Использование генетических и кариопатологических маркеров для оценки риска развития антракоза у шахтеров

Ильинских Н.Н., Чурляев Ю. А.,.

Редкокаша Л.Ю., Махалин А. В.,.

Ильинских Е.Н., Романова М. С.,.

Семенов А.Г., Ильинских И.Н.

В последнее десятилетие наблюдается существенное увеличение заболеваемости шахтеров антракозом (Г.А. Бондаренко). Антракоз обусловлен вдыханием угольной пыли. Встречается у рабочих угольных шахт, углеобогатительных фабрик, коксохимических заводов. Заболевание развивается медленно. Первые признаки его обнаруживаются у лиц, имеющих не менее чем 10−20-летний стаж работы. Рентгенологическая картина зависит от стадии заболевания. При антракозе I стадии на рентгенограмме определяется мелкосетчатый легочный рисунок, на фоне которого в нижних и средних отделах легких видны очажковые тени диаметром от 1 до 5 мм. При антракозе II стадии число очажковых теней значительно возрастает. При III стадии антракоза на рентгенограммах выявляются массивные (величиной 5-Ю см) тени неправильной формы, с четкими контурами, локализующиеся в средних и верхних отделах одного или обоих легких. Вокруг этих крупных теней обычно разбросаны мелкие очажки. Иногда на томограммах выявляются антракотические каверны. Эта патология одна из основных, приводящих к инвалидизации и резкому снижением продолжительности жизни у шахтеров. В то же время поражение антракозом среди этой категории рабочих не тотально, что свидетельствует о наличии генетической предрасположенности к этому заболеванию. Поскольку практически отсутствуют средства эффективной профилактики этого заболевания, то возникает настоятельная необходимость поиска четких генетических маркеров позволяющих проводить отбор резистентных к развитию антракоза лиц, кандидатов для работы в шахтах и разрезах. По одной из гипотез (G.F. Isaiman et al., 2004) возникновение антракоза связано с тем, что в угольной пыли находятся тяжелые металлы, в том числе и радиоактивные, которые при попадании в легкие индуцируют в клетках легких мутационные изменения, вызывая перерождение окружающих тканей, что, в конечном итоге, приводит к развитию аутоиммунных реакций и усугублению патологического процесса.

Цель настоящей работы — поиск генетических и цитогенетических маркеров, позволяющих проводить отбор генетически резистентных лиц к развитию антракоза среди шахтеров юга Кузбасса.

Материал и методы. Цитологически определена чувствительность Т-лимфоцитов шахтеров больных антракозом к водным вытяжкам из образцов угля, контролем служили Т-лимфоциты шахтеров не страдающих этим заболеванием.

Эксперименты проведены в условиях in vitro на культурах Т-лимфоцитов, полученных от 36 шахтеров, со стажем работы в шахтах 15−25 лет, при этом 18 из них страдали антракозом, а 18 шахтеров этого заболевания не имели. Забор крови и его культивирование не отличались от общепринятой методики (Moorhead et al., 1961). Через сутки после начала культивирования в культуры лимфоцитов добавляли по 0,1 мл на 1 мл культуры вытяжки из образцов угля, полученных с шахты «Распадская». Фиксирование культуры на хромосомный анализ проводили через 2 суток после введения в культуральные флаконы анализируемых вытяжек. Для получения вытяжек уголь дробили ультразвуковым аппаратом «Saks-mobil» до частиц размером 10 микрон. Навеска пылеобразного угля (100 мг) заливалась физиологическим раствором. Через 1 сутки отстой пропускали через бактериальный фильтр и подвергали автоклавированию. Вытяжку добавляли к культуре из расчета 0,1 мл на 1 мл культуральной среды. В культурах определено определение числа клеток с патологическими изменениями ядра Т-лимфоцитов. При анализе хромсом учитывали как изменения в числе хромосом, так и структурные нарушения хромосом. В каждом случае анализировали не менее 100 клеток.

