Конъюгация (спаривание). Наследственность и изменчивость микроорганизмов

Конъюгация бактерий. Наличие конъюгации у бактерий наблюдалось некоторыми учеными давно. Но подробно она была изучена в последнее время. Существование конъюгации у бактерий впервые было доказано генетическим методом Ледербергом и Татум (1947). Конъюгация двух бактериальных клеток была обнаружена в электронном микроскопе. Клетки, из которых одна удлиненная — донор, а другая круглая и более крупная — реципиент, сближаются, между ними образуется мостик, по которому генетический материал донора переходит в клетку-реципиент. Был установлен односторонний перенос генетического материала донора, обозначаемого как F+ (мужского типа), в клетку-реципиент, обозначаемую знаком F- (женского типа). Клетка-донор содержит особый фактор плодовитости, обозначаемый F-фактор. При скрещивании штаммов Fи Fрекомбинаций не образуется, они образуются при скрещивании штаммов F+ и Fс частотой около 106, т. е. очень незначительной.

В дальнейшем были найдены штаммы доноры F+, которые при скрещивании с Fобразовывали рекомбинанты с очень большой частотой 101−103. Такие штаммы обозначаются High, frecuency of recombination Hfr. — высокая частота рекомбинации АШ, ЭФ, ЭР. Эти штаммы очень облегчили работу по изучению конъюгации.

При конъюгации происходит медленный перенос генетических факторов бактериальной хромосомы от донорской клетки в реципиентную в строгой последовательности их расположения в хромосоме донора. Количество перенесенных факторов зависит от продолжительности контакта клеток. Конъюгацию можно прекращать искусственно через различные промежутки времени путем встряхивания в особом смесителе, и таким образом можно определять, какие наследственные факторы и в какой последовательности расположены в хромосоме клетки. При помощи конъюгации оказалось возможным легко и более точно составить генетическую карту хромосомы бактерийной клетки.

Передача генетического материала клетки-донора клетке-реципиенту при непосредственном контакте. Клетки соединяются через конъюгационный мостик, образованный половой ворсинкой донорской клетки. Перенос генетического материала происходит в одном направлении — от донора к реципиенту. Таким образом, все три процесса генетической рекомбинации различны по форме, но одинаковы по существу. Результатом каждого из этих процессов является перенос фрагмента ДНК от одной клетки к другой.

Изменчивость и наследственность микроорганизмов является частью общебиологической проблемы изменчивости и наследственности. Наследственность и изменчивость в сущности две стороны одного явления. В природе постоянно наблюдается процесс передачи наследственных свойств организма из поколения в поколение и в то же время идет процесс изменчивости. Наследственность и изменчивость — это два противоречивых и вместе с тем неразрывно связанных между собой процесса. Они основа развития живого мира. По сравнению с другими организмами изменчивость микробов наблюдается чаще и осуществляется легче и быстрее, это объясняется большой быстротой их размножения и пластичностью.

Изменяться могут самые разнообразные свойства микробов — морфологические, ферментативные, антигенные, патогенные и др. Различают ненаследственную и наследственную изменчивость. Ненаследственная изменчивость (модификация) очень часто наблюдается под воздействием различных факторов внешней среды. Она заключается в количественном изменении некоторых свойств микроба, т. е. в ослаблении и утрате или усилении этих свойств. Когда воздействие факторов, вызвавших эти изменения, прекращается, то возникшие измененные признаки также утрачиваются. Наследственная изменчивость необратима, она развивается вследствие перестройки наследственного аппарата микроорганизма в результате непосредственного внешнего или внутреннего воздействия на него или внедрения чужеродного генетического материала (трансформация, конъюгация, рекомбинация и др.).

В микробиологии основоположником учения об изменчивости является Луи Пастер. Он искусственным путем получил необратимое ослабление вирулентности возбудителей сибирской язвы (1881) и бешенства (1885), а также получил способ приготовления живых вакцин для борьбы с этими заболеваниями. Это открытие Пастера имело поворотное значение для борьбы с инфекционными заболеваниями человека и животных. Применение живых вакцин привело к ликвидации многих эпидемий, сведя их до единичных заболеваний. Противосибиреязвенная вакцина получена Пастером путем длительного (12−24 дня) выращивания при повышенной температуре (42°) вирулентной культуры сибиреязвенной палочки.

