Анализ современного состояния конструирования диагностических препаратов и индикации возбудителя туберкулеза

На приоритетном месте медицинской биотехнологии стоят вопросы разработки и совершенствования технологий изготовления биопрепаратов с целью повышения их активности, чувствительности, специфичности, экс-прессности при диагностике туберкулёза у больных людей и выявлении возбудителя в объектах внешней среды.

Для конструирования высокоактивных диагностических препаратов необходимо получить качественный антигенный и антительный материал. При изолировании антигенного материала микобактерий, представляющего собой сложные комплексы, содержащие протеины, полисахариды, липиды, фосфатиды, необходимо более полное извлечение интересующих специфических компонентов с сохранением их биологических и антигенных свойств. Для перевода антигенов в растворимое состояние применяют экстракцию трихлоруксусной кислотой, солевыми растворами, фенолом, эфиром, хлороформом, ацетоном и т. д. Получаемые при этом экстракты имеют различные физико-химические, иммунохимические свойства и спектр антигенов. При анализе литературных данных по методам выделения антигенных комплексов из микробных клеток привлекли внимание сообщения Н. А. Бельской с соавт. (1972), В. И. Вейнблата с соавт. (1972), в которых показано, что наиболее сложным макромолекулярным составом обладали водно-солевые экстракты. Многими исследователями для извлечения антигенных компонентов из микробной клетки использовались различные методы её разрушения: физический, химический, механический и др. Эффективными методами разрушения микробной клетки является ультразвуковая и механическая дезинтеграция (Фихте Б.А., 1972; Афанасьев Е. Н., 1986), так как под их воздействием наступает, прежде всего, разрушение структуры клеток микробов, а изменения химических веществ, находящихся в них, происходят гораздо медленнее, что обеспечивает возможность получения различных нативных антигенных комплексов (Благовещенский В. А. с соавт., 1961).

Специфичность иммунологических реакций находится в прямой зависимости от активности и специфичности антитела, используемого для приготовления диагностического препарата (Скачек Д.В., 1984; Алексеев В. В. с соавт. 1987). Для получения сывороток описаны различные схемы иммунизации животных (Шаханина К.Л., 1977; Чибисова В. А., 1975; Тюменцева И. С. с соавт., 1994 г; Rowe D.S., 1970; Lachman P.J., 1970 и др.). Антисыворотки, приготовляемые к различным антигенам, испытывают на активность и специфичность методами кольцепреципитации, электрофореза и иммуноэлек-трофореза, преципитацией в агаре по Оухтерлони, реакциями агглютинации (РА), непрямой гемагглютинации (РНГА), иммуноферментного анализа (ИФА) и т. д. При наличии перекрестных реакций антисыворотки истощают (Шаханина К.Л., 1981; Смирнов В. В., 1980; Кузовлева А. А., Шаханина К. Л., 1982; Beuntner E.H. et al., 1970; Ansari A.A. et al., 1981). Лучшие результаты получают при удалении нежелательных антител нерастворимыми им-муносорбентами. Применяют иммуносорбенты, полученные путем присоединения специфического антигена к носителю (целлюлозе, агарозе, сефаро-зе и др.), либо «сшивкой» специфического антигена. Такие иммуносорбенты обладают прочной ковалентной связью антигена с матрицей и получаются при взаимодействии реакционноспособных функциональных групп биополимеров со специально подобранными бифункциональными соединениями.

Попытки истощения сывороток при использовании в качестве адсор-бентов микробных клеток, широко применяемых в сывороточном производстве (Карпов С.П. с соавт., 1976; Смирнов В. В. с соавт., 1980; Пекшев А. В., Елагин Г. Д., Пятков В. А., 1998), приводят к существенной потере специфической активности нативных сывороток, при их частичном насыщении антигенным материалом. При этом процесс адсорбции иммунной сыворотки корпускулярными антигенами очень трудоемок и требует приготовления большого количества биомассы. Значительные преимущества перед названными сорбентами имеют твердофазные иммуносорбенты. При их приготовлении отпадает необходимость получения большого количества биомассы микроорганизмов штаммов-адсорбентов, существует возможность длительного их использования после проведения регенерации и, что самое главное, в процессе адсорбции происходит незначительное снижение специфической активности сывороток при упрощении манипуляций (Лопаткин О.Н. с соавт., 1983). Тем не менее, метод иммуносорбции имеет и недостатки, связанные со сложностью подготовки иммуносорбентов, с использованием канцерогенных, дорогостоящих импортных реактивов, с недостаточной сорбционной емкостью сорбентов.

