Разработка комплексного иммуноферментного теста на основе антигенных препаратов гормонопродуцирующих органов

В настоящее время различными эндокринными заболеваниями страдает около 7−8% населения страны. Ежегодно отмечается рост заболеваемости практически для всех нозологических форм эндокринной патологии, сопровождающихся ранней инвалидизаци^й и смертностью, а также требующих больших экономических затрат на лечение и заместительную терапию. Манифестные формы сахарного диабета, по данным обращаемости в поликлинические учреждения, имеет около 1,5% населения страны. По данным эпидемиологических исследований эти показатели в 2−2,5 раза выше [9].

В настоящее время признано, что система иммунитета находится в субординационных отношениях с нервной и эндокринной системами, оказывая на них регуляторно-эффекторное влияние [1,42,181]. Новые достижения в экспериментальной и клинической иммунологии позволили пересмотреть вопросы этиологии, патогенеза, диагностики и лечения многих эндокринных заболеваний. Окончательно установлена аутоиммунная природа целого ряда эндокринных заболеваний.

Научные исследования последних лет убедительно показали, что иммунная система обладает высокой чувствительностью ко многим химическим соединениям, радиоактивным веществам, а также неблагоприятным факторам физической природы, что неизбежно сопровождается снижением резистентности организма к инфекционным агентам и повышением риска возникновения аутоиммунных состояний и заболеваний [44]. Подтверждением этому является тенденция к увеличению распространенности аутоиммунных заболеваний в целом Так, на фоне общего роста заболеваемости болезнью Аддисона отмечается прогрессирующее преобладание первичной надпочечниковой недостаточности над болезнью Аддисона туберкулезной этиологии [52]. Отмечается резкое увеличение заболеваемости болезнями щитовидной железы, прежде всего, на территориях, подвергшихся загрязнению радиоактивным' i веществами в результате аварии на Чернобыльской АЭС, а также на территориях с неудовлетворительным состоянием профилактики йод дефицитных состояний [30] Обращает внимание значительное повышение удельного веса аутоиммунного тироидита среди других форм тироидной патологии, которые, в свою очередь, также сопровождаются и осложняются аутоиммунными реакциями, как правило, на территориях с высоким уровнем техногенного загрязнения [49].

На современном этапе становится очевидным, что бактериальные, вирусные и паразитарные антигены, имеющие перекрестно-реагирующие детерминанты с антигенами тканей и органов человека, в определенных условиях инициируют и поддерживают аутоиммунные реакции Концепция о том, что молекулярная мимикрия возбудителей инфекционных заболеваний и даже нормальной микрофлоры под ткани хозяина может составлять первичную основу в развитии аутоиммунных реакций, продолжает доминировать над многими гипотезами в этой области [100,116,128,137,151].

В большом числе случаев аутоиммунная обменно-эндокринная патология имеет син-дромальное, полигландулярное течение В настоящее время нет единого мнения в отношении классификации аутоиммунных полигландулярных синдромов Достаточно отметить, что компонентами синдромов являются первичная надпочечниковая недостаточность, аутоиммунный тироидит, диффузный токсический зоб, сахарный диабет 1 типа, гипопаротироз, первичный гипогонадизм, пернициозная анемия и другие заболевания.

Многообразие и неспецифичность клинических проявлений большей части аутоиммунной обменно-эндокринной патологии служит причиной того, что верификация диагноза возможна только на основе лабораторно-инструментальных методов Особенно важна своевременная диагностика на ранних этапах формирования заболевания, когда еще высока возможность эффективного использования средств вторичной профилактики.

Анализ данных, полученных при изучении аутоиммунных заболеваний эндокринной системы, в том числе и полигландулярных синдромов, свидетельовует о значительной вариации показателей гуморального аутоиммунитета. Прежде всего это касается активности органоспецифических аутоантител, которые рассматриваются как маркеры при данной патологии [43,90,156]. Широкое распространение получили диагностикумы на основе антигенов щитовидной железы, индекс информативности которых, по оценкам отдельных авторов, составляет 90−95% [23,40]. В настоящее время большое значение приобретает определение антител в диагностике других эндокринных заболеваний аутоиммунного происхождения. Так, основным критерием для начала проведения профилактических мероприятий в ряде стран является определение аутоантител к антигенам поджелудочной железы [111,125,189].

