Лекция № 4. Физиология и принципы культивирования микроорганизмов

Метаболизм микроорганизмов.

Для роста и размножения микроорганизмы нуждаются в веществах, используемых для построения структурных компонентов клетки и получения энергии. Метаболизм (т. е. обмен веществ и энергии) имеет две составляющих — анаболизм и катаболизм. Анаболизм — синтез компонентов клетки (конструктивный обмен). Катаболизм — энергетический обмен, связан с о. в. реакциями, расщеплением глюкозы и других органических соединений, синтезом АТФ. Питательные вещества могут поступать в клетку в растворимом виде (это характерно для прокариот) — осмотрофы, или в виде отдельных частиц — фаготрофы.

Основным регулятором поступления веществ в бактериальную клетку является цитоплазматическая мембрана. Существует четыре основных механизма поступления веществ: — пассивная диффузия — по градиенту концентрации, энергонезатратная, не имеющая субстратной специфичности;

• — облегченная диффузия — по градиенту концентрации, субстратспецифичная, энергонезатратная, осуществляется при участии специализированных белков пермеаз;
• — активный транспорт — против градиента концентрации, субстратспецифичен (специальные связывающие белки в комплексе с пермеазами), энергозатратный (за счет АТФ), вещества поступают в клетку в химически неизмененном виде;
• — транслокация (перенос групп) — против градиента концентрации, с помощью фосфотрансферазной системы, энергозатратна, вещества (преимущественно сахара) поступают в клетку в фосфорилированном виде.

Основные химические элементы — органогены, необходимые для синтеза органичеких соединений — углерод, азот, водород, кислород.

В зависимости от источника потребляемого углерода микробы подразделяют на аутотрофы (используют CO2) и гетеротрофы (используют готовые органические соединения). В зависимости от источника энергии микроорганизмы делят на фототрофы (энергию получают за счет фотосинтеза — например, цианобактерии) и хемотрофы (энергия добывается за счет химических, о. в. реакций). Если при этом донорами электронов являются неорганические соединения, то это литотрофы, если органические — органотрофы. Если бактериальная клетка в состоянии синтезировать все необходимые для жизнедеятельности вещества, то это прототрофы. Если бактерии нуждаются в дополнительных веществах (факторах роста), то это ауксотрофы. Основными факторами роста для труднокультивируемых бактерий являются пуриновые и пиримидиновые основания, витамины, некоторые (обычно незаменимые) аминокислоты, кровяные факторы (гемин) и др.

Дыхание микроорганизмов.

Путем дыхания микроорганизмы добывают энергию. Дыхание — биологический процесс переноса электронов через дыхательную цепь от доноров к акцепторам с образованием АТФ. В зависимости оттого, что является конечным акцептором электронов, выделяют аэробное и анаэробное дыхание. При аэробном дыхании конечным акцептором электронов является молекулярный кислород (О₂), при анаэробном — связанный кислород (-NO₃, =SO₄, =SO₃).

По типу дыхания выделяют четыре группы микроорганизмов.

• 1. Облигатные (строгие) аэробы. Им необходим молекулярный (атмосферный) кислород для дыхания.
• 2. Микроаэрофилы нуждаются в уменьшенной концентрации (низком парциальном давлении) свободного кислорода. Для создания этих условий в газовую смесь для культивирования обычно добавляют CO₂, например до 10 — процентной концентрации.
• 3. Факультативные анаэробы могут потреблять глюкозу и размножаться в аэробных и анаэробных условиях. Среди них имеются микроорганизмы, толерантные к относительно высоким (близких к атмосферным) концентрациям молекулярного кислорода — т. е. аэротолерантные, а также микроорганизмы которые способны в определенных условиях переключаться с анаэробного на аэробное дыхание.
• 4. Строгие анаэробы размножаются только в анаэробных условиях, т. е. при очень низких концентрациях молекулярного кислорода, который в больших концентрациях для них губителен. Биохимически анаэробное дыхание протекает по типу бродильных процессов, молекулярный кислород при этом не используется.

Аэробное дыхание энергетически более эффективно (синтезируется большее количество АТФ).

В процессе аэробного дыхания образуются токсические продукты окисления (H₂O₂ — перекись водорода, — О₂ — свободные кислородные радикалы), от которых защищают специфические ферменты, прежде всего каталаза, пероксидаза, пероксиддисмутаза. У анаэробов эти ферменты отсутствуют, также как и система регуляции окислительно — восстановительного потенциала (rH₂).