Поиск наличия генетических маркеров проведен при обследовании 126 шахтеров, работающих на шахте «Распадская» г. Междуреченска Кемеровской области.

В настоящем исследовании, при формировании группы для обследования учитывались следующие характеристики: стаж работы на конкретном предприятии, состояние здоровья, пол, место рождения и национальная принадлежность рабочих Учитывая, что этническая компонента может оказывать влияние на особенность распределения генетических признаков, в группу рабочих, отобранных для исследования, включали только русских. Вид профессиональной деятельности, стаж работы и национальную принадлежность устанавливался при помощи генеалогических карт.

Для изучения структуры и спектра общей заболеваемости использовались данные устного опроса, амбулаторные карты и больничные листы. Диагностику антракоза у шахтеров осуществляли врачи-профпатологи г. Междуреченска.

Для реализации цели исследования были сформированы две группы:

• · Группа «Больные «, в которую вошли рабочие с установленным диагнозом антракоз I и II степени.
• · Группа «Сравнение» — сформированная из рабочих, со стажем работы в шахтах 10 и более лет, в анамнезе которых отсутствовал антракоз или силикоз и заболевания сопутствующего симптомокомплекса — пневмокониоз.

Эритроцитарные антигены определяли серологическими методами с помощью стандартных изогемагглютинирующих сывороток и цоликлонов. Группы крови АВО и MN определяли методом агглютинации на плоскости, систему Rhesus — в пробирках без подогрева, антигены P1 и Lewis — в иммунологических планшетах (Томилин В.В., Гладких А. С., 1981). Определение групповой принадлежности проводили непосредственно в день забора образцов крови. антракоз шахтер генетический резистентность Лейкоцитарные антигены системы HLA (I класса) типировали методом комплементзависимой цитотоксичности (Terasaki P., McClelland I., 1964). Результаты реакции оценивали по «исключению красителя», который не окрашивает живые клетки, но проникает в цитоплазму погибших лимфоцитов. Учет результатов типирования проводили по системе «четырех крестов». Панель для типирования была представлена АО «Гисанс» (г. Санкт-Петербург). Типирование на антигенный состав проводили в день обследования через 1−2 часа после забора крови.

Типирование сывороточных протеинов осуществляли методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле с последующим гистохимическим окрашиванием электрофореграмм по методу H. Harris и соавт. (1976).

Гаптоглобин Hp и группоспецифический компонент Gc разделяли в 7.5% полиакриламидном геле, в трис-ЭДТА-боратной системе, рН — 8.6 [Peackok et. al. 1965] с модификациями. Состав электродного и гелевого буфера: трис-0.115 М; Н 3ВО 4−0.12 М; ЭДТА-0.005.

Вертикальный электрофорэз проводили в камерах системы Трувеллера и Нефедова (1974). Гаптоглобин выявлялся бензидиновой пробой, для определения группоспецифического компонента применялся краситель бриллиантовый синий Coomasee R-250.

Математическая обработка первичных данных проводилась с использованием статистического пакета программ Statistica for Windows 5.5,.

Результаты исследования. В культуры лимфоцитов периферической крови, полученные от шахтеров вводили вытяжки из угля и затем культуры фиксировали через 48 часов.

В культурах клеток полученных от больных в отличие от культур полученных от здоровых доноров при введении вытяжек из угля отмечено появление значительного числа самых разнообразных кариопатологических изменений в Т-лимфоцитах.

Показано, что вытяжка вызывает появление бинуклеаров. Показано, что вытяжка из угольной пыли индуцирует в культуре Т-лимфоцитов шахтеров больных антракозом патологические митозы и влияет на митотическую активность клеток культуры ткани. Анализ митотического режима культуры лимфоцитов проведен через 24, 48 и 72 ч после заражения. Полученные данные сравнивали с интактным уровнем. Из всех обнаруженных патологий митоза наиболее часто встречались метафазы с отставаниями отдельных хромосом. Достоверно чаще, чем в контроле, наблюдались анафазы с мостами и слипанием хромосом. Митотическая активность в зараженных культурах в начале (24 часа) растет, а через 72 часа резко падает (P<0,01).