Путем такой направленной изменчивости микробов в настоящее время получено 20 живых вакцин, из них 14 против вирусных и 6 против бактериальных инфекций. Все время идут работы по созданию новых вакцин и улучшению некоторых из существующих.

Благодаря простоте своего строения вирусы обладают большой способностью к изменчивости. Вирусы растений способны приспособляться к условиям жизни в организмах филогенетически очень отдаленных видов. Так, к вирусу табачной мозаики восприимчивы 236 видов растений 33 различных семейств. Из животных вирусов наибольшей изменчивостью обладает вирус гриппа. Вирусы гриппа, выделенные во время отдельных эпидемий в различных странах, отличаются от основных типов, А и В по антигенному строению, морфологическим признакам, способности к адаптации и пр. В 1947;1952 гг. в Китае появилась новая разновидность — тип А2, которая вызвала эпидемию гриппа во всем мире. Об изменчивости вирусов говорит тот факт, что наибольшее количество живых вакцин получено из вирусов.

Изменчивость грибов имеет большое практическое значение, так как многие из них широко используются в различных производствах. Были получены расы дрожжей, хорошо развивающиеся при пониженных или повышенных температурах, требуемых в тех или иных производствах. Для интенсификации бродильных процессов получены расы дрожжей, способные использовать углеводы в больших концентрациях, а также приспосабливаться к высокому осмотическому давлению, к продуктам собственной жизнедеятельности, к различным физическим и химическим факторам. Применение этих рас дает большую продукцию. Ярким примером этого является производство антибиотиков.

За последние годы в изучении наследственности микроорганизмов наблюдаются большие достижения, имеющие значение не только для микробиологии, но и для общей генетики, биохимии и других наук. Проведенные генетические исследования приближают нас к реальной возможности влияния на процессы наследственности и изменчивости микробов.

Исходными для понимания явлений наследственности служат данные о химическом составе хромосом. Хромосомы высших организмов являются нуклеопротеидами, генетическим материалом в которых служит ДНК. У бактерий и фагов хромосомами является непосредственно ДНК, на нити которой в линейном порядке на определенных местах расположены определенные наследственные признаки. Количество хромосом в клетках различных организмов постоянно: у человека 46 хромосом, у кукурузы 10 и т. д. У бактерий весь генетический материал представляет одну хромосому. Это было найдено при помощи генетического метода.

Наследственность неразрывно связана с размножением, а размножение — с делением клеток, при котором происходит саморепродукция хромосом и ДНК. Соматические клетки имеют диплоидный, двойной набор хромосом. Дочерние клетки имеют такое же число хромосом, как и материнская (митоз). В половых клетках содержится вдвое меньше хромосом, так как при образовании половых клеток (мейоз) происходит особое редукционное деление с уменьшением нормального числа хромосом наполовину, например в половых клетках человека 23 хромосомы. Такой набор хромосом называется гаплоидным.

Из микроорганизмов только некоторые грибы и водоросли имеют типичный половой процесс с диплоидным и гаплоидным набором хромосом. Бактерии и фаги генетически ведут себя как организмы с одной гаплоидной хромосомой.

Характерно, что обычные морфологические методы смогли дать только общее описание ядерного вещества, применение же генетического метода исследования раскрыло тонкую структуру бактериальной хромосомы, хотя понятие хромосомы у бактерий носит несколько условный характер. Ген в настоящее время не является чисто умозрительной категорией, понятие гена получило вполне материальное содержание. Ген представляет собой участок (локус) хромосомы, слагающийся из цепи нуклеотидов молекулы ДНК, обладающий специфической функцией. Хромосома — это цепь линейно расположенных генов. Участок молекулы ДНК, составляющий ген, включает от 500 до нескольких тысяч нуклеотидов. Термину «ген» равнозначны: наследственный фактор, генетическая единица, детерминанта и др. Совокупность всех наследственных факторов (генов) в хромосомах организма называется генотипом. Фенотипом является внешний вид организма со всеми внешними и внутренними признаками. Фенотип бактерии есть результат взаимодействия ее генотипа и среды.