Чувствительность иммунометодов зависит, прежде всего, от активности антител, на основе которых они изготовлены. Чаще всего используют иммуноглобулины класса G, для выделения которых из сыворотки существует много способов: аффинная хроматография, высаливание сернокислым аммонием (Таран И.Ф., Лопаткин О. Н., 1985;.O'Berry P.A., 1964; Lenis V.J. с соавт., 1964), осаждение каприловой кислотой (Steibuch, Andran, 1969), поли-этиленгликолем (Poison A. с соавт., 1964), риванолом (по Корн, 1977), этиловым спиртом (Табаков П. К с соавт., 1962; Носков Ф. С., 1969) и т. д. Освобождение иммуноглобулинов от основного количества балластных белков (главным образом от альбумина) позволяет снизить неспецифические реакции.

Каждый из методов выделения иммуноглобулинов имеет свои пре-имущества и недостатки. Удаление солей, используемых при фракционировании белков, необходимо проводить полностью, так как загрязнения выделенных глобулинов даже небольшим количеством сульфата аммония мешают точному определению количества белка и дальнейшей его конъюгации с красителем или ферментом. Сульфатно-риваноловый метод обеспечивает эффективное удаление балластных веществ при очистке иммуноглобулинов (Водолазова А.М., Никитина Л. Н., 1981). Метод их выделения с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ) является эффективным, так как ПЭГ хорошо осаждает белки, обладает селективностью, более специфичен при осаждении белков различной природы, чем сульфат аммония. При фракционировании иммуноглобулинов каприловой кислотой выделяется наиболее чистая фракция иммуноглобулинов класса G.

Только при чётко подобранном антигенном материале, эффективной схеме иммунизации, отработанном для каждого конкретного случая методе выделения иммуноглобулинов, возможно получение высокоактивных диагностических препаратов.

В настоящее время диагностика ТБ недостаточно эффективна. Так, например, основными методами диагностики ТБ медиастинальных лимфоузлов, сопровождающегося интоксикационным синдромом в сочетании с кальцинацией лимфоузлов и продуктивным кашлем, являются рентгенологический и бронхоскопический (Nikolayeva O., Shpak O., 2003).

При диагностике туберкулёза до сих пор на приоритетном месте находятся бактериоскопия и культуральный метод. Каждый из них имеет свои преимущества и недостатки. Бактериоскопия позволяет быстро получить результаты анализа, однако недостаточно чувствительна, а результаты культурального метода из-за длительности сроков культивирования микобактерий не отражают настоящую ситуацию по бактериовыделению (Ларионова Е.Е., Кузьмин А. В., Васильева И. А. с соавт., 2004). Идентификация комплекса МТБ биохимическими тестами требует большого количества времени и наличия достаточного количества выросших колоний. На основании наличия внутривидовых различий результаты тестов могут разниться, поэтому необходимо проводить их в комплексе. Например, для идентификации МТБ необходимы, по меньшей мере, 4 биохимических теста — аккумулирование ниацина, редукция нитратов, каталазы и толерантность к парааминобензойной кислоте (Kent P.T., Kubica G.P., 1985). Стоимость этих анализов выше стоимости ПЦР в два раза, а время, необходимое для их проведения, составляет около 28 дней.

Газо-жидкостная хроматография является быстрым и действенным методом идентификации МТБ, для которого необходима чистая культура и определённое количество бактерий, формирующихся при трёх неделях роста (Butler W.R., Jost K.C., Kilburn J.O., 1991; Thibert L., Lapierre S., 1993; Duffey P. S., Guthertz L.S., Evans G.C., 1996; Zerbini E., Cardoso M.M., Sequeira M.D. et al., 1999).