Таблица 1. Частота патологических митозов в культуре Т-лимфоцитов крови, полученной от шахтеров, не страдающих и страдающих антракозом, после введения в культуры вытяжек из угольной пыли (в %).

Примечание: Звездочками отмечены значения достоверно отличающиеся от контроля; одной при P<0,01, двумя при P<0,05.

Анализ хромосомного набора в культурах лимфоцитов, полученных из крови больных антракозом, свидетельствует о существенных изменениях как в структуре, так и в числе хромосом.

Наибольшие изменения в хромосомном наборе отмечены через 72 часа после введения вытяжек из угля.

Введение

вытяжек из угля вызывало кратковременное появление клеток с пульверизованными хромосомами (1,1±0,2%) при отсутствии таких изменений в контроле. Среди хромосомных аберраций наиболее часто наблюдались хроматидные (4,0±0,3% при 1,2±0,2% в контроле; Р<0,01) и хромосомные разрывы (0,7±0,2% при 0,2±0,1% в контроле; Р<0,01), а также пробелы хромосом (1,3±0,2% при 0,4±0,1% в контроле; Р<0,01). Увеличения числа клеток с транслокационными перестройками хромосом не отмечено.

Введение

вытяжек в культуры лейкоцитов вызывало возрастание числа анеуплоидных клеток: как гипоплоидных (5,8±0,4% при 2,0±0,2% в контроле; Р<0,01), так и гиперплоидных (0,7±0,2% при 0,2±0,1% в контроле; Р0,05). Сопоставление величин поражений хромосом и групп хромосом с той долей, которую каждая из хромосом или групп хромосом занимает в общей длине хромосомного набора показывает, что распределение нарушений по длине хромосом имело неслучайный характер. Чаще чем ожидалось поражались хромосомы 1,2,6,9,10,11 и 12. В хромосомах 14−20 наблюдались единичные аберрации, а в 14, 21,22 и Y ни одного случая поражения хромосомы не зарегистрировано.

Таблица 2. Частота цитогенетически измененных клеток в культуре Т-лимфоцитов крови, полученной от шахтеров, не страдающих и страдающих антракозом, после введения в культуры вытяжек из угольной пыли.

Примечание:Достоверные отличия от контроля отмечены звездочками: одной при Р<0,01; двумя — при Р<0,05.

Данные, иллюстрирующие фенотипические частоты эритроцитарных антигенов у больных антракозом свидетельствуют, что по системе АВО в группе «Больные «число лиц — носителей группы крови О (I) было выше, чем в группе «Сравнение». Расчет показателя относительного риска развития заболевания RR, а также показателей EF и PF, характеризующих выраженность данной ассоциации, выявил положительную ассоциативную связь между маркером — фенотип О (I) и патологией, что говорит о предрасположенности обладателей этой группы крови к возникновению антракоза в провоцирующих условиях среды. Так же показано, что обладатели группы крови, А (II), по всей видимости, имеют большую устойчивость к развитию антракоза, так как частота носителей данного фенотипа была болеечем на 9% выше среди рабочих группы «Сравнение», чем среди больных.

В отношении фенотипов системы Rh прослеживается слабо выраженная направленность в сторону снижения частоты встречаемости фенотипа Rh (D+) у шахтеров группы сравнения. Рассчитанное значение RR для Rh (D+) превышает 1, что свидетельствует о наличии положительной ассоциации этого показателя с антракозом, а при фенотипе Rh (D-) напротив, меньше единицы (0.66), т. е. риск развития заболевания снижен. Таким образом, в качестве «неблагоприятного» по риску развития агнтракоза может, вероятно, выступать антиген Rh (D).