Одним из современных высокочувствительных методов определения антител является иммуноферментный анализ. Использование в едином иммуноферментном тесте панели различных препаратов органоспецифических антигенов могло бы позволить проводить одновременное сравнение и изучать частоту вовлечения органов эндокринной системы в аутоиммунные процессы, оценивать активность, распространенность и преимущественное направление аутоиммунного процесса при некоторых заболеваниях и состояниях органов эндокринной системы. Учитывая высокую чувствительность иммунной и эндокринной систем к действию факторов окружающей среды использование такой тестсистемы позволило бы проводить прескриптивную диагностику и определять «неблагополучие» в иммуно-нейроэндокринной системе, формировать группы риска по развитию заболеваний органов эндокринной системы с последующим мониторингом.

Целью настоящего исследования является разработка комплексной скрининговой им-муноферментной тест-системы для определения антител к органоспецифическим антигенам органов эндокринной системы.

Задачи исследования:

1. Выделить антигенные препараты из тканей гипофиза, щитовидной железы, под-желудочнои железы, надпочечника, яичника и желудка.

2. На основании результатов физико-химического и иммунохимического анализа обосновать применение отдельных антигенных препаратов гормонпродуцирую-ших органов для создания единого теста на их основе.

3. Разработать скрининговую иммуноферментную тест-систему на основе выделенных антигенных препаратов.

4. Определить с помощью разработанного теста активность IgG антител в сыворотках крови здоровых и больных различными заболеваниями людей.

Научная и теоретическая новизна работы.

Впервые выделены по единой методике и охарактеризованы по химическим, иммунохи-мическим и физико-химическим параметрам антигенные препараты из гормонпродуцирую-щих органов: гипофиза, щитовидной железы, желудка (слизистого и мышечного слоев), поджелудочной железы, надпочечника и яичника.

С помощью методов иммунохимического анализа (преципитация в геле, иммуноэлектро-форез, торможение ИФА) установлено наличие в микросомальных фракциях перечисленных органов и в составе цитоплазматической фракции щитовидной железы органоспецифических антигенов.

Впервые на основе семи микросомальных и одной цитоплазматической антигенных фракций разработан комплексный унифицированный скрининговый иммуноферментный тест для определения IgG антител к антигенам гормонпродуцирующих органов, обладающий высокой специфичностью и воспроизводимостью результатов.

Разработан метод отбора из состава субклеточных фракций диагностически значимых антигенов, сочетающий в себе гель-фильтрацию и ИФА.

С помощью разработанного теста впервые оценено состояние гуморального аутоиммуни-тета у доноров крови гг. Москвы и Тулы, пожилых людей, больных различными аутоиммунными заболеваниями. Установлена высокая частота аутоиммунных расстройств в отношении антигенов щитовидной железы у доноров г. Тулы, а в отношении антигенов яичника — у доноров г. Москвы. Установлена более частая активность IgG антител к антигенам щитовидной железы в сыворотках лиц пожилого возраста. Выявлена высокая встречаемость полигланду-лярных проявлений у больных с заболеваниями ДТЗ, АИТ, СД-1, ДБСТ.

С помощью иммуноблотта выявлены перекрестнче реакции между антигенами препаратов щитовидной железы и антигенами различной природы Y enterocohtica Практическая ценность.

Разработана комплексная иммуноферментная тест система для одновременного определения IgG антител в сыворотках крови к 8 антигеным препарат am гормонпродуцирующих органов.

Основные положения выносимые на защиту.

1. Микросомальные фракции гипофиза, щитовидной железы, слизистого и мышечного слоев желудка, поджелудочной железы, надпочечника и яичника и цитоплазматической фракции щитовидной железы содержат органоспецифические антигены и могут быть использованы для создания на их основе иммуноферментной тест-системы 2 Разработана унифицированная иммуноферментная тест-система, обладающая высокой специфичностью, надежностью Основной ее особенностью является одновременное выявление активности антител к антигенным препаратам шести гормонпродуцирующих органов (гипофиз, щитовидная железа, желудок, поджелудочная железа, надпочечник и яичник).

3. Активность IgG антител сывороток к антигенам отдельных гормонпродуцирующих органов может зависеть от экологических и эндемических условий проживания людей в геохимических провинциях. Высокая активность IgG антител сывороток больных аутоиммунными заболеваниями в отношении целого ряда органоспецифических антигенов свидетельствует о частом вовлечении в аутоиммунный процесс одновременно нескольких органов эндокринной системы.

