Изучение активности микроорганизмов в природе

Для экологических исследований важно не только определить наличие того или иного микроорганизма в природном местообитании, но и показать, что он там активно функционирует. Изучение активности микроорганизмов предполагает учет физико-химических факторов их микроокружения. Для клетки длиной 3 мкм микроокружение на расстоянии 3 мм соответствует расстоянию в 2 км для человека. Специальные миниатюрные электроды до 2—3 мкм в диаметре позволяют измерять pH, ОВП, освещенность, соленость, температуру, содержание кислорода и некоторых химических элементов (Na⁺, К⁺, HS", NH₄⁺, N₂0 и т. д.) в непосредственной близости от микробных клеток. Миниатюрные спектрорадиометры позволяют качественно измерять поглощение света в микронишах, что важно при изучении структуры и функционирования циано-бактериальных матов и других микробных сообществ. Например, показано, что на глубине 1,0—1,2 мм морского циано-бактериального мата при его общей толщине около 2 см оксигенный фотосинтез прекращается и сообщество становится анаэробным. С этого уровня резко возрастает концентрация сероводорода, возникающего в результате активности сульфатредукторов нижних слоев мата. Концентрация сероводорода в каждом слое сообщества — результат сбалансированного процесса его выделения сульфатредукторами и его потребления аноксигенными фототрофами и гионовыми бактериями.

Наиболее чувствительны методы изучения активности с применением радиоизотопов, которые помогают проследить судьбу того или иного вещества в микробных сообществах. Для измерения интенсивности фотосинтеза определяют включение меченого ¹⁴С0₂, имея контролем «темновую» пробу. Для определения скорости сульфатредукции применяют сульфат с изотопом серы, ³⁵S0₄²-, который превращается в H₂³⁵S. Скорость метаногенеза можно проследить по превращению ¹⁴С0₂ в ¹⁴СН₄ в присутствии значительного количества водорода или по преобразованию ¹⁴С-метанола, метилированных аминов или ацетата в ¹⁴СН₄. Хемооргапотрофные активности измеряют по скорости включения меченых по ¹⁴С-органических соединений (обычно глюкозы или аминокислот). Использование ¹⁴С-органических веществ можно проследить и по выделению ¹⁴С0₂. Во всех случаях, определяя скорости процессов потребления изотопа или его выделения, необходимо учитывать соотношение меченого и немеченого субстрата, внесенного в пробу для расчета специфической активности потребления субстрата или образования продукта. В качестве контрольных образцов ставят опыты с клетками, убитыми формальдегидом или кипячением.

Изучение активности микроорганизмов в природных образцах проводят с учетом так называемого «изотопного эффекта», заключающегося в том, что живые клетки способны по-разному использовать легкие и тяжелые изотопы одного и того же элемента в биологических реакциях. В микробной экологии наибольшее распространение получили исследования, связанные с трансформацией изотопов углерода и серы. Большинство углерода представлено в природе в виде изотопа ¹²С, хотя встречается небольшое количество стабильного тяжелого ¹³С и радиоактивного ¹⁴С. Значительная часть соединений серы состоит в основном из ³²s, хотя встречается стабильный изотоп 34_S

и радиоактивный ^3jS. При проведении большинства таких реакций живые организмы способны «выбирать» соединения с более легким изотопом из имеющихся в наличии. Поэтому вещества с более тяжелыми изотопами остаются непрореагировавшими, и их относительная доля в оставшемся субстрате увеличивается, а в продукте — уменьшается. Это явление получило название «фракционирование изотопов». Изучение проб различного происхождения показало, что наиболее «тяжелыми» по углероду являются морские карбонаты химического происхождения с соотношением Д¹³С = ±5%о. Недавние в геологическом масштабе морские осадки имеют Д¹³С = -10-г35%о, что явно говорит об участии микроорганизмов в их формировании. Биомасса растений имеет дефицит по ¹³С в 12—25%о, нефть — 20—35%о, а метан — 25—80%о. Интересно отметить, что скальные породы возраста около 3,5 млрд лет (время появления жизни на Земле) обеднены, но ¹³С на 12—22%о, что свидетельствует об очень раннем возникновении автотрофии на планете. Подобные же измерения, проведенные в отношении изотопов серы, показали, что метеоритный сульфид имеет дз^з _()Т —з до +3%о, тогда как залежи элементарной серы — от -18 до +18%о, а сульфид морских осадков может иметь A^3jS до -30%о, что говорит о значительном вкладе сульфатредукторов в процесс глобального цикла серы.