Так же была проведена оценка связи антракоза с фенотипами Р и Lewis. При этом, фенотипы систем Р (Р 1-) и Lewis (Le а+в-) чаще встречаются в группе «Больные», полученные различия статистически не достоверны. Относительный риск развития антракоза для людей с фенотипом Р 1- составил (RR=1.03), Le а+в- (RR=1.69), по сравнению с относительным риском меньше 1 (RR<1) у фенотипов Р 1, Le а-в+, Le а-в-. Таким образом, проведенный анализ позволяет включить присутствие антигенов Р (Р 1-) и Lewis (Le а+в-) в группу факторов, повышающих риск развития антракоза, в неблагоприятных производственных условиях.

Статистически значимые различия в частоте носителей эритроцитарных антигенов выявлены только в отношении аллоантигенов системы MN. Сравнительный анализ показал статистически значимое снижение концентрации носителей фенотипа MM (p<0.05) в группе «Больные «по сравнению с рабочими контрольной группы. В отношении частоты встречаемости фенотипа MN отмечен противоположный процесс, заключающийся в повышенной частоте этого признака у больных и соответственно сниженной — в группе «Сравнение». Эти различия также носили статистически значимый характер (p<0.05). Значения, характеризующие частоты фенотипа NN в анализируемых группах, были практически одинаковы.

Кроме того, был произведен расчет и сравнительный анализ аллельных частот эритроцитарных антигенных систем крови в группах шахтеров. Аллельные частоты в целом отражают различия, отмеченные при сравнении фенотипических частот среди шахтеров, страдающих антракозом и практически здоровых рабочих.

Так среди больных выше концентрация носителей аллелей p и r, кодирующих антигены системы АВО, аллеля p — системы Rhesus, аллеля n — системы MN по сравнению с группой «Сравнение». Аллельные частоты генов, кодирующих антигены системы Р, в сравниваемых группах были практически идентичными.

Исследование групп крови по системам АВО, Rh (D), P, Lewis показало наличие незначительных различий между больными антракозом и группой «сравнение» .

Таким образом, генетическим маркером, обладающим информативной ценностью для оценки подверженности или резистентности организма человека к действию угольной пыли, из проанализированных эритроцитарных изоантигенных систем крови, является система MN. Проведенное сравнение позволяет отнести фенотип MM к маркерам превентивной фракции, а MN — этиологической.

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о значимой роли эритроцитарных изоантигеных систем, в частности генетической системы MN, в предрасположенности к антракозу. Установлено, что при одинаковых условиях относительный риск возникновения антракоза имели носители фенотипа MN, который составил 1.63, по сравнению с относительным риском 0.567 у носителей фенотипа MM, это может свидетельствовать о резистентности носителей данного фенотипа к возникновению антракоза. Напротив, принадлежность к фенотипу MN (RR=1.61) свидетельствует о повышенной чувствительности к виздействию угольной пыли. При рассмотрении группы больных антракозом и здоровых рабочих: по системам ABO, Rh, P, Le статистически достоверных различий в распределении маркеров не получено. Наиболее высокие значения RR определены для фенотипов О (I), В (III), Rh (D+), MN, NN, Le a+b-, а значение EF выше всего для антигена Rh (D-). Величины PF, оценивающие защитную роль антигена, максимальны для фенотипов; Rh (D-), MM, Le a-b-, Le a-b+.

Гипотеза об адаптивной роли полиморфных систем генов, кодирующих протеины сыворотки крови, была высказана в середине 20 века на основании анализа генных частот среди народов мира.

Существуют многочисленные данные о корреляции фенотипов Hp с различного рода заболеваниями. Обнаруживаемые ассоциации генотипов Hp с болезнями, как правило, проявляются в увеличении числа гомозигот Hp2−2. Это относится к таким формам, как ревматоидный артрит, остеохондроз, анкилозирующий спондилит, ревматизм, бронхиальная астма. Известно, что частота Hp1−1 возрастает в группах больных асбестозом, пневмонией и хроническим лимфолейком (Филипов И.К., Анненков Т. А., 1973; Мозалевский А. Ф., 1978; Афанасьева И. С., Спицин А. В. и др., 1993; Иванова Л. А., Безрукавникова Л. М., 1995).