4. Субклеточные фракции щитовидной железы и антигенные препараты Y enterocolitica имеют в своем составе перекрестно-реагирующие антигены.

Апробация материалов диссертации и публикации. Материалы диссертационной работы доложены: на двух конференциях молодых ученых НИИВС им И. И. Мечникова РАМН (февраль 2000, март 2001) — Международном конгрессе «Современные методы диагностики и лечения аллергии, астмы и иммунодефицитов», Тбилиси, Грузия, 23−26 сентября 1999 г., VI Международном конгрессе «Успехи в иммунологии и аллергологии на пороге XXI века», Эйлат, Израиль, 3−6 мая 2000 г.- Ш съезде иммунологов и аллергологов СНГ, Сочи, Россия, 16−20 сентября 2000 г.- VII Международном конгрессе «Аллергия, иммунология и глобальная сеть: взгляд в новое тысячелетие», Нью-Йорк, США, 14−17 апреля 2001 г.

По материалам диссертации опубликовано 12 работ, из них 4 в центральной печати.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 130 страницах машинописного текста, иллюстрированы 3 схемами, 10 таблицами и 14 рисунками Список литературы включает 196 источников из них 63 на русском языке.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

5. ВЫВОДЫ.

1. Выделены по единой методике препараты антигенов субклеточных фракций гипофиза, щитовидной железы, поджелудочной железы, желудка (слизистого и мышечного слоев), надпочечника и яичника.

2. На основании результатов иммунохимического анализа доказано наличие в субклеточных микросомальных и цитоплазматических фракциях исследованных органов органос-пецифических антигенов.

3. Обоснована возможность использования антигенов микросомальных фракций гипофиза, щитовидной железы, поджелудочной железы, желудка (слизистого и мышечного слоев), надпочечника и яичника и цитоплазматической фракции щитовидной железы для создания единого комплексного иммуноферментного теста на их основе.

4. Разработана унифицированная иммуноферментная тест-система для одновременного определения IgG антител к восьми антигенным препаратам гормонпродуцирующих органов в сыворотке крови людей. Показана высокая специфичность и надежность теста (не менее 90%).

5. Впервые показана возможность совместного использования методов гель-фильтрации и ИФА для отбора антигенных фракций для дальнейшего их применения в диагностике заболеваний.

6. Разработанная тест-система впервые применена для скрининга сывороток крови доноров гг. Москвы и Тулы, лиц пожилого возраста и больных различными заболеваниями.

• Установлена более высокая активность IgG антител к антигенам щитовидной железы у доноров г. Тулы, в 15 раз превышающая этот показатель для доноров г. Москвы.

• При скрининге сывороток крови больных аутоиммунными заболеваниями эндокринной системы и диффузными заболеваниями соединительной ткани, установлена высокая активность IgG антител не только в отношении органов и тканей нозологически связанных с заболеванием, но и в отношении целого ряда органоспецифических антигенов, что свидетельствует о частом вовлечении в аутоиммунный процесс одновременно нескольких органов эндокринной системы. 7. Установлено наличие перекрестно-реагирующих антигенов в составе субклеточных фракций щитовидной железы и Y.enterocolitica.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

.

Современный этап развития науки ознаменовался формированием новой области знания* нейроиммуноэндокринологии [1]. В настоящее время признано, что система иммунитета находится в субординационных отношениях с нервной и эндокринной системами, оказывая на них регуляторно-эффекторное влияние [181,42]. Несмотря на то, что имеется большое количество информации относительно деталей иммунопатологии, понимание этиологических и патогенетических механизмов аутоиммунных болезней остается недостаточным. Вместе с тем, научный прогресс в области иммунологии привел к пересмотру вопросов этиологии, патогенеза, диагностики, лечения, а в последнее время и профилактики заболеваний эндокринной системы аутоиммунного генеза с позиций современной иммунологии.