Стремительное развитие биотехнологии в последние годы привело к появлению многочисленных новых методов исследования, однако, продолжает широко применяться хорошо известная реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА), заключающаяся в том, что эритроциты, связавшие серологически активный компонент, приобретают свойства агглютинироваться гомологичным серологически активным антикомпонентом. Такой метод выявления первичного взаимодействия антиген-антитело обладает весьма высокой чувствительностью. Эти реакции находят все большее применение в диагностике различных заболеваний, изучении иммунологической прослойки населения, исследовании антигенной структуры различных микроорганизмов и т. д. Эритроцитарные диагностикумы до сих пор привлекательны по себестоимости, доступности сырья, простоте производства и применения.

В качестве антигена для РНГА применяют экстракт туберкулиновых микобактерий или очищенный туберкулин, которыми сенсибилизируют эритроциты. Диагностическое значение имеет положительная реакция с сыворотками больных 1:8 и выше. Положительные результаты регистрируются у 70−90% больных туберкулёзом (Воробьёв А.А., Кривошеин Ю. С., Широбоков В. П., 2003).

Суспензии — распространённые микрогетерогенные системы, которые могут быть получены различными способами, например, конденсационными, дисперсными и т. д. (Хмельницкий Р. А., 1988). Адсорбция лигандов на данных системах зависит от химического строения сорбентов и соотношения фракций лиганда (Адамов А.К., 1965; Адамов А. К., Агафонов В. И., 1969). При изучении закономерностей адсорбции иммунных антител установлено, что они адсорбируются органическими соединениями, содержащими гидроксильные, хинонные, карбоксильные, альдегидо -, сульфо — и нитро-группы, органическими веществами, в состав которых входят атомы металлов, а также пористыми образованиями — активированным углём, каолином и т. д. (Адамов А. К, Бердиков В. Т., 1964). Иммуносорбенты могут быть получены из любых частиц, на которых фиксированные антитела сохраняют иммунологическую активность и специфичность. Суспензионные диагностикумы применяют в реакции суспензионной агглютинации (РСА), которую осуществляют на стекле или в U-образных иммунологических планшетах (Rama-dass P., Samuel B., Nachimuthu K., 1999; Maruyama S., Boonmar S., Morita Y., 2000), обнаруживая невооруженным глазом склеивание или выпадение в осадок микробных тел при взаимодействии их со специфическими антителами, сорбированными на суспензии. Благодаря специфичности и простоте, реакция получила широкое распространение в микробиологической практике.

Среди матриц для суспензионных диагностикумов хорошо себя зарекомендовали латексы — полистирол, полиакролеин и др. (Лукин Ю. В. с соавт, 1985; Ерохин Е. П. 1991; Дячина М. Н. с соавт., 1995; Лазовская А. Л., Воробьёва З. Г., 2002). Латексы — водные эмульсии каучукоподобных полимеров, получаемые полимеризацией или сополимеризацией различных органических непредельных соединений (Бусеев А.И., Ефимов И. П., 1971). Реакции с использованием в качестве твёрдой основы латекса называются реакцией агглютинации латекса (РАЛ). Слининой С. А. (2001) выявлены микобактериальные антигены в моче больных с помощью РАЛ и показана перспективность использования данной реакции.

Особое распространение получили методы, основанные на применении антител, меченных специальными маркерами-флуорохромами, которые позволяют с помощью люминесцентного микроскопа проводить высокочувствительные определения исследуемого вещества в реакции иммунофлуоресценции (РИФ) (Coons A.H. et al., 1942.). При диагностике туберкулёза широко используется люминесцентная микроскопия, основанная на том, что объекты (клетки), окрашенные специальными красителями (флуорохромами), дают излучение в видимом спектре света под действием облучения их ультрафиолетом. При обработке микобактерий флуоресцентными красителями (аурамин, родамин и др.) они связываются с воскоподобными структурами микробной клетки. По чувствительности люминесцентная микроскопия, особенно в сочетании с методом обогащения диагностического материала, незначительно уступает методу посева. Этим методом можно исследовать любой материал кроме мочи, в котором могут быть трудно дифференцируемые при такой окраске сапрофиты (Приказ МЗ СССР № 558, 1978).