Появление в каком-либо организме новых наследственно передаваемых свойств может быть вызвано разными типами изменений в генетическом аппарате. Источником наследственной изменчивости могут быть мутации генов, т. е. изменения в их химическом строении, и структурные мутации хромосом. При этом могут происходить в двойной спирали ДНК следующие изменения: 1) замещение пары оснований, имевшихся в исходной молекуле ДНК, другой парой; 2) выпадение пары оснований из молекулы ДНК (деления); 3) внедрение новой пары оснований в молекулу ДНК; 4) инверсия — поворот нескольких пар оснований на 180°. Таким образом, в основе мутаций лежат молекулярные изменения в хромосоме.

Мутации у бактерий выявляются при наследственных изменениях любого признака микроба. Наиболее легко выявляются и количественно точно учитываются такие признаки: ауксотрофность к аминокислотам, пуринам и пиримидинам, витаминам; чувствительность или устойчивость к антибиотикам или фагам; лизогенность; ферментация углеводов и др. Предложены определенные обозначения мутантов. Так, ауксотрофность аминокислот обозначают начальными буквами или слогами их, например: гистидина — his, триптофана — try и т. д., двойные, тройные ауксотрофы обозначаются his try. Способность ферментировать углеводы, например лактозу — 1ас+, неспособность ферментировать — 1ас-. Чувствительность к стрептомицину — Str-s, резистентность — Str-r, зависимость — Str-d и т. д. Под влиянием мутагенных факторов были получены ауксотрофные мутанты, которые потеряли способность к синтезу важных для микроорганизмов веществ. Так, одни мутанты потеряли способность синтеза тех или иных аминокислот, другие мутанты — синтеза витаминов и т. д. Эти ауксотрофы (минус-варианты) могут расти только на средах, содержащих вещества, синтезировать которые они уже не могут. У них нарушена активность соответствующих ферментов. С помощью таких ауксотрофов удалось проследить нормальный биосинтез многих аминокислот, витаминов, углеводов, азотистых оснований.

Мутации у микробов так же, как и у высших организмов, делятся на спонтанные и индуцированные. Спонтанные мутации возникают при воздействии факторов, являющихся нормальными условиями среды. Индуцированные мутации возникают в результате обработки микробов мутагенными агентами. К последним относятся различные виды радиации (ультрафиолетовые, рентгеновские лучи, быстрые нейтроны, протоны и др.), действие температуры и пр. Спонтанные мутации наблюдаются очень редко. Частота их колеблется от 1010 до 104, т. е. одна мутантная клетка на 10 тыс. млрд. клеток. Мутагены увеличивают частоту мутаций в 10−100 тысяч раз.

Представление о строении генетического аппарата бактерийной клетки основано на изучении у них механизмов генетического обмена. У бактерий нет такого полового процесса, какой имеется у высших организмов. У бактерий обычно происходит только односторонняя передача части наследственного материала (фрагмента ДНК) от одной бактерийной клетки — донора к другой — реципиенту. При этом в клетке реципиента происходит взаимодействие между генетическим материалом донора и реципиента, которое приводит к образованию дочерних рекомбинантных клеток. Последние клетки сохраняют некоторые признаки реципиента и приобретают новые признаки, полученные от клетки донора. Механизмами такой рекомбинации, перегруппировки признаков в потомстве, т. е. изменчивости, являются трансформация, трансдукция и конъюгация.