Научные исследования последних лет убедительно показали, что иммунная система обладает высокой чувствительностью ко многим химическим соединениям, радиоактивным веществам, а также неблагоприятным факторам физической природы. Это неизбежно сопровождается снижением резистентности организма к инфекционным агентам и/или повышением риска возникновения аутоиммунных состояний и заболеваний [44] Подтверждением научных исследований в этой области является тенденция к увеличению распространенности аутоиммунных заболеваний в целом. Так на фоне общего роста заболеваемости болезнью Адцисона отмечается прогрессирующее преобладание первичной надпочечниковой недостаточности над болезнью Аддисона туберкулезной этиологии [52] Отмечается резкое увеличение заболеваемости болезнями щитовидной железы, прежде всего на территориях подвергшихся загрязнению радиоактивными веществами в результате аварии на Чернобыльской АЭС, э также на территориях с неудовлетворительным состоянием профилактики йод-дефицитных состояний, связанных с проживанием в геохимических провинциях дефицитных по йоду [30]. Обращает внимание значительное повышение удельного веса аутоиммунного тироидита среди других форм тироидной патологии, которые, в свою очередь, также сопровождаются и осложняются аутоиммунными реакциями, как правило, на территориях с высоким уровнем техногенного загрязнения [49]. В настоящее время, вопрос об оценке биологического действия радиационных факторов связан еще и с оценкой последствий использования обедненного урана в Ираке и Косово. Данное положение указывает на возможность и необходимость использования иммунологических методов как для диагностики донозологи-ческих состояний организма, так и для оценки и прогнозирования отдаленных последствий воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды при отсутствии инструмента их оценки другими методами. Гигиеническая донозологическая диагностика признана ВОЗ концептуальной основой развития гигиены на ближайшую перспективу.

На современном этапе становится очевидным, что бактериальные, вирусные и паразитарные антигены, имеющие перекрестно-реагирующие детерминанты с антигенами тканей и органов человека, в определенных условиях инициируют и поддерживают аутоиммунные реакции. Концепция о том, что молекулярная мимикрия возбудителей инфекционных заболеваний или даже нормальной бактериальной флоры может составлять первичную основу в развитии аутоиммунных реакций, продолжает доминировать над многими гипотезами в этой области. В большом числе случаев аутоиммунная обменно-эндокринная патология имеет синдромальное, полигландулярное течение. В настоящее время нет единого мнения в отношении классификации аутоиммунных полигландулярных синдромов. Достаточно отметить, что компонентами синдромов являются: первичная надпочечниковая недостаточность, аутоиммунный тироидит, диффузный токсический зоб, сахарный диабет 1 типа, гипопаротироз. первичный гипогонадизм, пернициозная анемия и другие заболевания, имеющие большое социально-экономическое значение. Актуальность проблемы объясняет большой интерес исследователей в зарубежных странах к вопросам этиопатогенеза и диагностики, как самостоятельных аутоиммунных заболеваний эндокринной системы, так и эндокринопатий в составе аутоиммунных полигландулярных синдромов [178, 156]. Следует отметить, что многообразие и неспецифичность клинических проявлений большей части аутоиммунной обмен-^ но-эндокринной патологии, служит причиной того, что верификация диагноза возможна только на основе лабораторно-инструментальных методов, особенно на ранних этапах формирования заболевания, когда еще высока возможность эффективного использования средств вторичной профилактики.

Анализ данных, полученных авторами, при изучении аутоиммунных заболеваний эндокринной системы, в том числе и полигландулярных синдромов, свидетельствует о значительной вариации показателей гуморального аутоиммунитета. Прежде всего это касается ор-ганоспецифических аутоантител, которые рассматриваются в настоящее время как маркеры при данной патологии [447]. Это обстоятельство свидетельствует о полиморфизме заболеваний и синдромов этой группы, особенностях развития и течения заболеваний, характеризующихся длительным субклиническим течением. А отсутствие единого стандарта применяемых иммунологических тестов детекции аутоантител, затрудняет анализ и сопоставление результатов, полученных исследователями в различных лабораториях. Феномен аутоантител, несмотря на отсутствие единого мнения о патогенетической роли аутоантител в развитии аутоиммунных заболеваний, на сегодняшний день является самым доступным для создания на его основе диагностических систем и перспективным для использования в терапии различных заболеваний и состояний аутоиммунного генеза.

