Лабораторная работа № 12. Определение плотности суспензионной культуры и оценка ее ростовой активности

По плотности суспензии можно не только охарактеризовать состояние клеточной популяции, но и определить время субкультивирования (отбора инокулята и пересадки на свежую питательную среду). В большинстве случаев суспензию для субкультивирования отбирают в конце экспоненциальной фазы (через 14—16 дней после начала культивирования). При построении кривой роста показатели снимают через день. Плотность суспензии за две-три недели культивирования возрастает в среднем в 20 раз. Клетки суспензий удобнее всего подсчитывать в специальных счетных камерах Фукса — Розенталя или Горяева. Объем выборки должен составлять не менее 1000 клеток. Подсчет клеток затрудняется, если в суспензии преобладает фракция агрегатов. В таких случаях к одному объему культуры добавляют два объема 8%-го оксида хрома и нагревают до 70 °C в течение 2—15 мин. После охлаждения культуру встряхивают, чтобы распались агрегаты. Для разрушения агрегатов в суспензию добавляют пектиназу — 0,25% объема.

Плотность суспензии можно определить и по соотношению объема биомассы к общему объему суспензии. Измеряют средний объем клетки и получают число клеток в 1 мл суспензии.

Цель работы: научиться определять плотность суспензионной культуры для изучения характера ее роста.

Оборудование и материалы: микроскоп, центрифуга, стерильная пипетка, предметное стекло, покровное стекло, камера для подсчета Фукса — Розенталя или Горяева, фильтровальная бумага.

Объект исследования: суспензионная культура.

Ход работы.

Колбу с суспензией встряхнуть и отобрать пипеткой несколько миллилитров. 1 мл суспензии смешать с 2 мл 8%-го оксида хрома и поставить на 15 мин в термостат при температуре 70 °C. Смесь пропустить три раза через шприц с толстой иглой (пипетировать). Камеру Фукса — Розенталя или Горяева заполнить суспензией. Для этого притереть покровное стекло до появления колец Ньютона. Подсчитать количество клеток под микроскопом. Подсчет клеток осуществляется в пяти больших квадратах (в четырех — по диагонали и в одном — в любом верхнем или нижнем углу сетки). Плотность суспензии, т. е. число клеток, рассчитать (в мл) по формуле.

где X — число клеток в мл; М — среднее число клеток в камере; N — разведение; 3,2 — постоянная величина.

Задание. Показатели снимать через день в процессе всего культивирования. По ним построить кривую роста суспензии, используя суспензионную культуру из предыдущей работы.