Имеются данные о корреляции фенотипов Gc с различными заболеваниями, такими, как ХНЗЛ, обструктивной болезнью легких и другими (Спицин В.А., Титенко Н. В., 1988; Шабалин В. И., Серова А. Д., 1988; Horne S., Cockcroff D., 1986) Так, Papcha S.S., Pal B. отмечают у пациентов с ревматоидным артритом избыток индивидов с фенотипом Gc 2−2 по сравнению с контрольной группой (Papcha S.S., Pal B., 1985).

В настоящем исследовании были изучены особенности распределения частот фенотипов и аллелей сывороточных белков гаптоглобина (Нр) и группоспецифического компонента (Gc) в двух группах рабочих, подвергающихся в результате своей профессиональной деятельности, воздействию угольной пыли. Сравнительный анализ фенотипических частот системы гаптоглобина в группах рабочих показал, что среди больных антракозом несколько выше частота носителей фенотипа Нр 2−2. У рабочих группы «Сравнение» чаще регистрировался гомозиготный вариант фенотипа Нр 1−1 по сравнению с группой «Больных». Выявленные различия статистически не достоверны.

Частоты аллелей также свидетельствуют о повышенной концентрации носителей гена Hp2 в группе больных рабочих и аллеля Hp1 в группе практически здоровых рабочих.

Гаптоглобин (Нр) обладает способностью прочно и специфически связывать свободный гемоглобин. Эта реакция способствует поддержанию баланса железа в организме. Известно, что способность связывать гемоглобин убывает в ряду: Нр 1−1, Нр 2−1, Нр 2−2 [Харрис Г., 1973].

Можно предположить, что у носителей фенотипа Нр 2−2 функция повторной утилизации железа выражена более слабо по сравнению с носителями альтернативных фенотипов.

Антракоз сопровождается тканевой гипоксией, связанной с нарушением транспорта и утилизации кислорода. Дефицит железа может выступать одним из ведущих факторов развития тканевой гипоксии, которая всегда проявляется приантракозе. Таким образом, несмотря на то, что выявленные различия в частоте носителей Нр в группах не были статистически не значимы, можно предположить, что носительство гена Нр 2 будет определять повышенную подверженность организма человека развитию антракоза.

В отношении частоты встречаемости белков системы Gc выявлены статистически значимые различия между группами. Так, фенотип Gc 2−2 достоверно чаще (p<0.005) встречается в группе больных антракозом. В группе «Сравнение» отмечено незначительное увеличение частоты встречаемости фенотипов Gc 1−1 и Gc 2−1 по сравнению с группой «Больных». Частоты аллелей в целом отражают процессы, отмеченные при анализе фенотипических частот, но вскрывают более глубокие закономерности.

Общеизвестно, что физиологическая роль группоспецифического компонента (Gc) заключается в связывании и переносе витамина D (фракции D3 и 25-ОН-D3) (Прокоп О.В. и др., 1991). Установлена зависимость способности связывания витамина D3 от фенотипа Gc. Активность в связывании витамина падает в ряду Gc 1−1, Gc 2−1, Gc 2−2 (Reinskou T., 1968; Kueppers F. et al., 1979). Одним из неблагоприятных эффектов воздействия угольной пыли является снижение содержания кальция (Са) в сыворотке крови, что влияет на выраженность изменения в костной ткани. Повышенная способность к связыванию и транспорту витамина D у индивидов с фенотипом Gc 1−1, вероятно, обеспечивает более стабильное поддержание баланса кальция в организме человека. Витамин D функционально относится к гормонам, регулирующим обмен Са 2+ и фосфатов (Мусил Я., 1985). Через кальцитонин витамин D участвует в регуляции уровня кальция в организме (Мусил Л. 1990).

Таким образом, анализ характера распределения фенотипических и аллельных частот сывороточных протеинов систем Нр и Gc в группах обследованных рабочих виброопасных профессий позволяет в качестве факторов повышающих риск развития антракоза, считать носительство фенотипа Gc 2−2, рассчитанное значение относительного риска развития заболевания (RR) для которого составило 2.40.