Аутоантитела, специфичные для аутоантигенов, обеспечивают важные характеристические свойства аутоиммунных болезней, оказывая действие на определенные органы или ткани. Большое количество тканеи органоспецифических мембранных рецепторов, ферментов и секретируемых гормонов, являющихся специфичными для повреждаемых клеток при аутоиммунных эндокринопатиях и других ассоциированных болезнях, в настоящее время рассматриваются и идентифицируются как аутоантигены-мишени. В отличие от роли аутоантител против внутриклеточных ферментов, патогенетическая роль аутоантител против некоторых клеточных рецепторов хорошо изучена. Идентификация аутоантигенов позволяет улучшать диагностику аутоиммунных состояний и определять индивидуальную предрасположенность к развитию болезней, что, в конечном счете, должно помочь осуществлению предотвращения болезни посредством разработки терапевтических стратегий.

Несмотря на актуальность, очевидную значимость и широту возможного применения органоспецифических антигенов, в настоящее время в нашей стране объем научных исследований в этой области крайне мал. Имеются лишь единичные работы по изучению антигенной структуры тканей и органов человека, выделению отдельных антигенов и разработке на их основе диагностических систем. Вместе с тем, практически все научные и диагностические исследования по изучению и оценке показателей гуморального аутоиммунитета выполняются с использованием коммерческих тест-систем зарубежного производства. Использование данного вида лабораторной диагностики, признанного основополагающим при аутоиммунной патологии, в практической медицине нашей страны крайне ограничено, прежде всего, высокой стоимостью зарубежных тест-систем, при практически полном отсутствии аналогичных тест-систем отечественного производства. Указанные обстоятельства диктуют необходимость всестороннего изучения органоспецифических антигенов, разработки методов их выделения, характеристики и создания на их основе диагностических тест-систем в нашей стране.

Основываясь на знаниях того, что субклеточные структуры клеток функционально различных органов имеют не только морфологические и цитохимические, но и иммунохими-ческие отличия, субклеточное фракционирование (рисунок 1) явилось основой в получении антигенных препаратов гормонпродуцирующих органов. В последующих исследованиях были использованы только две субклеточные фракции (микросомальная и цитоплазматическая) гормонпродуцирующих органов. По данным литературы антигены этих фракций наиболее часто вовлекаются в аутоиммунные процессы и определение аутоантител к ним имеет большое диагностическое значение. Таким образом, нами получены субклеточные фракции следующих органов: гипофиз, щитовидная железа, желудок (слизистый и мышечный слои), поджелудочная желе id, надпочечник и яичник. Химический анализ субклеточных фракций i позволил заключить, что микросомальные фракции обладают достаточно стабильными характеристиками химического состава. Низкий процент содержания нуклеиновых кислот в их составесвидетельствует об эффективности проведенного фракционирования.

Результаты гель-фильтрации свидетельствуют о том, что препараты субклеточных фракций различных гормонпродуцирующих органов имеют выраженную индивидуальную хроматографическую картину, воспроизводимую и сохраняющуюся как при повторных исследованиях, так и при исследовании различных серий препаратов выделенных в разное время с использованием разного секционного материала. Поэтому гель-фильтрация может быть методом промежуточной стандартизации и контроля на этапе субклегочного фракционирования.

Результаты SDS-электрофореза в ПААГ позволили заключить, что анализируемые препараты характеризуются выраженной гетерогенностью полипептидного состава. Сравнение полипептидного спектра позволило выявить индивидуальные белоксодержащие компоненты для каждого из исследованных препаратов.

Заключение

гистоморфологического исследования, свидетельствует о том, что в процессе многократной иммунизации антигенными препаратами различных органов человека в соответствующих органах (щитовидная железа, желудок, поджелудочная железа и яичник) лабораторных животных обнаружены признаки асептического воспаления аналогичные регистрируемым при соответствующих аутоиммунных заболеваниях.

Первичный иммунохимический анализ антисывороток, выполненный с использованием метода двойной радиальной диффузии в агарозном геле, позволил отметить резулыатив-ность использованной схемы иммунизации, о которой свидетельствует содержание преципи-тирующих антител к антигенам, использованным при иммунизации. Анализ результатов преципитации позволили установить наличие в составе микросомальных фракций гипофиза, поджелудочной железы, яичника и микросомальной и цитоплазматической фракций щитовидной железы органоспецифических антигенов. Дальнейшая иммунохимическая характеристика полученных препаратов с использованием метода одномерного иммуноэлектрофореза позволила заключить, что анализируемые препараты характеризуются выраженной гетерогенностью по физико-химическим свойствам соответствующих антигенов, в первую очередь, по заряду их молекул Это позволяет предположить наличие органоспецифических антигенов в составе каждой из субклеточных антигенных фракций Выраженная органная специфичность препаратов микросомальных фракций различных органов дала основание для их дальнейшего использования при разработке теста При этом, учитывая выраженные различия в антигенном составе цитоплазматической и микросомальной фракций щитовидной железы, выявленные при анализе этих препаратов с использованием различных методов, а также высокая диагностическая значимость определения аутоантител к целому ряду антигенов этого органа, мы сочли необходимым использование обеих фракций щитовидной железы при разработке скрининговой тест системы.