Трансформация (превращение, перестройка) заключается в том, что некоторые бактерии при выращивании их в присутствии веществ, извлеченных из клеток родственных им видов или разновидностей, приобретают некоторые свойства последних. Пневмококки — возбудители воспаления легких — имеют несколько разновидностей. Когда к неболезнетворной бескапсульной разновидности прибавили убитые микробные тела болезнетворной разновидности, имеющей капсулу, и ввели эту смесь белым мышам, то белые мыши, вопреки ожиданию, погибли и из крови их была выделена болезнетворная капсульная разновидность (Ф. Гриффитс, 1928). Контрольные мыши, получившие только убитые микробные тела, не заболели. Таким образом, в организме мышей неболезнетворный пневмококк приобрел свойства болезнетворного, хотя и убитого, пневмококка. Это свойство стало наследственно закрепленным. После больших исследований было найдено, что эта наследственная изменчивость была вызвана ДНК убитых микробных тел болезнетворного пневмококка (О. Т. Эвери, 1944). В дальнейшем такие трансформации были получены при помощи одной только ДНК, полученной из микробных тел. Так же хорошо изучена трансформация устойчивости к антибиотикам — пенициллину, стрептомицину. Если ДНК, выделенную из антибиотиков устойчивых бактерий, добавить в культуру чувствительных к антибиотикам бактерий, то в культуре под влиянием ДНК некоторое количество клеток приобретает наследственную устойчивость к данному антибиотику. Активность ДНК, измеряемая в гаммах на 1 мл среды (v=10−6 г), оказалась чрезвычайно высокой. Показана также возможность и межвидовой трансформации. Установление генетической роли ДНК имеет общебиологическое значение, так как позволило перейти к изучению различных биологических процессов на молекулярном уровне (синтез белка, нуклеиновых кислот, кодирование и др.).

Генетика вирусов изучалась главным образом на фагах. Хромосому вируса представляет одна молекула ДНК или РНК, находящаяся в белковой оболочке вируса. Основными признаками фага, наиболее часто используемыми в генетических исследованиях, являются: морфология бляшек на бактерийной культуре, способность фага реагировать с определенными штаммами бактерий хозяев, чувствительность фага к физическим и химическим факторам, лизогения и др. Генетический обмен, скрещивание фагов осуществляется путем заражения одной клетки бактерии двумя генетически различными фагами. В потомстве фага, возникшем в зараженной клетке, обнаруживаются особи с признаками каждого родительского фага и особи с объединенными признаками обоих родителей. Генетический материал фага представляет собой линейно расположенные локусы отдельных признаков. Так были построены генетические карты фагов группы Т и кишечной палочки К-12.

В настоящее время уже встал вопрос о дробимости гена, о его конечных размерах. Так, американец Бензер в опытах по детализации гена r11 фага Т4 разделил этот ген на два цистрона, которые состоят из более мелких единиц: реконов и мутонов. Реконом он считает минимальный участок хромосомы, способный к генетической рекомбинации. Мутон — минимальный участок хромосомы, изменение которого вызывает мутацию. Цистрон — функциональная единица. Он становится неактивным при мутационном повреждении входящего в его состав мутона или рекона. Бензер полагает, что если ген r11 состоит из 3000 нуклеотидов, то мутон его состоит всего из 7 нуклеотидов.

Практическая задача генетики — направленное получение микроорганизмов с полезными для человека свойствами. Значение ее особенно наглядно на примере создания микробов высокопродуктивных культур, образующих антибиотические, физиологически активные вещества, дефицитные аминокислоты и пр. Лучшим методом для этого является селекция мутантов, полученных при воздействии различных мутагенных факторов на исходные (дикие) штаммы. Процесс выведения высокопродуктивных штаммов состоит из многих ступенчатых этапов, состоящих из воздействия на культуру мутагенных факторов с последующим отбором наиболее продуктивного штамма. Этот мутантный штамм может еще подвергаться воздействию мутагенов с последующим отбором наиболее продуктивных мутантов. Так был получен советский штамм пенициллина «Новый гибрид 369», при выведении которого применялись гибридизация, ультрафиолетовые лучи, этиленимин и отбор. Этот штамм применяется на пенициллиновых заводах многих стран.

Во Всесоюзном институте антибиотиков в очень короткий срок была увеличена во много раз активность исходных штаммов при помощи воздействия на них ультрафиолетовых, рентгеновских лучей, химического соединения этиленимина и др. воздействий.