Другим важным преимуществом метода люминесцентной микроскопии является способность обнаруживать изменённые микобактерии, утратившие под влиянием ряда факторов, в частности интенсивной химиотерапии, свойство кислотоустойчивости и невыявляющиеся в связи с этим при окраске по Цилю-Нильсену (Методические указания МЗ РФ «Микробиологические исследования при выявлении, диагностике и лечении туберкулёза», 2001).

При окраске микобактерий аурамином возможны ложноположительные результаты в процессе некачественного обесцвечивания мазка, что может привести к сохранению некоторыми сапрофитными бактериями оранжевого свечения. Микроскопические исследования с использованием окрасок по Цилю-Нильсену и аурамином не позволяют дифференцировать микобактерии комплекса Mуcobacterium tuberculosis от нетуберкулёзных (атипичных микобактерий) — возбудителей микобактериозов. На основе этих методов можно только сделать заключение о наличии или отсутствии кислотоустойчивых микобактерий (приказ МЗ РФ № 109. Приложение № 11, 2003).

В связи с этим, желательно использовать более специфические методы диагностики, основанные на образовании комплекса антиген-антитело, в частности — метод иммунофлуоресценции. Он достаточно прост, экономичен, может использоваться в экспресс — диагностике инфекционных заболеваний и вместе с тем удобен для работы (Лопаткин О.Н., Кронгауз И. В., 1982; Greenlee M.T. et al., 1994; Gall D. еt al., 2000; Nielsen K. еt al., 2000).

Данный метод основан на использовании специфичности иммунологических реакций и чувствительности флуоресцентной микроскопии. Один из компонентов иммунной реакции (специфические иммуноглобулины) коньюгируется с флуоресцирующим красителем (меткой). После возбуждения флуоресцирующего агента ультрафиолетовым излучением визуализация антигена становится возможной непосредственно наблюдателю вследствие развития флуоресценции. В качестве флуорохрома применяют изоцианаты, изотиоцианаты и сульфохлорид флуоресцеинов, которые связываются с белковыми молекулами. Метка белка ФИТЦ проводится в щелочной среде. Интенсивность свечения уменьшается в 2−3 раза после присоединения ФИТЦ к белку, но остается достаточно высокой при просмотре в люминесцентном микроскопе. В реакции конъюгации в основном участвуют аминогруппы лизина и N-концевые аминогруппы белковой молекулы. Известно, что конъюгация белка с ФИТЦ является химической реакцией, зависящей от ряда факторов: чистоты и активности красителя, его количества при метке, концентрации белка, взятого в конъюгацию, количества и степени его очистки, состава буфера, величины рН, времени конъюгации и температуры реакции.

В настоящее время разработаны методы экспресс-диагностики туберкулёза, основанные на использовании РИФ с моноклональными видоспецифическими флуоресцирующими сыворотками (Воробьёв А.А., Кривошеин Ю. С., Широбоков В. П., 2003).

Большое внимание уделяется развитию методов флуоресцентного им-муноанализа с временным разрешением, что значительно повышает чувствительность анализа (Жердева В.В., Чудинов А. В., Савицкий А. П., 2002). В диссационно-усиленном лантаноидном флуоресцентном иммуноанализе используются ионы европия, тяжелого металла группы лантаноидов. Для образования прочной связи белка с ионом лантоноида применяют бифункциональные производные карбоновых кислот. На стадии детекции ионы европия диссоциируют из меченого антитела с поверхности твердой фазы в специальный раствор, образуя новый флуоресцирующий комплекс (Иванов Ю.В., Коровкин С. А., 1997).

