указанным изменениям хряща всегда сопутствует хронический пролиферативный синовит, причем пролиферативная реакция, так же, как и хрящевая структурно-функциональная деградация, демонстрируют отчетливую связь с динамикой активности NOS.

У мышей при введении адъюванта высокая активность NADPH-d/NOS выявляется в цитоплазме пролиферирующих хондробластов в краевой зоне хряща, и хондроцитах, формирующих изогенные группы в глубоких его отделах. Если на ранней стадии воспаления хондроциты экспрессируют высокую активность NADPH-d, то по мере прогрессирования патологического процесса степень окрашивания клеток неизменно снижается. Эта зависимость сопровождается редукцией слоев хрящевой ткани, дезорганизацией лакун и дистрофическими изменениями цитоплазмы хондробластов и хондроцитов. Воспалительное поражение ведет также к общим изменениям тинкториальных свойств межуточной ткани хряща.

У грызунов в норме NADPH-d маркирует все типы хрящевых клеток. Поэтому падение активности NADPH-d при адъювантном артрите носит, по нашему мнению, реактивный характер и является результатом действия гуморальных факторов воспаления, циркулирующих в синовиальной жидкости. Важно подчеркнуть, что у человека хондроциты в норме не экспрессируют NOS [145]. Эта разница в локализации фермента свидетельствует о том, что экстраполяция на человека данных, полученных при изучении артрита с использованием экспериментальных животных, имеет определенные ограничения.

Анализ результатов экспериментального исследования в сопоставлении с литературными данными позволяет констатировать, что синовит является необходимым условием для развития дистрофии хряща вследствие раннего угнетения синтетической активности хондроцитов. При этом хрящевая дистрофия может быть определена как N0- зависимый процесс.

Итак, в развитии адъювантного воспаления принимают участие нитрооксидергические механизмы. Выявленные изменения состояния NADPH-диафоразы, индуцибельной и конститутивной NO-синтазы в синовиоцитах и хондробластах, а также фармакологическая коррекция активности ферментов достаточно объективно свидетельствуют о прямом и неоднозначном влиянии оксида азота на патогенез адъювантного воспаления Иммуноцитохимическое исследование NOS показывает возрастание активности i-NOS в синовиоцитах на ранней стадии артрита. Хроническая фаза воспалительной реакции характеризуется снижением i-NOS-иммунореактивного окрашивания клеток и сохранением окрашивания на c-NOS. Обсуждена протективная функция iNOS в развитии АА и провоспалительная c-NOS на всех стадиях воспалительного процесса при АА. Ы-нитро-Ь-аргинин тотально блокирует активность NADPH-d, i-NOS и c-NOS в макрофагах и синовиоцитах во всех слоях синовиальной оболочки. Выяснено, что для достижения противовоспалительного эффекта полная блокада синтеза N0 необязательна. В отличие от N-HHTpo-L-аргинина, локальное действие преднизолона на NO-синтазную функцию синовиальной оболочки направлено преимущественно в сторону снижения напряженности воспалительного процесса. Наши исследования указывают на непосредственную связь изменений активности NADPH-d/NOS хряща с динамикой развития адъювантного воспаления.