Поскольку большинство препаратов, помимо антигенов обладающих органной специфичностью, имели в своем составе перекрестно-реагирующие антигены, было необходимо разработать такие условия ИФА, при которых органная специфичность была наиболее выражена На этапе разработки иммуноферментной скрининговой тест-системы нами были определены оптимальные концентрации антигенов для активации полистирольных планшетов оптимальное разведение исследуемых сывороток, а также оптимальное разведение коныога-та антител с ферментом Следует отметить, что при разработке тест-системы, включающей в себя одновременно несколько антигенных препаратов, мы преследовали цель добиться как можно большей унификации теста, которая, помимо упрощения и облегчения процесса постановки анализа, в значительной мере является инструментом предотвращения возможных факторных ошибок при выполнения многокомпонентного анализа Для достижения этой цели мы создали тест-систему, в состав которой входит восемь различных антигенов Определение антител к ним, на наш взгляд, имеет наибольшее диагностическое значение Параметром унификации тест-системы являлось определение сорбционной дозы для каждого используемого антигена, при которой результаты отрицательного и положительного контролей помимо максимальной разницы, имели бы стандартные значения, характеризовались низкими фоновыми значениями и максимально нивелировали перекрестные реакции. При этом, как методика постановки анализа при практическом использовании тест-системы, так и подходы к оценке результатов анализа являлись едиными для всех антигенов.

Исследование сывороток 101 донора крови Москвы с целью определения точки отсечения отрицательных показателей показало, что около 90% сывороток в рабочем разведении имели разницу оптической плотности от -0,1 до +0,1. Исходя из этого, такие значения в дальнейшем рассматривались как показатели нормы, а значения с величиной разности оптической плотности > +0,2 рассматривались как положительные. Следует отметить, что для иммуносорбентов различной специфичности, указанные параметры были общими. Это является подтверждением правильности определения дозы антигена для сорбции.

Исследование воспроизводимости результатов при анализе стандартных сывороток с низким и высоким содержанием антител показали, что коэффициент вариации результатов для тест-системы не превышал 8,7%, что свидетельствует о высокой точности и надежности тест-системы. В связи с тем, что мы не располагали достаточным для статистических исследований количеством охарактеризованных другими методами сывороток, необходимых для расчета чувствительности теста, в настоящее время на основании анализа сывороток доноров крови, мы можем сделать заключение только о высокой специфичности теста (не ниже 90%). Еще одним доказательством специфичности теста являются результаты перекрестного торможения иммуноферментной реакции.

Таким образом, в результате выполненных исследований по химической, физико-химической и иммунохимической характеристике препаратов субклеточных фракций гор-монпродуцирующих органов и комплекса исследований, выполненных на этапе разработки теста, нами разработана комплексная, унифицированная скрининговая тест-система на основе антигенов микросомальных фракций гипофиза, щитовидной железы, слизистого и мышечного слоев желудка, поджелудочной железы, надпочечника, яичника и цитоплазматиче-ской фракции щитовидной железы, обладающая высокой надежностью (> 90%) и специфичностью («90%).

Использование в комплексном скрининговом тесте антигенов микросомальных фракций, на наш взгляд, является правомерным, поскольку эти фракции содержали в своем составе комплекс диагностически значимых антигенов Подтверждением этому являются результаты сочетанного использования гель-фильтрации и ИФА при анализе сывороток больных Предложенная нами методика позволит в дальнейшем использовать два хорошо известных л распространенных метода для отбора гель-фильтрационных фракций антигенных препаратов, обладающих диагностической значимостью при определенной патологии.