Анализ данных литературы (Шаханина К. Л., Манько М. И., 1969; Шаханина К. Л., Походзей И. В., 1978; Стоев К. Г. с соавт., 1981; Пушкарь В. Г., Трофимов Е. Н., 1986; Ефременко В. И. с соавт, 1989; Moldey R.S., Jen S.P.S., Rembaum A., 1977) свидетельствует о перспективности разработки твёрдо-фазного иммуноанализа на основе РИФ с использованием иммуносорбентов, позволяющих выявлять не только корпускулярные, но и водорастворимые антигены.

Для избирательной сорбции некоторых бактерий и риккетсий с целью последующего выявления микроорганизмов в РИФ К. Л. Шаханина с со-авт. (1969) применяли иммуносорбенты на основе целлюлозного носителя, при этом повышалась чувствительность метода в 10−15 раз, хотя он и не позволял проводить количественный учет свечения гранул.

Некоторые авторы работ считают, что синтетические диагностикумы на основе сефарозы, агарозы выгодно отличаются от эритроцитарных и ла-тексных тем, что их качество не зависит от типа носителя, к которому присоединение антитела или антигена происходит ковалентно. Результаты исследований сыворотки больных хроническим бронхитом позволили сделать вывод, что приготовленные сефарозные антительные и антигенные диагностикумы достаточно специфичны и более чувствительны, чем РСК (Шахани-на К.Л., Походзей И. В., 1978).

К. Г. Стоевым с соавт.(1981) разработан количественный метод РИФ с использованием специфического сефарозного иммуносорбента и люминесцентного микроскопа (DASS-система), что позволяет измерить концентрацию Ig Е человека в пределах 5−2500 м.е./мл. Метод обладает рядом преимуществ, отличается малой затратой времени, доступен практическим лабораториям.

В настоящее время появились сведения об усовершенствовании РИФ с использованием иммуносорбентов, обладающих магнитными свойствами. Описано использование магнитных полиакриламидных сорбентов (Пушкарь В.Г., Трофимов Е. Н., 1986; Ефременко В. И. с соавт., 1989; Подзолкова Г. Г. с соавт., 1989); магнитных органокремнезёмных сорбентов (Жарникова И.В., 1995; Афанасьев Е. Н., 2000, Базиков И. А., 2000); магнитных железоокисно-декстрановых частиц (Molday R.S.et al., 1977). К недостаткам последнего метода следует отнести необходимость применения мощных магнитных полей для сепарации этих частиц.

На основе твердофазных иммуносорбентов различной природы Г. Г. Подзолковой с соавт. (1989) предложен метод количественной иммунофлуоресценции, позволяющий выявлять с высокой чувствительностью различные антигены. Таким образом, РИФ с использованием иммуносорбентов может успешно применяться для выявления возбудителей инфекций. Однако совершенствование метода иммунофлуоресценции на твердой матрице во многом определяется качеством сорбентов, лиганда, техникой постановки реакции.

На основании того, что диагностика МТБ с помощью традиционных методов требует длительного времени и в условиях широкого применения разнообразных противотуберкулёзных препаратов изменилась биология возбудителя туберкулёза (морфология, ферментативная активность и биологические свойства) (Приказ МЗ РФ № 558., 1978), в микобактериологии на протяжении последних лет используются молекулярные технологии — методы генодиагностики, а именно полимеразная цепная реакция (ПЦР), что позволило разработать методы генотипирования и дифференцирования штаммов микобактерий туберкулёза на уровне хромосомной ДНК (Goto M., Oka S., Okuzumi K. еt al., 1991; Lebrun L., Espinasse F., Povenda J. еt al., 1992; Badak.

F.Z., Goksel S., Sertoz B. et al., 1999). В основе ПЦР лежит амплификация участка генома путем многократного копирования специфической для данного микроорганизма нуклеотидной последовательности. Реакция осуществляется при помощи термостабильной ДНК-полимеразы и комплиментарных ДНКмишени олигонуклеотидных праймеров. Образование в результате реакции фрагментов ДНК определённого размера оценивается как факт наличия в пробе клеток искомого микроба и позволяет идентифицировать исследуемую ДНК.