• 1. Основные методы создания анаэробных условий для культивирования микроорганизмов
• 1. Физический — откачивание воздуха, введение специальной газовой безкислородной смеси (чаще — N₂ — 85%, CO₂ — 10%, H₂ — 5%).
• 2. Химический — применяют химические поглотители кислорода.
• 3. Биологический — совместное культивирование строгих аэробов и анаэробов (аэробы поглощают кислород и создают условия для размножения анаэробов).
• 4. Смешанный — используют несколько разных подходов.

Необходимо отметить, что создание оптимальных условий для строгих анаэробов — очень сложная задача. Очень непросто обеспечить постоянное поддержание безкислородных условий культивирования, необходимы специальные среды без содержания растворенного кислорода, поддержание необходимого окислительно — восстановительного потенциала питательных сред, взятие и доставка, посев материала в анаэробных условиях.

Существует ряд приемов, обеспечивающих более подходящие условия для анаэробов — предварительное кипячение питательных сред, посев в глубокий столбик агара, заливка сред вазелиновым маслом для сокращения доступа кислорода, использование герметически закрывающихся флаконов и пробирок, шприцев и лабораторной посуды с инертным газом, использование плотно закрывающихся эксикаторов с горящей свечой. Используются специальные приборы для создания анаэробных условий — анаэростаты. Однако в настоящее время наиболее простым и эффективным оборудованием для создания анаэробных и микроаэрофильных условий является система «Газпак» со специальными газорегенерирующими пакетами, действующими по принципу вытеснения атмосферного воздуха газовыми смесями в герметически закрытых емкостях.

• 2. Основные принципы культивирования микроорганизмов на питательных средах
• 1. Использование всех необходимых для соответствующих микробов питательных компонентов.
• 2. Оптимальные температура, рН, rH₂, концентрация ионов, степень насыщения кислородом, газовый состав и давление.

Микроорганизмы культивируют на питательных средах при оптимальной температуре в термостатах, обеспечивающих условия инкубации.

По температурному оптимуму роста выделяют три основные группы микроорганизмов.

• 1. Психрофилы — растут при температурах ниже +20 градусов Цельсия.
• 2. Мезофилы — растут в диапозоне температур от 20 до 45 градусов (часто оптимум — при 37 градусах С).
• 3. Термофилы — растут при температурах выше плюс 45 градусов.

Краткая характеристика питательных сред.

По консистенции выделяют жидкие, плотные (1,5 — 3% агара) и полужидкие (0,3 — 0,7% агара) среды.

Агар — полисахарид сложного состава из морских водорослей, основной отвердитель для плотных (твердых) сред. В качестве универсального источника углерода и азота применяют пептоны — продукты ферментации белков пепсином, различные гидролизаты — мясной, рыбный, казеиновый, дрожжевой и др.

По назначению среды разделяют на ряд групп:

• — универсальные (простые), пригодные для различных нетребовательных микроорганизмов (мясо — пептонный бульон — МПБ, мясо — пептонный агар — МПА);
• — специальные — среды для микроорганизмов, не растущих на универсальных средах (среда Мак — Коя на туляремию, среда Левенштейна — Иенсена для возбудителя туберкулеза);
• — дифференциально — диагностические — для дифференциации микроорганизмов по ферментативной активности и культуральным свойствам (среды Эндо, Плоскирева, Левина, Гисса);
• — селективные (элективные) — для выделения определенных видов микроорганизмов и подавления роста сопутствующих — пептонная вода, селенитовая среда, среда Мюллера.

По происхождению среды делят на естественные, полусинтетические и синтетические.

3. Рост и размножение микроорганизмов Бактериальные клетки размножаются в результате деления. Основные стадии размножения микробов в жидкой среде в стационарных условиях:

• — лаг — фаза (начальная стадия адаптации с медленным темпом прироста биомассы бактерий);
• — экспоненциальная (геометрического роста) фаза с резким ростом численности популяции микроорганизмов (2 в степени n);
• — стационарная фаза (фаза равновесия размножения и гибели микробных клеток);
• — стадия гибели — уменьшение численности популяции в связи с уменьшением и отсутствием условий для размножения микроорганизмов (дефицит питательных веществ, изменение рH, rH₂, концентрации ионов и других условий культивирования).

Данная динамика характерна для периодических культур с постепенным истощением запаса питательных веществ и накоплением метаболитов.

Если в питательной среде создают условия для поддержания микробной популяции в экспоненциальной фазе — это хемостатные (непрерывные) культуры.

Характер роста бактерий на плотных и жидких питательных средах: сплошной рост, образование колоний, осадок, пленка, помутнение.

Чистая культура — популяция одного вида микроорганизмов.

Основные принципы получения чистых культур: механическое разобщение, рассев, серийные разведения, использование элективных сред, особых условий культивирования (с учетом устойчивости некоторых микробов к определенным температурам, кислотам, щелочам, парциальному давлению кислорода, рН и мн. др).