Разработанный тест был использован для анализа активности IgG антител в сыворотках здоровых и больных различными заболеваниями людей При анализе результатов исследования сывороток доноров крови городов Москвы и Тулы выявлена достоверно более часто регистрируемая высокая активность IgG антител к антигенам щитовидной железы у доноров Тулы, которая в 15 раз превышала аналогичные показатели у однотипной по полу и возрасту группы доноров Москвы Позитивные реакции с большинством других органоспецифических антигенов у доноров Москвы и Тулы не имели достоверных различий Данное обстоятельство, на наш взгляд, может быть объяснено воздействием ряда неблагоприятных факторов окружающей среды (йодный дефицит, воздействие радиации вследствие аварии на ЧАЭС) на доноров г Тулы.

При сопоставлении результатов ИФА сывороток крови, положительно реагировавших с антигенами щитовидной железы и антигенами Y enterocohtica, обнаружено, что среди 103 сывороток доноров г Москвы высокую активность антител к ЛПС Y enterocohtica имело 15 человек, а среди доноров г Тулы — у 14 человек Однако из 15 позитивных к Y enterocohtica сывороток доноров Москвы только одна реагировала с антигенами щитовидной железы, среди позитивных сывороток доноров Тулы таких сочетаний было 13, что составило 78,6% Полученные результаты можно расценивать как свидетельство наличия перекрестно-реагирующих эпитопов в составе антигенов щитовидной железы и Y enterocolitica.

Разработанные иммуноферментный тест был использован для скрининга сывороток крови лиц пожйлого возраста (65 лет и старше), проживающих в пансионате ветеранов труда г Москвы Данное исследование, помимо собственно определения частоты обнаружения высокой активности IgG антител к антигенам гормонпродуцирующих органов, преследовало цель изучения динамики образования аутоантител при иммунизации этого контингента гриппозной вакциной Гриппол и при сочетании введения этой вакцины с поликомпонентной вакциной из антигенов условно-патогенных бактерий ВП-4 Результаты исследований позволяю заключить, что пожилые люди, чаще чем доноры Москвы, имели положительные реакции с антигенами гормонпродуцирующих органов Однако, только в случае определения антител к антигенам щитовидной железы эти различия носили достоверный характер Изучение динамики антителообразования у вакцинированных пожилых людей до, через один и пять месяцев после вакцинации свидетельствовало об отсутствии нарастания активности антител в процессе вакцинации обоими препаратами.

За время выполнения работы нами был собран банк сывороток, состоящий из 618 образцов 12 нозологических форм заболеваний эндокринной системы Следует отметить, что при поступлении сывороток для анализа, достаточно часто мы располагали лишь клиническим диагнозом, в связи, и были лишены возможности группировать больных по полу, возрасту, длительности заболевания и характеру проводимой терапии Достоверные различия в активности антител, по сравнению с контрольной группой доноров станций переливания крови г Москвы, наблюдали в группе больных ДТЗ к антигенам щитовидной, поджелудочной желез и надпочечника При этом, наиболее высокая активность антител была вь’ражена у 27−29% пациентов с антигенами щитовидной железы и слизистого слоя желудка Аналогичную зависимость наблюдали в группе больных аутоиммунным тироидитом, при котором частота выявления высокой активности к антигенам щитовидной железы превышала 40%.

В группе больных СД-1 наиболее высокую частоту позитивных реакций регистрировали в отношении антигенов щитовидной железы и желудка (23−25%). При этом наблюдали высокую активность антител к антигенам поджелудочной железы с частотой обнаружения, не превышающей 14%. В группе больных СД-2 аналогичный показатель был выше и составил 17,9%. В тоже время, наличие у значительной части больных СД-1 высокой активности антител не только к антигенам поджелудочной железы, но и к антигенам других органов, обнаруживаемые в отдаленные сроки от манифестации заболевания, является еще одним подтверждением аутоиммунной природы СД-1.

У больных хроническим гастритом, достоверно чаще обнаруживали IgG позитивные реакции к антигенам желудка (24−30%) и щитовидной железы (18−20%).

Достоверно чаще, чем у доноров, в сыворотках крови больных первичной хронической надпочечниковой недостаточностью была вьивлена высокая активность антител к антигенам микросомальной фракции надпочечников (58,3%).

Для остальных исследуемых нозологических групп больных регистрировали высокую частоту определения антител к различным антигенам. Однако, эти различия не носили достоверного характера, что можно объяснить статистически-малой численностью исследованных групп.