Визуализация результатов ПЦР достигается различными способами в зависимости от используемого формата реакции. При использовании электрофоретического разделения продуктов амплификации для обнаружения ампликонов используется окрашивание ДНК. Самый распространенный способ — окраска бромистым этидием с последующим просвечиванием геля на ультрафиолетовом трансиллюминаторе. Этот метод высокочувствителен, но бромистый этидий является мутагеном и требует осторожного обращения. Еще один подход основан на использовании флуорохромов, которые излучают свет разных цветов. Deng Shaoli, Yang Yuan (2002) провели детекцию Муcobacterium tuberculosis в образцах слизи туберкулёзных и нетуберкулёзных больных с помощью культурального метода, рутинной ПЦР и новой техники ПЦР с использованием гибридизации с Tagman флуоресцентным зондом. Было установлено, что «Tagman — техника» является высоко чувствительной, специфичной и может использоваться для диагностики туберкулёза.

Известны различные варианты гибридизационно-ферментной детекции продуктов ПЦР. После амплификации ампликоны с включенными биотинилированными праймерами вносят в лунки микропланшета с иммобилизиро-ванными одноцепочечными зондами к этим фрагментам, проводят гибридизацию и после отмывки добавляют авидин с конъюгированной пероксидазой или с фосфатазой, субстрат для фермента и выявляют окрашенный продукт с помощью фотометра.

Открытие генетических механизмов развития лекарственной устойчивости к противотуберкулёзным препаратам позволило разработать и внедрить в практику методы ПЦР, позволяющие определять вид мутаций, которые обуславливают снижение чувствительности к противотуберкулёзным препаратам (Рекомендации для национальных программ ВОЗ, 1978; Севастьянова Э. В., Ларионова Е. Е., 1999; Черноусова Л. Н., Ларионова Е. Е., Денисова Т. С. с соавт., 2000; Ларионова Е. Е., Кузьмин А. В., 2001; Тунгусова О. С., Марьяндышев А. О., 2003; Small P., van Embden J.D.A., 1994;WHO Geneva, 1998).

Использование ПЦР позволяет быстро (за 8−27 часов) выявить МТБ как при туберкулёзе органов дыхания, так и при внелёгочных формах (туберкулёзный менингит, туберкулёз кожи, кишечника и др.), в том числе у больных СПИДом. При высокой чувствительности метода (10−1000 клеток в пробе) имеется возможность выявлять штаммы M. tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью. Методом ПЦР можно также контролировать эффективность лечения больных туберкулёзом. При использовании нескольких образцов исследуемого материала от каждого пациента специфичность ПЦР достигает — 99,8−100% при высокой чувствительности (Воробьёв А. А., Кривошеин Ю. С., Широбоков В. П., 2003). Быстрота выполнения, возможность прямой детекции атипичных и некультивируемых форм микробов, высокая чувствительность метода указывают на перспективность ПЦР для детекции различных микроорганизмов (Куличенко А. Н. с соавт., 1996; Гинзбург А. Л., 1998; Вишневская Е. Б. с соавт., 2001; Самсонова С. А. с соавт. 2002; Ruiz-Bravo A., JimemezValera M.,, 1996; Burt F.J. et al, 1998; Eremenko E.I. et al., 1999; Tcherneva E. et al., 2000; Bricker B.J. et al., 2000). Генетические методы позволили повысить оперативность и информативность исследова-ний (Бударина Н.А. с соавт., 2002; Drosten C., Gottig S., Schilling S. et al. 2002). W. Tan, N. Xia, Y. Cong (1998) для выявления низкой концентрации патогена разработали гнездовую ПЦР в одной пробирке, тем самым, исключая контаминацию исследуемой пробы.

И. В. Раковская с соавт. (2002) использовали оригинальную схему ПЦР-анализа, которая даёт возможность обнаружить персистирующие микоплазмозы, не выявляемые рутинными методами, что весьма актуально для эффективной диагностики хронических форм инфекции.