Последние достижения в аналитической методологии позволяют проводить измерение метаболической активности микроорганизмов в их природных экологических нишах, однако при постановке опытов следует учитывать возможные возмущения микроокружения клеток при введении измеряющих объектов. Так, простое ограничение микрониши стенками может вызвать пристеночный эффект, а отбор проб из ограниченного пространства — нарушить газовый баланс (содержание кислорода). Все это приводит к снижению точности и воспроизводимости результатов измерений. Определение гетеротрофного потенциала данной экониши осуществляют, изучая включение радиоактивной метки (обычно ¹⁴С) из введенных в образец меченых гетеротрофных субстратов. Этот подход предполагает, что субстрат из среды потребляется, подчиняясь кинетике реакций первого порядка, и что скорость поглощения увеличивается с увеличением концентрации субстрата до достижения максимальной (V_max). Это значение можно подсчитать, пользуясь уравнением Михаэлиса — Ментен и строя график зависимости скорости поглощения субстрата от его концентрации в координатах Лайнуивера — Берка. Определение скоростей активности микроорганизмов этим методом ограничено набором субстратов, используемым данным сообществом. Обычно при определении гетеротрофного потенциала местообитания используют ацетат, глюкозу и другие сахара, глутамат и другие аминокислоты или смесь меченых продуктов фотосинтеза, образуемых после инкубации водорослей на свету с ¹⁴С0₂. При оценке метаболических активностей популяций определяют также процент дыхания, подсчитываемый как отношение суммы включенного ¹⁴С и выделившегося ^{, /}‘С0₂ к выделившемуся ^ИС0₂ и выраженный в процентах. Проценты дыхания — показатель количества энергии, затрачиваемой популяцией на поддержание устойчивости системы, причем чем выше процент дыхания, тем больше метаболической энергии тратится на поддержание.

Скорости микробной продукции измеряют обычно с использованием меченого тритием тимидина {[³Н]-Тд}, который включается непосредственно только в ДНК прокариот и отражает скорость роста микроорганизмов в популяции или прироста биомассы. Этот метод чрезвычайно удобен для анализа скоростей роста водных микроорганизмов. В почве его применение затруднено из-за связывания меченого тимидина и ДНК с гуминовыми и глинистыми веществами.

Скорость фотосинтеза измеряют чаще всего в водных образцах в светлых и темных склянках с введенной порцией ¹⁴С0₂. Образцы инкубируют в течение нескольких часов или всего светового периода in situ и определяют скорость включения меченой углекислоты (обычно в течение первых 1—2 ч инкубации), что отражает скорость фотосинтеза. Регистрируют также общее включенное количество ¹⁴С0₂ (за более длительный период), что соответствует чистой продукции фотосинтеза (т.е. разнице между количеством включенного ¹⁴С0₂ и количеством органического вещества, минерализованного до ^{, 4}С0₂ в результате дыхания).

Скорость дыхания определяют, измеряя скорость выделения ¹⁴С0₂ из органических субстратов, которая отражает скорость минерализации органического вещества данной экологической ниши. Существуют также методы нерадиоактивного определения метаболической активности, при которых измеряют скорость дыхания пробы, взятой из данного места, с помощью закрытого кислородного электрода Кларка, или регистрируют образование С0₂ в постоянно аэрируемой пробе, куда внесен субстрат дыхания. Для длительных экспериментов по улавливанию образующегося С0₂ применяют специальные герметичные колбы с двумя сообщающимися отсеками, в одном из которых происходит химическое связывание образуемого С0₂ концентрированным раствором щелочи, а в другом помещают исследуемый образец.

При измерении ферментативного потенциала популяций определяют активности ферментов различных групп. Это могут быть активности ферментов, присущих всем членам сообщества (суммарные активности дегидрогеназ, эстераз, фосфатаз) или специфичные для определенной его части (целлюлазная, хитиназная, нитрогеназная, денитрифицирующая активности). При измерении ферментативных активностей in situ важно не нарушать микроокружение данной ниши и следить за температурой, pH, влажностью, ОВП, а периоды инкубации (измерения) должны быть достаточно короткими, чтобы за это время число микроорганизмов не могло значительно измениться.