Поскольку среди сывороток больных большую долю составляли больные сахарным диабетом и аутоиммунным тироидитом, и эти группы характеризовались наиболее частыми положительными реакциями с антигенами разных эндокринных органов нами была определена частота сочетания в этих группах активности антител к антигенам нескольких органов Антитела к антигенам двух органов при СД-1 и СД-2 типов обнаруживали в 11,6−12% случаев. Сочетанную высокую активность к антигенам трех и более органов регистрировали в 15,8 и 9,3% случаев соответственно. В сыворотках больных АИТ частота указанных сочетаний была достоверно выше и составила — к антигенам двух органов -22,8%, а к трем и более-18,7%. Таким образом, полученные результаты указывают на сочетанное вовлечение в патологический процесс двух и более органов эндокринной системы и свидетельствуют о диагностической ценности комплексного подхода при диагностике аутоиммунных эндокринопа-тий.

При изучении активности антител у 124 больных ДБСТ, сочетание которых с эндокринной патологией ряд авторов выделяет в АПС-4 типа, среди больных СКВ и ССД довольно часто были выявлены случаи высокой активности антител к антигенам щитовидной железы (24,2−19,4%). Сыворотки больных СКВ характеризовались также высокой частотой позитивных реакций с антигенами других органов — поджелудочной железы (27,2%), желудка (24,2%) и надпочечника (21,2%). Анализ полученных результатов показал, что нередко один и тот же больной имел высокую активность антител одновременно к антигенам нескольких гормонпродуцируюш! х органов. Частота таких сочетаний у больных СКВ составила 24%, а при ССД-13,4%, что позволяет предположить сочетание системных аутоиммунных заболеваний с АПС.

При сопоставлении полученных данных с результатами определения высокой активности антител к антигенам условнопатогенных бактерий, выявлена высокая частота положительных определений IgM антител к антигенам Y. enterocolitica, S. aureus, Ecoli, P. mirabilis и IgG антител к антигенам щитовидной железы. На основании полученных результатов можно предположить наличие в антигенном составе щитовидной железы перекрестно-реагирующих антигенов не только с антигенами Y. enterocolitica, но и трем видами других условнопатогенных бактерий, что, в свою очередь, может свидетельствовать об их при°астности к этиопато-генезу аутоиммунных расстройств. Это воздействие может быть обусловлено, как серотипо-выми или видовыми антигенами бактерий, так и межвидовыми антигенами. Для изучения этого вопроса нами были проведены исследования по изучению перекрестных реакций с использованием иммуноблотинга. Результаты анализа позволяют заключить, что в составе бактерий S. aureus, E. coli, P. mirabilis и Y. enterocolitica имеются антигены, обладающие межвидовой серологической специфичностью. Антигенный состав Y. enterocolitica имеет более широкий спектр перекрестио-реагиующих антигенов, чем другие исследованные виды бактерий. Более широкий спектр образующихся антител свидетельствует о высокой антигенности Y enterocolitica. Возможно, в случае инфицирования этими бактериями, при определенных условиях, это может явиться причиной срыва толерантности к аутоантигенам человека.

При изучении с помощью иммуноблотинга перекрестных реакций между антигенами Y. enterocolitica и антигенами щитовидной железы установлено, что как в составе антигенов щитовидной железы, так и в составе антигенов Y enterocolitica, имеются антигены, обладающие перекрестной активностью. Причем, один из компонентов щитовидной железы с мол м 80 кДа, возможно, является апопротеиновым кором рецептора тироидстимулирующего гормона, т. е. первичнай антигенной мишенью в развитии аутоиммунного гипертироза.

Таким образом, выполненные исследования свидетельствуют о широте возможного использования антигенных препаратов субклеточных фракций гормонпродуцирующих органов. На основе антигенов микросомальных фракций гипофиза, щитовидной железы, желудка, поджелудочной железы, надпочечника, яичника и цитоплазматической фракции щитовидной железы, разработана унифицированная комплексная скрининговая иммунофермент-ная тест система, обладающая высокими показателями надежности, специфичности и чувствительности.

Выделенные антигенные препараты представляют и собственную ценность, так как их можно использовать при выполнении научных исследований по изучению перекрестнореагирующих антигенов в составе различных органов и тканей человека и микроорганизмов, роль которых в этиопатогенезе аутоиммунных заболеваний становится все более понятной и широко обсуждается в научной литературе.