Чувствительность ПЦР составляет величину порядка 100−1000 м.к./мл. (Куличенко А.Н., Попов Ю. А., Наумов А. В., 1995) и имеет преимущества над другими реакциями (Кулаков Ю. К. с соавт, 1992), но стоимость этого анализа пробы на порядок выше, чем при применении серологических методов, что существенно при проведении массовых анализов, в том числе мониторинговых. Недостатками ПЦР, кроме дорогостоящего оборудования и реагентов, являются ложноположительные результаты, выявляемые при обнаружении некоторых микобактерий из-за содержащихся в пробах веществ, ингибирующих реакции и обуславливающих ложные результаты (Ford E.G., Snead S.J., Todd J., 1993; Butler W.R., O’Connor S.P., Yakrus M.A. et al., 1994; Somoskоvi A., Hotaling J.E., Fitzgerrald M., 2000). Хотя определение последовательности ДНК микроорганизмоводин из самых точных молекулярных методов, но он очень трудоёмок для клинических лабораторий.

Применение магноиммуносорбентов на предварительном этапе подготовки проб к проведению ПЦР позволило осуществить концентрирование антигена в пробах с низкой концентрацией микробов, очистить пробы от посторонней микрофлоры и других агентов, мешающих постановке ПЦР, использовать метод кипячения для выделения ДНК, исключив метод лизиса бактерий гуанидинтиоцианатом с нуклеосорбцией, одновременно достигая стерилизации исследуемого материала, что упрощает анализ и сокращает время обнаружения возбудителя (Жилченко Е.Б., ЕфременкоВ.И., 2002).

Изучение возможности создания оптимального алгоритма для диагностики туберкулёза по методу вегетативного резонансного теста (ВРТ) «ИМЕДИС-ТЕСТ» с использованием аппарата «МИНИ-ЭКСПЕРТ-ПК» и специально разработанных кассет для тестирования в экспериментальной работе, в клинической и практической медицине представлено в работе П. Ф. Шешукова, Ю. В. Готовского (2002). Метод основан на записи нозодов в потенциях D3-D200 лиофилизированных штаммов микобактерий туберкулёза и 12 основных антибактериальных препаратов, применяемых в фтизиатрии. Из 107 обследованных методом ВРТ у 90 были выявлены типичные и у 17 пациентов атипичные микобактерии, а также проведено определение поражённых органов, стадии процесса, устойчивости МБТ к антибактериальным препаратам. В работе П. Ф. Шешукова, Ю. В. Готовского (2002) представлена сравнительная характеристика различных методов диагностики туберкулёза по чувствительности, специфичности, времени детекции и установлено, что ВРТ превосходит остальные методы по всем показателям.

Для обнаружения возбудителей различных инфекционных заболеваний широко применяются методы с использованием антител (антигенов), меченных ферментами — иммуноферментный анализ (ИФА), принципы и особенности которого описаны во многих работах: (Нго Т. Т., Ленхофф Г. М, 1988; Яковлев А. Т., 1992; Подоляко М. П. с соавт., 1995; Engvall E., Perlmann P., 1971; Van Weemen B.K., Schuurs A.N., 1972; Guesdon J.L., Avrameas S., 1981; Sting R., Ortmann G., 2000 и т. д.).

Метод ИФА заключается в том, что на нерастворимую основу иммобилизуют антитела (антигены), вносят испытуемый материал, и образовавшийся комплекс антиген-антитело выявляют с помощью конъюгата антител (антигена) с ферментом, активность которого регистрируют по изменению цвета субстрата фотометрически (Гаврилова Е.М., Дзантиев Б. В., Егоров А. М., 1980; Ficapal A. et al., 1995).

Ферментами — маркерами, используемыми в ИФА, могут быть щелочная фосфатаза, галактозидаза, глюкооксидаза, глюкоамилаза, пенициллиназа, но чаще применяют пероксидазу (Harding N., 1982).

Для приготовления иммуноферментных коньюгатов обычно используют перйодатный, глутаральдегидный методы (Умнова Н.С. с соавт., 1986; Nakane P.K., Kawaoi A., 1974; O’Sullivan M.J., Marks V., 1981), иногда применяют малеимидный метод (Kato K. et al., 1975; Weston P.D., Devries G.A., Wriggleworth R., 1980), но наиболее перспективным считается перйодатный метод конъюгации иммуноглобулина с ферментом (Anaokar S., Garry P.J., Standefer J.C., 1979).

Чувствительность и специфичность ИФА обусловлена не только степенью чистоты и активности используемых ингредиентов, но и свойствами твёрдой фазы, которая должна сохранять иммунохимические свойства и стабильность фиксированных веществ, обладать минимальной способностью неспецифически связывать компоненты анализируемой системы и быть удобной при разделении фаз (Щедрин В.И., Сбойчинов В. Б., Волков В. И, 1994; Дмитриев Г. А., Киселёва Т. А., 1997). В качестве твердой фазы используется поливинил, дакрил и другие синтетические полимеры, из которых изготавливают пробирки (Bushway R.J. et al., 1992) и микропланшеты из оптически прозрачного полистирола (Voller A. еt al., 1976). Микропланшеты обладают не одинаковыми сорбционными свойствами, что существенно влияет на достоверность и воспроизводимость полученных результатов (Сухоруков А.М., Пономарёва А. М., 1987; Шаханина К. Л., Соколенко А. А., Павлова И. П., 1987). Количество антител (антигенов), используемое для образования иммунного комплекса, ограничено возможностями твёрдой фазы (Ометов В. К. с соавт., 1997). Недостаточная концентрация антител (антигенов) ограничивает чувствительность ИФА. Качество адсорбции фиксируемых на твёрдой фазе веществ зависит от температуры, рН, ионной силы, времени инкубации. Процесс сорбции обратим и, следовательно, сенсибилизированные планшеты, полученные сорбционным путём, не подлежат длительному хранению (срок хранения 20 дней на холоде при герметизации) (Калинина О. А., Емельянова И. В., Локтионова М. А., 1997).

Е. В. Гучетль, Л. П. Пономарёва (2002) представили опыт определения противотуберкулёзных антител у больных урогинекологического отделения в иммуноферментном анализе и показали, что применение указанного теста в комплексе с клинико-лабораторным обследованием больных позволяет с высокой степенью достоверности диагностировать туберкулёз гениталий у женщин (88,5%).

Известно применение магнитных частиц (Ефременко В.И., Климова И. М., Трофимов Е. Н., 1989; Тюменцева И. С., 1996), магнитных бус (Camargo Z., Guesdon J.L., Drouhet E., 1984.) в качестве твёрдой фазы при постановке различных иммунобиологических реакций.

В ряде работ (Климова И.М. с соавт., 1986; Ефременко В. И., Тюменцева И. С., 1995; Ефременко В. И. с соавт., 1996; Жарникова И. В., 2005) представлены данные об использовании магнитных сорбентов (МС) в тест-системе ИФА. Установлены оптимальные параметры анализа: зависимость адсорбирующей способности МС от его содержания в пробе, динамика адсорбции антигена при инкубации его с твёрдофазным носителем. Результаты исследований показали, что чувствительность метода в случае обнаружения бактериальных клеток составляла 10 -10 м.к./мл.

Известны работы О. В. Борисенко с соавт. (2001) по разработке и применению магнитоуправляемых диагностикумов в иммуноферментном анализе при выявлении возбудителя туберкулёза. Данные разработки актуальны, но имеют недостатки, связанные с использованием в качестве лигандов неадсорбированных сывороток, что приводит к неспецифической реакции.

Таким образом, ИФА является экспрессным, чувствительным, перспективным методом для диагностики возбудителей инфекционных заболеваний. Учитывая недостатки ИФА, необходимо вести поиск новых методов сохранения активности сорбированных лигандов и инертных носителей, на поверхности которых протекают все процессы реакции ИФА.

Анализ достоинств и недостатков методов экспресс-диагностики позволил приступить к разработке эффективных диагностических препаратов, выявляющих возбудителя туберкулёза у больных и в объектах внешней среды, обладающих надёжностью, информативностью при высокой их специфической активности.